בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine
30 בינואר 2014
מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיקרוגליה קורטיקלית מעכברי新生 (neonates). דבר זה מושג תחילה על ידי מיקרו-דיסקציה של רקמת מוח קורטיקלית מעכברי新生. השלב השני הוא גידול של תרביתי תאי גליה מעורבים במשך 17 עד 21 ימים in vitro.
בשלב הבא, מבודלים את המיקרוגליה מתרביות גליאליות מעורבות אלו. השלב הסופי הוא זריעת תאי מיקרוגליה בצלחות תרבית תאים לצורך ניסויים נוספים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של אימונופלואורסנציה וב-Eliza כדי להראות שפרוטוקול בידוד זה שומר על האימונו-פנוטיפ ועל התפקוד של המיקרוגליה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי ה-SEP המעורבים במיקרו-מיקרודיסקציה הם קשים לביצוע. ביצוע מוצלח של הליך זה דורש הן מהירות והן דיוק. זאת משום שעבודה איטית מדי תפחית את תנובת התאים, בעוד שהסרה חלקית של הקרומים תזהם את תרבית הגליליה ותעכב את צמיחת התאים הגליאליים.
התחילו בהכנת המצע המלא למיקרוגליה, אשר יכונה להלן MCM. הכינו מבחנה אחת לכל גור גור והדגירו אותן למשך שעה אחת לפחות. שלב שיווי המשקל הזה חיוני להצלחת התהליך.
בשלב הבא, הכין מנבובות וקרר על קרח. מכל המדיומים הדרושים, הכן מנבוב של 6 ml של MCM עבור כל גולם וחמם באמבט מים של 37 °C לפני הניתוח. נקה את תחנת העבודה בעלת זרימת האוויר האופקית ואת מיקרוסקופ הניתוח עם אתנול 70%.
כעת הניחו את כלי הניתוח המעוקרים הדרושים לפרוצדורה באזור העבודה. הכינו צלחת סטרילית עם תמיסת נתיחה ללכידת הראש וצלחת נוספת לצורך הנתיחה. מזיגו את תמיסת הקיצוץ לצלחת נפרדת עבור קיצוץ רקמת המוח.
לאחר עריפת הראש והוצאת המוח, הניחו את המוח שבודד זה עתה תחת מיקרוסקופ דיסקציה כדי להמחיש את המבנים, תוך הקפדה על שמירת הצד הגבי (dorsal) כלפי מעלה ויבש. קבעו את המוח על ידי החדרת קצות פינצטה לנקודת המפגש בין המוח האמצעי לקורטקס. לאחר הקיבוע, הסירו לחלוטין את קרומי המוח (meninges) מהקורטקס הגבי.
בשלב הבא, הסר את הקרומיים הגחוניים (ventral meninges) כדי למקסם את טהורת ותשואת המיקרוגליה. חיוני להסיר לחלוטין את כל רקמת הקרומיים. הפר את קליפות המוח משאר חלקי המוח.
יש לוודא שכל שאריות הקרומי הקורטיקליים שעשויות להימצא בצד הוונטרלי או המדיאלי של הקורטקסים הוסרו. לאחר הסרת רקמת הקרומים, יש להניח את הקורטקסים בכלי הקיצוץ שהוכן קודם לכן. בעבודה בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית בדרגה 2, יש להשתמש במספריים כדי לקצץ את רקמת המוח.
העבירו את הרקמה הקצוצה למבחנה קונית של 15 מילימטר. שטפו הן את המספריים והן את כלי הקיצוץ ב-1 מיליליטר של מדיום קיצוץ כל אחד כדי למקסם את התוצאות. אספו והעבירו את שטיפות אלו למבחנה הקונית של 15 מיליליטר המכילה את הרקמה הקצוצה.
