המאפיינים של מיקרוג'ל פוליאתילן גליקול שנוצר על ידי משקעים נשלטים על ידי משקל מולקולרי של מגיבים

המטרה הכללית של הליך זה היא להרכיב מיקרו-ג'לים של פוליאתילן גליקול באמצעות תגובת שיקוע בפוטו-פולימריזציה, לשימוש כנשאי תרופות וכפיגומים להנדסת רקמות. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הריאגנטים, הכוללים פוטו-איניציאטור, בופרים, טריאתילאמין ותמיסת PEG DL, וחימומם ל-37 °C. השלב השני הוא העברת הריאגנטים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה וערבובם באמצעות וורטקס תוך שמירה על טמפרטורה של 37 °C.

בשלב הבא מערבבים פנימה sodium sulfate ומניחים את התמיסה תחת אור UV למשך 30 שניות לצורך קשירה צולבת (cross-link). לאחר הקשירה הצולבת, תיווצר שכבה עכורה על פני השטח של התמיסה המכילה את המיקרו-ג'לים. השלב הסופי הוא הוספת PBS לתערובת וסבוב בצנטריפוגה ליצירת משקע (pellet).

בסופו של דבר, נעזרים במיקרוסקופיה ובפיזור אור דינמי כדי למדוד את גודל המיקרו-ג'לים, ואת הצפיפות מודדים באמצעות מדרג צפיפות של דקסטרין. בנוסף, כמות הנפיחות מחושבת על ידי מדידת המשקלים הרטוב והיבש של המיקרו-ג'לים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון טכניקות של אמולסיה, סספנסיה ודיספרסיה, הוא שמיקרו-ג'לים הנוצרים בתגובת שקיעה הם בעלי מדד פולי-דיספרסיות נמוך ללא שימוש בממסים אורגניים או מייצבים; התנאים העדנים של תגובת השקיעה, התכונות הניתנות להתאמה של המיקרו-ג'לים והצמיגות הנמוכה להזרקות הופכים אותם למתאימים ליישומים של NVivo.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות והרפואה הרגנרטיבית, כגון ייצור של פיגומים בעלי גודל אחיד ומדד פולי-דיספרסיות נמוך. המשמעויות של טכניקה זו עשויות להתרחב לטיפולים במתן תרופות, כיוון שניתן לכלוס בקלות גורמי גדילה המצויים בתרופות. לתחילת הפעולה, שקלו 500 milligrams של הפוטו-איניציאטור והוסיפו אותם ל-100 milliliters של מים דה-יוניים כדי להכין תמיסה בריכוז 0.5%.

הגנו על התמיסה מאור UV וחממו אותה ל-40 °C תוך כדי ערבוב מתמיד למשך כשעה, עד להמסה מלאה של הפוטו-איניציאטור. לאחר המסה מלאה של התמיסה, סננו אותה באופן סטרילי באמצעות מסנן של 0.22 micron ואחסנו אותה ב-4 °C בחושך עד למועד השימוש. לאחר מכן, חממו מראש Triethylamine ל-37 °C כדי להפחית את הצמיגות שלו.

לאחר מכן, הוסיפו 612 µL ממנו יחד עם 260 µL של חומצה הידרוכלורית בריכוז 6 M ל-39.4 mL של PBS וכווננו את ה-pH ל-7.8 באופן סטרילי. סננו את התמיסה הסופית דרך מסנן של 0.22 micron ואחסנו אותה בטמפרטורה של 37 °C עד למועד השימוש. בהתאם לעבודתו של Sony et al., הכינו את מקדימי ה-PEG לפי השיטות שפורסמו ואחסנו את המוצר המוגמר בטמפרטורה של 20- °C תחת ארגון, ולאחר מכן, מיד לפני השימוש, הכינו 1 mL של תמיסת Peg di Acrylate בריכוז 200 mg/mL על ידי הוספה איטית של 0.8 mL של ה-PBS עם triethanolamine וחומצה הידרוכלורית מתווספים ל-200 mg של peg di acrylate.

