Name: איסוף וזיהוי הלמינתס מחיות בר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-14T20:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: למדו פרוטוקול לאיסוף וזיהוי הלמינת'ס מחיות בר באמצעות נקרופסיה, חילוץ ממערכות שונות, שימור באתנול או פורמלין, וזיהוי מורפולוגי בטכניקות צביעה ושקיפות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר ג'ו נ. קאודל, ביולוג מחלות בתוכנית שירותי חיות הבר של אינדיאנה USDA APHIS באוניברסיטת פרדו, על שסיפק דגימות ששימשו לאיסוף הלמינת'ס להפקת הסרטון הזה. ג'ניפר סראפין הכינה את כל התמיסות הכימיות.

בעלי חיים ששימשו בניסויים הבאים נמצאו מתים כהרוגים בדרכים.
1. נתיחת בעלי חיים וסינון איברים עיקריים לאוסף הלמינת'ס
<ol>
	<li>מקם את החיה על משטח ישר ובדוק את כל הפתחים החיצוניים כולל אוזניים, חלל הפה והעיניים עם זכוכית מגדלת לנוכחות נמטודות (עגולות) וטרמטודות (שטוחות ולא מקוטעות) (ראה איור 1).</li>
	<li>אם עובדים עם ציפורים, יש לשטוף במי ברז כדי להרטיב את הנוצות לפני הניתוח.</li>
	<li>בעזרת להב חד או סכין ובעזרת זוג מלקחיים מנתחים, בצע חתך מעל חלל הבטן והקפיד לא לקרוע איברים כלשהם. עבור צבים עם שרוול קשה, השתמש במסור ידני כדי לחתוך את העצם באזור הגשר בין חזה החזה לבטן.</li>
	<li>פתח את חלל בית החזה כאמור לעיל; עבור בעלי חיים גדולים ייתכן שיהיה צורך בחותכי עצמות או במסור ידני קטן כדי לחתוך את הצלעות.</li>
	<li>אם אתה עובד עם ציפורים, בדוק את שקי האוויר באתרם לפני הסרת איברים כלשהם. השתמש בזכוכית מגדלת במידת הצורך.</li>
	<li>בדוק את שני החללים עבור תולעים עגולות פילריות וטרמטודות גדולות.</li>
	<li>לפני הוצאת מערכת העיכול מחלל הבטן, קשרו חוט קרוב לתחילת הוושט ועוד אחד בקצה המעי הגס (פי הטבעת).</li>
	<li>הפרד את איברי בית החזה הבאים לצלחות פטרי (או מגשי זכוכית אם האיברים גדולים מדי) לבדיקה במיקרוסקופ סטריאו (10-30X): לב וכלי דם עיקריים, קנה הנשימה והריאות.</li>
	<li>הסר את הכבד, כיס המרה והצינורית, הלבלב, הטחול, הכליות ושלפוחית השתן ובדוק כמתואר בשלב 1.8.</li>
	<li>יש להסיר את מערכת העיכול המלאה ולהניח כל חלק בכלי זכוכית/מגשים.</li>
	<li>לאחר הסרת האיברים, יש לשטוף את חלל הגוף עם צינור או בקבוק שפריץ מלא במי מלח 0.9% לתוך מסננת רשת של 106 מיקרומטר ולבחון את תכולת המסננת במיקרוסקופ סטריאו לנוכחות תולעים פילריות או טרמטודות דם.</li>
	<li>פתחו כל קטע בדרכי העיכול במספריים, גרדו את הרירית ובדקו היטב אם יש טפילים גדולים (>1 ס"מ). השתמש בזכוכית מגדלת במידת הצורך. החרטום של אקנתוצפלנים מוטבע לעתים קרובות עמוק בדופן המעי וייתכן שיהיה צורך להקניט אותו בזהירות מהרקמה בעזרת מלקחיים ו/או מספריים קטנים.</li>
	<li>הניחו כל חלק פתוח מתחת למים זורמים ושטפו את כל התכולה למסננת של 106 מיקרומטר כמתואר בשלב 1.11.</li>
	<li>פתח את הלב וכלי הדם העיקריים (ריאות ואבי העורקים), קנה הנשימה והשתן וכיס המרה ובדוק את התוכן באותו אופן.</li>
	<li>חתכו והקניטו איברים מוצקים כמו ריאות, כבד, כליות, טחול ולבלב באמצעות להב חד ומלקחיים. שוטפים אותם תחת מים זורמים למסננת של 106 מיקרומטר כמתואר בשלב 1.11.</li>
	<li>רשום את סוגי הטפילים שנמצאו, את המספר של כל סוג ואת האיבר שבו הם נמצאים. שיטות קיבוע וצביעה מפורטות להלן.</li>
	<li>סמן בקבוקונים/צנצנות על ידי הנחת חתיכה קטנה של כרטיס אינדקס רגיל הכתוב בעיפרון (דיו וכרטיסי אינדקס "ירוצו" בדגימות אלכוהול וכתמים).</li>
</ol>
2. שימור הלמינת'ס
<ol>
	<li>עבור הלמינת'ס שצריך לשמר למחקרים גנטיים מאוחרים יותר, מקם אותם ישירות לתוך 80-90% אתנול (ללא גליצרין). יש לייצר את האתנול על ידי דילול 95% אתנול, רצוי בדרגת ריאגנט (טבלה 1). לעולם אל תאפשר לדגימות אלה להיחשף לפורמלין, מכיוון שפורמלין מפרק את ה-DNA למצב בלתי שמיש.</li>
	<li>הניחו טרמטודות חיות על שקופית מיקרוסקופ זכוכית בטיפת מלח, הניחו תלוש כיסוי זכוכית והעבירו את המגלשה מעל להבה מבלי להרתיח את מי המלח.
	<ol>
		<li>זרוק את השקופית לצלחת פטרי המכילה AFA (אלכוהול-פורמלין-חומצה אצטית, ראה טבלה 1) ותן לכיסוי להחליק לצוף.</li>
		<li>מקבעים ב-AFA למשך יום עד מספר ימים, שוטפים במי ברז ומעבירים לבקבוקוני זכוכית של 5 מ"ל (או בקבוקון/צנצנת זכוכית גדולים יותר בהתאם לגודל וכמות הטפילים) מלאים באתנול 70% לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>תקן טרמטודות מתות ב-AFA או 10% פורמלין חוצץ למשך 48 שעות ולאחר מכן העביר לבקבוקון/צנצנת מלאה ב-70% אתנול לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>הרפו צסטודות חיות בצלחת פטרי על ידי שפיכת מים כמעט רותחים עליהן ולאחר מכן העבירו לבקבוקון/צנצנת מלאה ב-70% אתנול לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>הרגיעו אקנתוצפלנים חיים על ידי הנחתם בצלחת פטרי למשך שעה עד מספר שעות במי ברז במקרר (~4 מעלות צלזיוס) עד שהחוטם יוצא לגמרי החוצה (זה עשוי להימשך עד 24 שעות). מעבירים לבקבוקון/צנצנת מלאה ב-70% אתנול או AFA לאחסון לטווח הארוך.</li>