השאירו את תרחיף הרקמה ללא הפרעה למשך דקה עד שתי דקות, כדי לאפשר לרקמה הקצוצה לשקוע בתחתית המבחנה. לאחר זמן זה, הסירו בזהירות והשליכו 2 mL מהנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע לרקמה הקצוצה ששקעה. הוסיפו 3 mL של ה-MCM שחומם מראש לרקמה הקצוצה, ולאחר מכן טריטורו את הרקמה בעוצמה.
לא צריכה להישאר רקמה מוצקה ניכרת עם סיום פעולת הדגימה. הוסף שלושה מיליליטרים נוספים של MCM באמצעות אותה טיפ פפיטה כדי לאסוף את שאריות הדגימה הטחונה מהטיפ. לאחר האיסוף, סבב את הרקמה הקצוצה בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים.
עם סיום התהליך, החזירו את התאים שהשקיעו למטריצת הבטיחות הביולוגית. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו. בצעו סספנסיה (resuspension) עדינה.
יש להשעות את משקע התאים בשני מיליליטר של MCM חמים, ולאחר מכן להוסיף את תרחיף התאים לבקבוק שהוכן קודם לכן. יש להדגיר את התאים למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, יש להקיש בעדינות את הבקבוק כנגד כף היד כדי לפרק את שאריות הרקמה.
יש לבחון את התאים לפני ואחרי ההקשה כדי לוודא שהפסולת הוסרה לחלוטין. לאחר מכן, יש להחליף את המצע ב-MCM טרי ולהחזיר את הבקבוק לאינקובטור. יש לבחון את התאים מדי יום כדי לעקוב אחר הצמיחה והזיהומים.
לאחר כ-17 עד 21 ימים, תאי המיקרוגליה יהיו מוכנים לקציר; כדי לקבוע אם התאים מוכנים, יש לבחון אותם תחת מיקרוסקופ פאזה הפוך. המיקרוגליה מוכנים לקציר כאשר הם מגיעים למצפיות של כ-40% fluency, ואז הם נראים כתאים כדוריים, בהירים וקטנים הגדלים כשכבה אחת על גבי השנייה.
כדי לבודד מיקרוגליה, הקש את הבקבוק בעוצמה נגד ספסון המעבדה. טלטול זה מסייע בהפרדת המיקרוגליה מתאי גליה אחרים בשל תכונות ההיצמדות הנמוכות של המיקרוגליה. אטום את פקקי הבקבוקים באמצעות פאראפילם וסובב את תרביות הגליה המעורבות באמצעות שייקר סיבובי לא מלחח בבקרה טמפרטורית למשך חמש שעות.
לאחר פרק זמן זה, בדקו באופן ויזואלי שהמיקרוגליה התנתקו ממשטח הבקבוק. בבחינה תחת מיקרוסקופ פאזה הפוך, תאי המיקרוגליה ייראו כתאים כדוריים, בהירים וצפים באופן חופשי. שכבה שיורית של אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים תישאר דבוקה לתחתית הבקבוק.
בשלב הבא, אספו את העלייה המכילה את המיקרוגליה לשפופרת צנטריפוגה קונית סטרילית ובצעו סבב צנטריפוגה. השביו את משקע המיקרוגליה במצע גידול חם למיקרוגליה וקבעו את ריכוז התאים באמצעות פלטת המוציטומטר. זרעו את התאים בפורמט של פלטת 24 בארות על פלסטיק או על כיסויי זכוכית סטריליים, והמתינו 24 שעות.
החליפו את המצע ב-MGM טרי וחמים כדי להסיר תאים צפים ושאריות. שלב זה קריטי להישרדות התאים ולשמירה על מיקרוגליה במצב של מנוחה (quiescent); תאי המיקרוגליה מוכנים לניסוי מיד לאחר שלב הזנה זה כדי להעריך את טוהר המיקרוגליה. תרביות תאים שהופקו ממיקרוגליה המבטאת GFP באופן אנדוגני נצבעו לאנטיגן המקרופאגים IBA one ונצבעו בצביעה נגדית ב-dapi.