בנוסף, ממש לפני הניסוי, שקלו 213 milligrams של sodium sulfate והמיסו אותם ב-one milliliter של מים דאיוניים. כדי להכין תמיסה בריכוז 1.5 molar, חממו את התמיסה ל-37 degrees Celsius למשך 20 דקות, ולאחר מכן ערבבו את התמיסה ב-vortex עד להמסה מלאה. לאחר ההמסה, סננו הן את תמיסת ה-sodium sulfate הסופית והן את תמיסת ה-PEG di Acrylate בטמפרטורה של 37 degrees Celsius דרך מסננים של 0.22 micron.

ערבבו 127.5 µL של PBS עם triethylamine וחומצה כלורית (hydrochloric acid), 10 µL של פוטו-איניציאטור (photo initiator) בריכוז 0.5% ו-25 µL של תמיסת Peg di acrylate בריכוז 200 mg/mL בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה של 1.6 mL. לאחר מכן, הוסיפו כל מולקולה רצויה לאנקפסולציה.

חממו מבחנות אלו יחד עם תמיסת sodium sulfate בריכוז 1.5 molar לטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הוסיפו 87.5 µL של תמיסת sodium sulfate בריכוז 1.5 molar שחוממה מראש למבחנה הראשונה של תמיסת ה-PEG, וערבבו את התמיסה במבחנה באמצעות פיפוט של התמיסה שלושה עד חמישה פעמים. לאחר הערבוב, ריכוז המלח יתחלק באופן שווה והתמיסה אמורה להפוך לצלולה.

הנח את המבחנה תחת אור UV ובצע קשירה (cross-link) למשך 30 שניות. לאחר הקשירה, צריכה להופיע שכבה עכורה מעל התמיסה המכילה את המיקרו-ג'לים. לאחר מכן, הוסף למבחנה 750 µL של PBS וערבב את התמיסה היטב באמצעות וורטקס.

לאחר מכן, סובב את התערובת בצנטריפוגה ב-4,000 ×g למשך שתי דקות כדי ליצור משקע. לאחר היווצרות המשקע, הסר את ה-SUP natin תוך הקפדה לא להפריע למשקע, והשעה את המיקרו-ג'לים ב-PBS טרי. שטוף את המיקרו-ג'לים סך הכל חמש פעמים עם PBS טרי, תוך ביצוע סבב צנטריפוגה ליצירת משקע בין שטיפה לשטיפה.

לאחר השטיפה הסופית, הסירו את הנוזל העליון והעבירו בעזרת פיפט 30 µL של מיקרו-ג'לים מהמשקע אל תוך 1 mL של מים דאיוניים. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לתמיסת המיקרו-ג'ל באמבט סוניקציה למשך שעה אחת בתדר של 50 עד 60 hertz ובהספק של 1.4 amps. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט 15 µL מתמיסת המיקרו-ג'ל על גבי למסב שזכוכיתו חרוטה בחומצה ונקי, והניחו מעליו כיסוי זכוכית מספר 1.5 שחרוט בחומצה.

הפוך את הזכוכית אל על נייר סופג למעבדה ולחץ בעדינות על הזכוכית כדי להסיר עודפי תמיסה ולהבטיח שהמיקרו-ג'לים נמצאים בשכבה אחת. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ אופטי, צלם מספר תמונות של המיקרו-ג'לים באמצעות עדשת שמן DIC 100x. מדוד את המיקרו-ג'לים כדי לקבל קוטר מייצג.

חשבו את מדד הפולי-דיספרסיות (poly dispersity index) באמצעות המשוואה המבוססת על נפח המוצגת כאן, שבה N הוא המספר הכולל של המיקרו-ג'לים ו-VI הוא נפח המיקרו-ג'ל. כדי למדוד את הצפיפות הממוצעת של המיקרו-ג'ל, הכינו תחילה תמיסות דקסטרין בריכוזים של 7, 6, 5, 4, 3 ו-1% במים דאיוניים; צפיפויות תמיסות הדקסטרין מוצגות כאן. לאחר מכן, הוסיפו 2 mL של תמיסת דקסטרין 7% לשפופרת צנטריפוגה של 15 mL.