	<li>התייחס לצסטודות מתות ואקנתוצפלנים כמו לטרמטודות מתות (ראה לעיל).</li>
	<li>הרגו נמטודות חיות קטנות (<5 מ"מ, או שבירות (למשל טריכוסטרונגילידים, נימים) באתנול חם (כמעט רותח) 70% ושמרו בבקבוקון/צנצנת מלאה ב-70% אתנול עם תוספת של 5% גליצרין (טבלה 1) כדי לשמר את התולעים במקרה של אידוי.</li>
	<li>הרגו (ושקו) נמטודות בינוניות עד גדולות (>5 מ"מ) (למשל אסקרידים, ספירורידים, אוקסיורידים, פילארידים) על ידי הנחתם בצלחת פטרי עם חומצה אצטית קרחונית קרה (טבלה 1) ולאחר 15 דקות העברה לבקבוקון/צנצנת מלאה ב-70% אתנול ו-5% גליצרין. ניתן להשתמש בחומצה האצטית שוב ושוב בדרך זו.</li>
	<li>יש להניח נמטודות מתות ישירות בבקבוקון/צנצנת מלאה ב-70% אתנול ו-5% גליצרין.</li>
</ol>
3. זיהוי טקסונומי של הלמינת'ס
<ol>
	<li>הכן את ההמטוקסילין של האריס על ידי המסת המטוקסילין באלכוהול ועל ידי המסת אמוניום אלומיניום גופרתי במים עם חום. מערבבים את שתי התמיסות ומביאים לרתיחה.
	<ol>
		<li>מוסיפים נתרן יוד ומרתיחים במשך 2-3 דקות. מסננים (נייר סינון 541) תמיסה לאחר שהיא חוזרת לטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מכתים יתר על המידה טרמטודות, צסטודות ואקנתוצפלנים על ידי השארתם בהמטוקסילין של האריס או קרמין סמיצ'ון מדולל (1:10) למשך הלילה (ראה טבלה 1).
	<ol>
		<li>הסרת צבע באמצעות אתנול חומצי 70% עד לאיברים נראים (יכול לקחת בין מספר שניות ליותר משעה ויש להשגיח עליו מקרוב).</li>
		<li>עצור את הסרת הצביעה על ידי העברת דגימות ל-70% אתנול בסיסי למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, יבשו אותם בסדרה של אתנולים מדורגים (80%, 95%, 100%) ונקו אותם בקסילן או מתיל סליצילאט.</li>
		<li>הרכיבו דגימות על שקופית מיקרוסקופ לאחר הוספת טיפה של בלזם קנדה והחלקת כיסוי. מניחים להתייבש למשך הלילה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>נקה נמטודות קטנות עד בינוניות ואקנתוצפלנים למשך 15-30 דקות בתושבות זמניות של לקטופנול על שקופית מיקרוסקופ עם פתק כיסוי.
	<ol>
		<li>השתמשו ב-80% פנול למשך עד 60 דקות עבור נמטודות גדולות (אסקרידים וספירורידים) ואקנתוצפלנים. בדוק תחת מיקרוסקופ אור (40-400X) להערכת מבנים קטנים יותר (חריצים זכריים ווים).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>השתמש בגישות הבאות לבחינת מבנים מיוחדים.
	<ol>
		<li>עבור צסטודות, חתכו את הסקולקס והניחו על שקופית מיקרוסקופ בלקטופנול ו"דלעת" עם החלקת כיסוי למדידה וספירה של קרסים רוסטלריים (ראו איור 1B).</li>
		<li>עבור נמטודות, חתכו את הקצה הקדמי והרכיבו את הפנים על מיקרוסקופ, החליקו בכמה טיפות של לקטופנול (ללא כיסוי) או בג'לי גליצרין להרכבה קבועה (עם החלקת כיסוי) והתבוננו בחלקי הפה תחת מיקרוסקופ אור (35-400X) (ראה איור 1D).</li>
		<li>חתכו את הזנבות של נמטודות גדולות והרכיבו על שקופית מיקרוסקופ בלקטופנול עם החלקת כיסוי כדי להתבונן בפפילות הגחון ובמורפולוגיה של החריץ של זכרים תחת מיקרוסקופ אור (ראו איור 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>זיהוי טפילים למינים באמצעות שילוב של ספרות ראשונית והפניות טקסונומיות סטנדרטיות כגון:
	<ol>
		<li>טרמטודות: ימאגוטי (1958, 1971)3,4 וגיבסון ואחרים. 5-7</li>
		<li>Acanthocephalans: Yamaguti8</li>
		<li>צסטודות: ימאגוטי9, שמידט10 וח'ליל ואחרים. 11</li>
		<li>נמטודות: ימאגוטי12 ואנדרסון ואחרים. 13</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. מאגר הלמינת'ס באוסף הטפילים הלאומי של ארה"ב
<ol>
	<li>הפקדת דגימות הלמינת'ס מייצגות באוסף הטפילים הלאומי של ארה"ב (USNPC). זה חובה עבור רוב כתבי העת של הטפילים. לאחר ההגשה, לכל מין הלמינת'ס מוקצה מספר הצטרפות להכללה בכתבי יד.</li>
	<li>כלול את המידע הבא בעת הגשת דגימות: 1) השם המדעי של הטפיל; 2) מידע על המארח (מינים, קואורדינטות אורך/רוחב של מיקום גיאוגרפי); 3) איבר שנמצא בפונדקאי; 4) שם מי שאסף את הדגימות ותאריך האיסוף; 5) סוג אמצעי הקיבוע, הכתמים או הניקוי/הרכבה המשמשים; 6) מיקום של אוספים אחרים (מספרי מוזיאון ומספרי כניסה) אם דגימות נוספות הוגשו במקום אחר; ו-7) מידע על פרסום וכתב עת. נתונים אלה צריכים להישלח גם יחד עם הדגימות ותחת כיסוי נפרד.</li>
	<li>ארוז דגימות במיכלים חזקים עם חומר סופג עמיד בפני זעזועים. מכסי הברגה/פרפילם על בקבוקוני זכוכית והניחו כל בקבוקון בשקית ניילון נפרדת. עטפו שקופיות בנייר והניחו בקופסת שקופיות עם חומר בולם זעזועים ביניהן.</li>
	<li>דגימות ספינה ומכתב נפרד עם מידע על דגימות אל: אוסף הטפילים הלאומי של ארה"ב, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.</li>
</ol>