על מנת להדמיות את גרעין התא, נמצא כי ביותר מ-95% מהתאים הופיעה קולוקליזציה של GFP IBA one ו-dpi. לאחר גירוי של התאים באמצעות LPS, המיקרוגליה עברו שינוי מורפולוגי בולט מפנוטיפ קטן וענפי לצורה דמוית אמבה. צביעה אימונוהיסטוכימית ל-P 65 הוכיחה כי בתנאים נורמליים P 65 ממוקם באופן דיפוזי לאורך הציטופלזמה.
בעוד שלאחר חשיפה של שעתיים ל-Pam P 65, הלוקליזציה של התגובתיות החסונית השתנתה באופן דרמטי לגרעין התא, על מנת לאשר כי המיקרוגליה המבודדת שמרה על התפקוד החסוני-ביוכימי שלה. הפרשתו של הציטוקין הפרו-דלקתי TNF alpha נקבעה לאחר חשיפה ל-PAM או ל-LPS. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן בידודה של מיקרוגליה קורטיקלית מעכברים ניאונטלים לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
חשוב לשמור על טכניקה סטרילית ולהסיר ביסודיות את רקמת הקרומיים מאזור הקליפה שהודח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה לבידוד מיקרוגליה קורטיקלית מחתרי新生 (neonates) של עכברים, תוך דגש על חשיבות השמירה על התפקוד האימונולוגי של המיקרוגליה במהלך התהליך. שיטת הבידוד כוללת דיסקציה מיקרוסקופית של רקמת מוח, תרבית של תאי גליה מעורבים, ובידוד עוקב של מיקרוגליה לצורך ניסויים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- מיקרוגליה ממלאת תפקיד מכריע במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- שיטות בידוד עשויות להשפיע על התפקוד של תאי מיקרוגליה.
- שימור התפקוד החסוני חיוני להשגת תוצאות ניסוייות מדויקות.
- גירויים פרו-דלקתיים משמשים להערכת השפעתו של שפעול המיקרוגליה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן לבידוד מיקרוגליה מ新生-עכברים (neonates).
- הבטחה שהמיקרוגליה המבודדת תשמור על הפנוטיפ החיסוני ותפקודיותה.
- סיוע לביצוע ניסויים נוספים בביולוגיה של המיקרוגליה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרו-דיסקציה של רקמת מוח קורטיקלית מעכברים רכים.
- תרבית של תאי גליה מעורבים למשך 17 עד 21 ימים in vitro.
- בידוד של מיקרוגליה מתרביות גליה מעורבות.
- שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסנציה וב-ELISA להערכת התפקוד של המיקרוגליה.
תוצאות עיקריות
- פרוטוקול הבידוד מניב תרביות מיקרוגליה בדרגת טוהר גבוהה.
- מיקרוגליה שומרות על מאפיינים תפקודיים-חיסוניים לאחר הבידוד.
- הפעלה באמצעות LPS ו-Pam 3 CSK 4 מדגימה תפקוד שנשמר.
- דימות פלואורסצנטי ואימונוציטוכימיה מאשרים את התוצאות.
מסקנות
- שיטת הבידוד המתוארת יעילה להשגת מיקרוגליה תפקודית.
- שימור התפקוד האימונולוגי הוא קריטי לחקר הביולוגיה של המיקרוגליה.
- ניתן להחיל פרוטוקול זה על מערכי ניסוי שונים הכוללים מיקרוגליה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בידוד של מיקרוגליה תפקודית מחתוליות של עכברים מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית בתיקוף מטרות בנוירו-אימונולוגיה, על ידי שימור האימונופנוטיפ והתגובה לגירויים דלקתיים. מודל ex vivo זה תומך בביטחון ניבוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי שמירה על מצבים רגועים (quiescent) ומפועלים הרלוונטיים למסלולי מחלות של ה-CNS. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלה לסריקת תרכובות אימונו-מודולטוריות ולהערכת מעורבות המטרה (target engagement) בזרימות עבודה פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מסלולי הפעלה של מיקרוגליה באמצעות מבחני אתגר עם LPS ו-Pam3CSK4.