לאחר מכן, טפטפו באיטיות באמצעות פיפטה 2 mL של תמיסת dextrin בריכוז 6% כדי ליצור שכבה נפרדת מעל ה-dextrin בריכוז 7%. לאחר חמש דקות, הוסיפו 2 mL של השכבה הבאה המורכבת מ-dextrin בריכוז 5%, והמשיכו באופן זה עד שכל ריכוזי ה-dextrin ישוכבדו לפי סדר יורד של ריכוז ה-dextrin. לאחר מכן, שכבדו בזהירות את המיקרו-ג'לים מעל תמיסת ה-dextrin בריכוז 1%, וסבבבבו את הגרדיאנט בטמפרטורה של 5 °C ב-4,000 ×g למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הדמייזו את מיקומם של המיקרו-ג'לים וחשבו את צפיפות המיקרו-ג'לים בהתאם למיקומם בין השכבות. כדי למדוד את המסה הנפוחה של המיקרו-ג'לים, שקלו תחילה מבחנה למיקרו-צנטריפוגה ולאחר מכן הוסיפו לה 1 mL של המיקרו-ג'לים. שטפו את המיקרו-ג'לים חמש פעמים במים דה-יוניזציה, עם שלבי שטיפה ביניהם.

סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-4,000 ×g כדי לשקיע את המיקרו-ג'לים לאחר השטיפה האחרונה. השהה אותם מחדש במים דה-יוניים ואפשר להם להתנפח למשך 48 שעות לפחות. לאחר 48 שעות, סבב את המיקרו-ג'לים הנפוחים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-4,000 ×g ולאחר מכן הסר את כל הנוזל העליון (supernatant).

לאחר מכן שקלו את הדגימה ורשמו את המסה הרטובה. לאחר קבלת משקל רטוב מדויק, הקפיאו את המיקרו-ג'לים בטמפרטורה של 80°C-, ולאחר מכן הקיפיאו אותם (lyophilize) כדי להסיר את המים ולקבל את המסה היבשה. ברגע שכל המים התעלו, חשבו את תכולת המים והפולימר במיקרו-ג'לים באמצעות המשוואות המוצגות כאן, כאשר MS הוא המשקל הרטוב של המיקרו-ג'לים ו-MD הוא המשקל היבש.

הקוטר הממוצע של מיקרו-ג'לים של PEG שהוכנו באמצעות משקלים מולקולריים שונים של 20%PEG מוצגים כאן. להארכת זמן החשיפה ל-UV הייתה השפעה גם היא על קוטר המיקרו-ג'לים. ככל שזמן החשיפה ל-UV עלה, כך עלו הקטרים של שלושת הניסוחים המוצגים כאן.

הצפיפות שנמדדה באמצעות מדרגי דקסטרין פחתה ככל שהמשקל המולקולרי של מולקולות ה-peg המקדימות עלה. דבר זה מאושש גם בגרף אחוז תכולת המים, שבו נמצא כי ל-peg בעל משקל מולקולרי גבוה יותר יש כמות גדולה יותר של מים לגרם פולימר. לבסוף, כדי להראות שניתן להטעין את המיקרו-ג'לים בחלבון מצומד פלואורסצנטית, הוסף אלבומין לתערובת לפני הפולימריזציה ונלכד בתוך הכדורים.

ריכוזים גבוהים יותר של החלבון המסומן פלואורסצנטית העלו את מדד הפולי-דיספרסיביות (poly dispersity index) של הכדורים, אך הגודל הממוצע נותר קבוע. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לחמם את כל התמיסות ל-37 °C ולערבל ב-vortex את המיקרו-ג'לים היטב כדי לפרק אגרגטים במהלך השטיפה והכנת השקופיות להדמיה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות לכליאת תרופות כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להשפעת שחרור התרופה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור מיקרו-ג'לים של peg DA בתנאים מתונים באמצעות תגובות שקיעה.