<ol><li>Atkinson, C. T., Thomas, N. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtkinson%2C+CT+%22Parasitic+Diseases+of+Wild+Birds%22">Parasitic Diseases of Wild Birds</a>. Hunter, D. B. , John Wiley & Sons, Blackwell Press. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Parasitic+Diseases+of+Wild+Mammals%22">Parasitic Diseases of Wild Mammals</a>. Samuel, W. M., Pybus, M. J., Kocan, A. A. , Second Edition, Iowa State University Press. Ames, Iowa, USA. (2001).</li>
<li>Yamaguti, S. Parts 1 and 2. The Digenetic Trematodes of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. I, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1958).</li>
<li>Yamaguti, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Synopsis+of+Digenetic+Trematodes+of+Vertebrates%22">Synopsis of Digenetic Trematodes of Vertebrates</a>. I and II, Keigaku Publishing Company. Tokyo, Japan. (1971).</li>
<li>Gibson, D. I., Jones, A., Bray, R. A. Keys to the Trematoda. 1, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2002).</li>
<li>Jones, A., Bray, R. A., Gibson, D. I. Keys to the Trematoda. 2, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2005).</li>
<li>Bray, R. A., Gibson, D. I., Jones, A. Keys to the Trematoda. 3, CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2008).</li>
<li>Yamaguti, S. Acanthocephala of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. V, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1963).</li>
<li>Yamaguti, S. The Cestodes of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. II, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1959).</li>
<li>D, G. Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%2C+G+%22CRC+Handbook+of+Tapeworm+Identification%22">CRC Handbook of Tapeworm Identification</a>. , CRC Press Inc. Boca Raton, Florida, USA. (1986).</li>
<li>Khalil, L. F., Jones, A., Bray, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhalil%2C+LF+%22Keys+to+the+Cestode+Parasites+of+Vertebrates%22">Keys to the Cestode Parasites of Vertebrates</a>. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (1994).</li>
<li>Yamaguti, S. The Nematodes of Vertebrates. Parts 1 and 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamaguti%2C+S+%22Systema+Helminthum%22">Systema Helminthum</a>. III, Interscience Publishers Inc. New York, New York, USA. (1961).</li>
<li>Anderson, R. C., Chabaud, A. G., Willmott, S. Keys to the Nematode Parasites of Vertebrates: Archival Volume (Nos). 1-10. , CAB International Publishing and The Natural History Museum. Wallingford, Oxfordshire, UK. (2009).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף

קשה מאוד לזהות טפילי הלמינת'ס, אפילו לסוג, על סמך חומר גרוע. צסטודים וטרמטודות, במיוחד, נוטים למות ולהידרדר די מהר לאחר מות הפונדקאי. הטקסונומיה של צסטודות תלויה מאוד במספר, בגודל ובצורת הקרסים הרוסטליים, שלעתים קרובות הולכים לאיבוד בחומר קפוא. כך גם לגבי טרמטודות מסוימות עם קוצים סביב מוצץ הפה כמו אכינוסטומים והטרופידים, שגם הם הולכים לאיבוד לעתים קרובות. בגלל הציפורניים העבות שלהם, נמטודות ואקנתוצפלנים מעט קשים יותר, אך עדיין עשויים להתכווץ או לסגיר את הפרובוסקיס. לכן, לא ניתן להדגיש יתר על המידה את החשיבות של השגת החו...

בעלי חוליות טפיליים על ידי ארבע קבוצות עיקריות של הלמינת'ס (תולעים). שתיים מהקבוצות, טרמטודות, או פלוקים, וצסטודות, או תולעי סרט, שייכות לפילום Platyhelminthes. שתי הקבוצות האחרות הן הנמטודות, או התולעים העגולות, (Nematoda) וה-acanthocephalans, או תולעים קוצניות (Acanthocephala). רבים מהטפילים הללו תועדו כגורמים לתחלואה ותמותה בעופות בר ויונקים1,2.
לרוב ההלמינת'ס יש מחזורי חיים מורכבים הכוללים יותר מפונדקאי אחד1,2. לדוגמה, לטרמטודות יש מארח ביניים אחד או שניים (בדרך כלל חסרי חוליות) ומארח אחרון. כל הפונדקאים צריכים להיות זמינים כדי שהמחזור יושלם, וכך כדי שהלמינת'ס בוגרים יהיו נוכחים במארחים הסופיים (שהם הנושא של כתב היד הזה). לכן חשוב לזכור שתנודות עונתיות יכולות להתרחש בשכיחות ובעוצמה של חלק ממיני ההלמינת'ס, וניטור ארוך טווח רצוי כדי ללכוד את ההלמינת'ס המלא של האונאה של פונדקאי מסוים.
השיטה האופטימלית לאיסוף הלמינת'ס היא לבחון מארח שעבר המתת חסד. זה מאפשר איסוף של הלמינת'ס בעודם בחיים ולהרפיה וקיבוע נאותים שלהם. חומר ממארחים שמתו יותר מ-24 שעות, או שהוקפאו והופשרו לבדיקה, הוא לעתים קרובות נחות וקשה לזיהוי. טרמטודות וצסטודות ממארחים קפואים או פורמלינים לרוב מכווצים בצורה גרועה ואיבדו מבנים חיוניים לזיהוי כמו קוצים אוראליים על טרמטודות או קרסים על עקמת של תולעי סרט. עם זאת, המציאות היא שרוב החומר הזמין ממארחי חוליות בימינו מוקפא או נשמר.
מאגרי מידע המכילים מידע על רצף DNA של הלמינת'ס גדלים במהירות ולכן זיהוי טקסונומי כבר אפשרי עבור מינים רבים. לכן, יש לשמר הלמינת'ס לניתוחי דנ"א פוטנציאליים ככל האפשר. עם זאת, DNA באיכות טובה אינו אפשרי אם הדגימות מקובעות בפורמלין. השיטות המתוארות כאן לאיסוף והרג הלמינת'ס יניבו חומר המתאים למיצוי דנ"א ולאנליזות גנטיות.
להלן אנו מתארים שיטות מפורטות כיצד לנקרופס בעלי חוליות (דו-חיים, זוחלים, ציפורים ויונקים; טרמטודות מונוגניות מדגים אינן כלולות) לאיסוף הלמינת'ס, ולאחר מכן נהלים כיצד לשמר ולעבד אותם לזיהוי טקסונומי.