- ערך תפעולי: מניב מיקרוגליה קורטיקלית בדרגת טוהר גבוהה, תוך שימור התפקוד של מעבר גרעיני של NF-κB p65 והפרשת TNF-α.
- ערך ניבוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מטרות על ידי שמירה על נאמנות אימונופנוטיפית ממצבים שקטים למצבים פרו-דלקתיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת סטנדרטית של שכבה אחת של מיקרוגליה לסריקת תרכובות לאחר 17–21 ימים של הבשלה של תרבית גליאלית.
- ערך תפעולי: מאפשר כימות של טוהר המיקרוגליה באמצעות קולוקליזציה של IBA-1/GFP (מעל 95%) ומדדים תפקודיים כגון שחרור ציטוקינים.
- מוכנות הבדיקה: מיקרוגליה מבודדת מראה תגובות מורפולוגיות ותפקודיות לגירויים, מה שמאפשר בניית פרופיל תגובה-מנה אמין.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על התפקוד המיקרוגליאלי ex vivo, ובכך תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של יעדי דלקת נוירולוגית.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: משמר תפקוד ביוכימי (סיגנלינג של NF-κB, שחרור TNF-α) הקריטי להערכת מודולציה של מסלולים המתווכים על ידי היעד.
- רלוונטיות למחלה: מדמה מצבים של מיקרוגליה שקטה ופעילה, הישמימים למחקר של מחלות נוירודגנרטיביות ודלקתיות נוירולוגיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטת הבידוד משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי אספקת פלטפורמת מיקרוגליה הניתנת לשחזור למחקרים של מנגנוני פעולה ולסריקה פנוטיפית בתחום הנוירו-אימונולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים באמצעות בדיקות של translocation של NF-κB והפרשת ציטוקינים לאחר גירוי חיסוני.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תנובה עקבית של מיקרוגליה, טהרות ותגובתיות תפקודית לאחר בידוד באמצעות שייקר סיבובי.
- אנליטיקה: מייצר משתנים תלויים כמותיים, כולל רמות הפרשת TNF-α ולוקליזציה גרעינית של p65, לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תפקוד מיקרוגליאלי ex vivo לרלוונטיות in vivo באמצעות שימור האימונופנוטיפ וקינטיקת ההפעלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לבידוד מיקרוגליה, הישימה במספר קמפיינים של תיקוף מטרות ב-CNS.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף המטרה באמצעות שימור האימונופנוטיפ של המיקרוגליה ופונקציונליות המגיבה לגירויים.
- ערך תפעולי: בידוד סטנדרטי באמצעות ערבול מכני מניב תרביות מיקרוגליה ניתנות לשחזור עם טוהר של >95% ושלמות פונקציונלית.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית בסריקת נוירו-אימונולוגיה על ידי שמירה על התנהגות מיקרוגליה ex vivo המעידה על מצבים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף של מטרות אימונו-מודולטוריות מותאם סיכון, על בסיס מעורבות מטרה מתוקפת במבחני מיקרוגליה פונקציונליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות עכברים ניאונטליים ובטכניקות סטריליות לתרביות גליאליות.
- תלוי במכשיר ניעור סיבובי עם בקרת טמפרטורה ובמיקרוסקופ פאזה הפוך לצורך בידוד ואימות של מיקרוגליה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הסרת הקרומים (meninges) ושל משך התרבית (17–21 ימים) בין הצוותים כדי להבטיח את תנובת המיקרוגליה ואת טהרתה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תזמון הדיסוציאציה ותכונות ההיצמדות של המיקרוגליה.
- מגבלה מעשית: תנובת המיקרוגליה תלויה בהסרה מלאה של רקמת הקרומים כדי למנוע זיהום של התרבית הגליאלית.