<table><tbody><tr><td><חזק>מקבע</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול-פורמלין-חומצה אצטית (AFA)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A407-1 (אתנול) F75F-1GAL (פורמלדהיד) BP2401500 (חומצה אצטית קרחון)</td><td>אתנול 85% (85 מ"ל) + פורמלדהיד 37% (10 מ"ל) + חומצה אצטית קרחונית (5 מ"ל)</td></tr><tr><td>אתנול להרג ושימור לטווח ארוך</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A407-1</td><td>אתנול 100% (70 מ"ל) + מים מזוקקים (30 מ"ל)</td></tr><tr><td>אתנול לקיבוע ומחקרי DNA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0010</td><td>אתנול 80-90% (80-90 מ"ל) + מים מזוקקים (20-10 מ"ל), בהתאמה</td></tr><tr><td>פורמלין בופר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SF100-4</td><td>פורמלין 10% (10 מ"ל) + מים מזוקקים (90 מ"ל)</td>גליצרין-אלכוהול</tr> <tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A407-1 (אתנול) AC15365-1000 (גליצרין)</td><td>אתנול 70% (95 מ"ל) + גליצרין (5 מ"ל)</td></tr><tr><td><חזק>ניקוי, צביעה והרכבה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול להתייבשות במהלך צביעה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A407-1</td><td>אתנול 80%, 95%, 100% (80 מ"ל, 95 מ"ל, 100 מ"ל) + מים מזוקקים (20 מ"ל, 5 מ"ל, 0 מ"ל)</td></tr><tr><td>לקטופנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>R400-27-פנול</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A931I-1 (פנול) A407-1 (אתנול)</td><td>פנול 100% (80 מ"ל) + אתנול 100% (20 מ"ל)</td></tr><tr><td>האריס המטוקסילין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S25347 (המטוקסילין) A407-1 (אתנול) A567-500 (אמוניום אלומיניום גופרתי) S25553 (נתרן יודאט)</td><td>המטוקסילין (5 גרם) + אתנול 100% (50 מ"ל) + אמוניום אלומיניום גופרתי (100 גרם) + נתרן יודאט (0.37 גרם) + מים מזוקקים (1,000 מ"ל)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>סמיצ'ון s קרמין אצטי</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401500 (חומצה אצטית קרחון) S25236 (קרמין) A407-1 (אתנול),</td> <td>חומצה אצטית קרחונית (100 מ"ל) + קרמין (1.5 גרם) + מים מזוקקים (100 מ"ל). מחממים באמבט מים רותחים למשך 15 דקות ומצננים. סנן כדי ליצור פתרון מלאי. מערבבים 1:2 עם 70% אלכוהול לצביעה.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X4-4</td><td>השתמש רק מתחת למכסה אדים כימי.</td></tr><tr><td>מתיל סליצילאט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S25437-אתנול</td><td></td></tr> <tr><td>בסיסי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A407-1 (אתנול) S25159A (אמוניום הידרוקסיד מרוכז)</td> <td>אתנול 70% (100 מ"ל) + אמוניום הידרוקסיד (0.1 מ"ל)</td></tr><tr><td>חומצת אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A407-1 (אתנול) SA9233-100 (חומצה הידרוכלורית)</td><td>אתנול 70% (99.5 מ"ל) +&nbsp; חומצה הידרוכלורית (0.5 מ"ל)</td></tr><tr><td>בלסם קנדה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>B10-100</td><td>-</td></tr></tbody></table>

איסוף וזיהוי הלמינת'ס מחיות בר

Helminth Collection and Identification from Wildlife

חיות בר נטפלות בדרך כלל על ידי מגוון רחב של הלמינת'ס. ארבעת הסוגים העיקריים של הלמינת'ס הם "תולעים עגולות" (נמטודות), "תולעים קוצניות" (acanthocephalans), "פלוקים" (טרמטודות) ו"תולעי סרט" (צסטודות). השיטה האופטימלית לאיסוף הלמינת'ס היא לבחון מארח שמת פחות מ-4-6 שעות מאחר שרוב ההלמינת'ס עדיין בחיים. יש לבצע נתיחה יסודית ולבדוק את כל האיברים העיקריים. איברים נשטפים על מסננת של 106 מיקרומטר מתחת למים זורמים ותכולתם נבדקת תחת מיקרוסקופ סטריאו. כל ההלמינת'ס נספרים ומספר מייצג קבוע (או ב-70% אתנול, 10% פורמלין חומצי או אלכוהול-פורמלין-חומצה אצטית). לצורך זיהוי מינים, הלמינת'ס מנוקים בלקטופנול (נמטודות ואנתוצפלנים קטנים) או מוכתמים (טרמטודות, צסטודות ואקנתוצפלנים גדולים) באמצעות המטוקסילין של האריס או קרמין סמיצ'ון. הלמינת'ס מחוברים למינים על ידי בחינת מבנים שונים (למשל ספיקולים זכריים בנמטודות או הרוסטלום בצסטודות). ניתן ליישם את הפרוטוקולים המתוארים כאן על כל בעל חיים בעל חוליות. הם דורשים מומחיות מסוימת בזיהוי האיברים השונים וביכולת להבדיל בין הלמינת'ס לפסולת רקמות אחרות או לתוכן מעיים. איסוף, שימור וצביעה הן טכניקות פשוטות הדורשות ציוד וריאגנטים מינימליים. זיהוי טקסונומי, במיוחד למינים, יכול לקחת זמן רב ועשוי לדרוש הגשת דגימות למומחה או ניתוח DNA.

באמצעות השיטות שפורטו לעיל, נערך סקר של התולעי המעיים (helminths) של חולדה אפורה, Sorex cinereus, במחוז מיסולה, מונטנה, בין השנים 2007-2011. בסך הכל נאספו 56 חולדות ממלכודות בור ונבחנו בתוך 2 שעות לאחר המוות. השכיחות הכללית של ההדבקה הייתה 96%; רק 2 חולדות היו נקיות מטפילים. זוהו 15 מיני תולעי מעיים, כולל 9 מיני סרטנים (cestodes) ו-6 מיני נמטודות (nematodes). מין אחד של סרטנים מהסוג Staphylocystoides לא תואר בעבר. האיברים שנמצאו נגועים כללו את המעי הדק (9 סרטנים, 3 נמטודות), הקיבה (נמטודה אחת), הריאות (...

חיות בר בדרך כלל טפילות על ידי מגוון רחב של הלמינת'ס. ארבעת הסוגים העיקריים של הלמינת'ס הם "תולעים עגולות" (נמטודות), "תולעים קוצניות" (acanthocephalans), "פלוקים" (טרמטודות) ו"תולעי סרט" (צסטודות). כאן אנו מתארים כיצד הלמינת'ס נאספות מחיה בעלת חוליות, וכיצד הן נשמרות ומזהות טקסונומית.

Wild animals are commonly parasitized by a wide range of helminths. The four major types of helminths are &#34;roundworms&#34; (nematodes), ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף, לשמר ולזהות הלמינתים מבעלי חיים ברים. הדבר משיג תחילה על ידי ביצוע נתיחה לאחר המוות (necropsy) לבעל חיים בר. לאחר מכן, נאספים הלמינתים מאיברים שונים, ולאחר מכן הם נשמרים באמצעות מגוון טכניקות לצורך זיהוי מאוחר יותר.לבסוף, הקסדות עוברות הבהרה, צביעה והרכבה, והמינים מזוהים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות מבנים ספציפיים של הקסדות באמצעות טכניקות של הבהרה ו/או צביעה, אשר יכולות לסייע רבות בזיהוי המינים. שיטה זו ניתנת ליישום לצורך זיהוי קסדות מיונקים, ציפורים, זוחלים ודו-חיים.ניתן ליישם זאת גם על אורגניזמים אחרים כמו דגים. כדי להתחיל, הנח את בעל החיים על משטח שטוח והשתמש בזכוכית מגדלת כדי לבחון את כל הפתחים החיצוניים, כולל האוזניים, חלל הפה והעיניים, כדי לאתר נמטודות, CSEs, בהונות וטרמטודות. השתמש בלהב חד או סכין ובפינצטת דיסקציה.בצעו חתך מעל חלל הבטן תוך הקפדה שלא לפגוע באיברים הפנימיים. לאחר מכן, בעזרת קוצץ עצמות או מסור ידני קטן במידת הצורך, פתחו את חלל בית החזה. בחנו את שני החללים לאיתור fal, תולעי סרט (roundworm) וטרמטודות (trematodes) גדולות.לאחר מכן, קשרו חוט קרוב לתחילת הוושט וחוט נוסף בקצה המעי הגס לצורך בדיקה. תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, הפרידו את הלב וכלי הדם הראשיים, את הקנה ואת הריאות לצלחוני פטרי נפרדים. הוציאו את הכבד, כיס המרה ותעלת הלבלב, הטחול, הכליות ושלפוחית השתן, ובחנו אותם תחת המיקרוסקופ הסטריאואופטי.לאחר מכן, הוציאו את מערכת העיכול השלמה והניחו כל מקטע בתוך צלחת זכוכית. לאחר הוצאת האיברים, השתמשו בצינור או בבקבוק ריסוס המולא ב-0.9%saline כדי לשטוף את חלל הגוף, תוך סינון הנוזלים דרך נפה עם רשת של 106 micrometer. העבירו בשטיפה חוזרת את תכולת הנפה לצלוחית פטרי ובחנו את התוכן תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי כדי לאתר תולעי Fal או טרמטודות דם. בעזרת מספריים, פתחו כל מקטע של צינור העיכול.גרדו את הרירית ובדקו אותה בקפידה כדי לאתר טפילים גדולים. ה-psci של encanto cephas מוטמעים לעיתים קרובות עמוק בדופן המעי. לכן, במידת הצורך, השתמשו בפינצטה ו/או במספריים קטנים כדי להוציא אותם בזהירות מהרקמה.הנח כל מקטע פתוח תחת זרם מים ושטוף את התוכן אל תוך נפה של 106 micrometer. לאחר מכן, פתח את הלב וכלי הדם הראשיים, את הקנה, את שלפוחית השתן ואת כיס המרה, ובחן את תוכנם. באותו אופן, השתמש בלהב חד ובפינצטה כדי לחתוך ולהפריד איברים מוצקים כגון הכבד, הריאות, הכליות, הטחול והלבלב, ושטוף ובחן את התוכן. רשום את סוגי הטפילים.מנּו את מספר הפרטים מכל סוג ואת האיברים שבהם הם נמצאו. סמנו את המבחנות או הצנצנות על ידי הצבת פיס קטן של כרטיסייה לבנה בתוכן, המסומנת בעיפרון, כדי לשמר את הקסדות למחקרים גנטיים עתידיים. ראשית, הניחו אותם ישירות באתנול.לאחר קיבוע הדגימה למשך יום אחד עד מספר ימים, העבירו אותה לבקבוק זכוכית של 5 ml המלא ב-70% ethanol לאחסון לטווח ארוך. כדי לשמר Trematodes, הניחו פרטים חיים על תיתורה של מיקרוסקופ זכוכית בטיפת סליין, הניחו זכוכית כיסוי, והעבירו את התיתורה מעל להבה מבלי להרתיח את הסליין. לאחר מכן, הצניחו את התיתורה לתוך צלחת פטרי המכילה אלכוהול, חומצה אצטית או FA, והניחו לזכוכית הכיסוי לצוף ולהיפרד.קבעו טרמטודות מתות ב-FA או בפורמלין מקושר בריכוז 10% למשך 48 שעות לפני העברתן לצנצנת מלאה ב-70% ethanol לאחסון לטווח ארוך. כדי לקבע אלה, הרפו בעלי חיים חיים בצלחת פטרי על ידי שפיכת מים קרובים לרתיחה עליהם, ולאחר מכן העבירו לצנצנת מלאה ב-70% ethanol לאחסון לטווח ארוך. הרפו encanto cephas חיים על ידי הנחתם בצלחת פטרי עם מי ברז במקרר למשך שעה אחת עד מספר שעות, עד שהחרטומית תהיה רפויה לחלוטין.העבירו אותם לצנצנת מלאה ב-70% ethanol או ל-FA לצורך אחסון לטווח ארוך. כדי להמית נמטודות קטנות או שבירות, השתמשו ב-70% ethanol חם ושמרו אותן בצנצנת מלאה ב-70% ethanol עם 5% glycerin לצורך ההמתה. נמטודות בגודל בינוני עד גדול.הניח אותם בחומצה אצטית קרחית קרה, ולאחר 15 דקות, העבר לצנצנת מלאה ב-70% ethanol ו-5% glycerin. הכן Harris Hematin על ידי המסת hematin ואלכוהול, ועל ידי המסת ammonium aluminum sulfate במים בחימום יתר. ערבב את שני התמיסות והבא לרתיחה.לאחר מכן, הוסיפו sodium iodate והרתיחו במשך שתי עד שלוש דקות. כאשר התמיסה תתקרר, השתמשו בנייר סינון 5 41 כדי לסנן את התמיreson לצורך צביעת Trematodes estos ודלקו את Cephas. השאירו ב-Harris Hematin או ב-semicon Carmine למשך לילה כדי לקבע את הדגימות. השאירו ב-70% acid ethanol עד שהאיברים יהיו גלויים.כדי לעצור את הצביעה, העבירו את הדגימות ל-70% basic ethanol למשך 30 דקות לפחות. בצעו דהידרטציה לדגימות בסדרה של אתנול והשתמשו ב-xylene או ב-methyl salicylate לשקיפות, ולאחר מכן הצמידו את הדגימות לסלייד של מיקרוסקופ, הוסיפו טיפה של Canada Bossum וכיסוי זכוכית. השאירו לייבוש למשך לילה. לשקיפות של נמטודות קטנות עד בינוניות ו-encanto cephas, הניחו אותן בתוך lact phenol על סלייד של מיקרוסקופ וכסו בכיסוי זכוכית למשך 15 עד 30 דקות. עבור נמטודות גדולות ו-encanto Cephas.העבירו ל-80% phenol למשך עד 60 דקות. בחנו תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הפינוי של מבנים קטנים יותר לצורך בחינת ה-culex atos. חתכו אותו והניחו אותו בכמות של lacto phenol.על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ. השתמשו בכיסוי זכוכית כדי למעוך את ה-culex כדי לאפשר מדידה וספירה של ה-rose stellar hooks. חתכו את הקצה הקדמי והניחו על Foss תחת מיקרוסקופ.החלק תחת מספר טיפות של lact phenol או בתוך ג'לי גליצרין לצורך קיבוע קבוע. בדוק את חלקי הפה תחת מיקרוסקופ אור. לאחר חיתוך הזנבות של נמטודות גדולות וקיבוע ב-lacto phenol, בדוק את המורפולוגיה של הפאולי הוונטרליים והספיקול של הזכרים תחת מיקרוסקופ אור, תוך שימוש בשיטות המתוארות בסרטון זה.סקר של קסדות של Sox scenarios של חולד-מסיכה נערך במחוז מיסולה, מונטנה, בין השנים 2007 ו-2011. סך של 56 חולדים נאספו ממלכודות בור ונבדקו בתוך שעתיים מרגע המוות.השכיחות הכוללת של הזיהום הייתה 96% ורק שניים מהנמלים היו נקיים מטפילים. זוהו 15 מיני תולעים, כולל תשעה מינים של אקנתוצפאלות (acanthocephalans) ושישה מינים של נמטודות (nematodes). מין אחד מהסוג Staphylo chưa תואר בעבר.האיברים שנמצאו נגועים כללו את המעי הדק, הקיבה, הריאות ושלפוחית השתן. עוצמות הזיהום הכוללות נעות בין שבע ל-234 תולעים למארח נגוע; עשירות המינים, או מספר מיני ה-helmet לכל מארח נגוע, נעה בין אחד לשמונה עם ממוצע של 4.1. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בשעה אחת עד שעתיים ביונק קטן כמו סנאי, ובארבע עד חמש שעות ביונק גדול יותר כמו דביב.לאחר צפייה בסרטון זה, תגייו הבנה טובה מאוד לגבי האופן שבו אוספים, משמרים ומזהים קסדות מבעלי חיים ברים.

helminth-collection-and-identification-from-wildlife

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

איסוף וזיהוי הלמינטים מחיות בר

מאמר זה מתאר את ההליכים השונים חולדות ועכברים ההקרנה לזהות אנדו או ectoparasitism. מבחני אבחון כמה יהיה הפגינו, הן אלה מתאימים לשימוש בבעלי חיים לבין אלה המשמשים לאחר המתת חסד של החיה. צילומים לסייע בזיהוי של טפילים חולדה ועכבר ייכלל.

אבחון חיצוני ו Endoparasites בחולדות מעבדה ועכברים

מקור: מורגן, א. ואחרים. ניקוי סלקטיבי של נמטודות Caenorhabditis בטבע להעשרת חיידקי מיקרוביום במעי. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד חיידקי מעיים מעניינים מתולעי Caenorhabditis פראיות. התולעים מורעבות ושוטפות תחילה כדי לחסל חיידקים שאריות מזינים מפני השטח ומהמעי שלהן, תוך שמירה על המיקרובים המטרה. לאחר ניקוי פני השטח ומספר שלבים בזחילה, התולעים מנותחות כדי להוציא מעיים המכילים את החיידקים הרלוונטיים, אשר נאספים ומוקפאים לאחסון.

ניקוי סלקטיבי של תולעי Caenorhabditis להעשרת מיקרוביום המעי

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

פרוטוקולי הערכה ביולוגית מהירה המשתמשים במקרו-חסרי חוליות בנטיים משמשים לעתים קרובות לניטור והערכת איכות המים. פרוטוקול יעיל כולל אוספים של Chironomidae exuviae גולם צף על פני השטח (SFPE). כאן מתוארות טכניקות לאיסוף שדה, עיבוד מעבדה, הרכבת שקופיות וזיהוי של Chironomidae SFPE.

שימוש בChironomidae (כפולי כנף) גלמי Exuviae כמהיר Bioassessment פרוטוקול לגופי מים צפים-שטח

מניעת trichinellosis אדם במדינות רבות ברחבי העולם בוסס על בחינת המעבדה של דגימות שריר מחיות רגישות בשיטות של עיכול, מתוכם שיטת הבוחש המגנטית נחשבת תקן הזהב.

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחילוץ יעיל של נמטודות חיות ממצעים טבעיים בשטח.

בידוד מהיר של נמטודות פראיות על ידי משפך ברמן

פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע סקרים אקולוגיים בקנה מידה גדול של נמטודות Caenorhabditis עצמית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ארגון יעיל וניתוח של נתונים אקולוגיים ומולקולריים הקשורים לנמטודות שנאספו מהטבע.

גישה מדרגית מאוד לביצוע סקרים אקולוגיים של נמטודות קאנורהבדיטיס Selfing

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

עבודה זו מתארת את השימוש בשיטת ציפה לזיהוי Toxocara canis ו - Ancylostoma spp. שזוהו בדגימות צואה שנאספו מכלבים במקסיקו בין השנים 2017 ל -2021 בתנאי שדה.

שיטת הנפקה צואה פשוטה לאבחון נמטודות זואונוטיות בתנאי שדה ומעבדה

כאן אנו מציגים שלבים מרכזיים בתהליך יצירת פרוקי רגליים איכותיים, מוטמעים בשרף, להוראה חינוכית והסברה.

יציקת שרף שקופה של פרוקי רגליים לשימוש בחינוך, הסברה ומחקר

למדו פרוטוקול לאיסוף וזיהוי הלמינת'ס מחיות בר באמצעות נקרופסיה, חילוץ ממערכות שונות, שימור באתנול או פורמלין, וזיהוי מורפולוגי בטכניקות צביעה ושקיפות.

איסוף וזיהוי הלמינת'ס מחיות בר

גלה סרטונים נוספים