בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine
30 בינואר 2014
מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיקרוגליה קליפת המוח מיילודים עכברים. זה מושג על ידי מיקרוסים ראשונים המנתחים רקמת מוח קליפת המוח מיילודים מורנים. השלב השני הוא גידול תרביות תאי גליה מעורבות במשך 17 עד 21 יום במבחנה.
לאחר מכן, המיקרוגליה מבודדת מתרביות גליה מעורבות אלה. השלב האחרון הוא צלחת תאי מיקרוגליה בצלחות תרבית תאים לניסויים נוספים. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ו-Eliza כדי להראות שפרוטוקול בידוד זה משמר את הפנוטיפ החיסוני והפונקציונליות של מיקרוגליה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שה-SEP המעורב במיקרו-דיסקציה קשה לביצוע. ביצוע מוצלח של הליך זה דורש מהירות ודיוק כאחד. זה איטי מדי יפחית את תפוקת התאים שלך בעוד שהסרה לא מלאה של קרומי המוח תזהם את תרבית הגליה ותעכב את צמיחת הגליה.
התחל בהכנת המדיה השלמה של microglia המכונה להלן MCM. הכינו בקבוק אחד לכל גור ודגרו עליו למשך שעה לפחות. שלב שיווי משקל זה חיוני להצלחה.
לאחר מכן, מכינים אליקוט ומצננים על קרח. כל המדיה הנדרשת היא שישה מיליליטר MCM לכל גור ולחמם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לפני הדיסקציה. נגב את תחנת העבודה האופקית של זרימת האוויר ומיקרוסקופ החיתוך עם 70% אתנול.
לאחר מכן הנח את כלי הניתוח המעוקרים הדרושים להליך לאזור העבודה. הכינו צלחת סטרילית עם אמצעי חיתוך ללכידת הראש ואחרת לדיסקציה. הוציא את חומר הטחינה לצלחת משלו לטחינת רקמת המוח.
לאחר עריפת הראש וחילוץ המוח, הניחו את המוח המבודד הטרי מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי לדמיין את הנימוסים, והקפידו לשמור על הצד הגבי כלפי מעלה ויבש. אבטח את המוח על ידי החדרת קצות המלקחיים לתוך הצומת של המוח התיכון וקליפת המוח. לאחר שנמצא במקום, הסר לחלוטין את קרומי המוח בקליפת המוח הגבית.
לאחר מכן, הסר את קרומי המוח הגחוניים כדי למקסם את טוהר התפוקה והתפוקה של מיקרוגליה. חיוני להסיר לחלוטין את כל רקמת קרום המוח. הפרד את קליפת המוח משאר המוח.
הקפד להסיר את כל שאריות קרומי המוח בקליפת המוח שעלולות להיות בצד הגחון או המדיאלי של קליפת המוח. לאחר הסרת רקמת קרום המוח, הניחו את קליפות המוח בצלחת הטחינה שהוכנה קודם לכן. עובדים בארון בטיחות ביולוגי מדרגה שנייה, השתמשו במספריים כדי לטחון את רקמת המוח.
העבירו את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי בגודל 15 מילימטר. שטפו גם את המספריים וגם את צלחת הטחינה עם מיליליטר אחד של אמצעי טחינה כל אחד כדי למקסם את התשואות. אסוף והוציאו את השטיפות הללו לתוך הצינור החרוטי של 15 מיליליטר המכיל את הרקמה הטחונה.
השאירו את תרחיף הרקמות ללא הפרעה למשך דקה עד שתיים, ואפשרו לרקמה הטחונה להתיישב בתחתית הצינור. לאחר זמן זה, הסר בזהירות והשליך שני מיליליטר של הסופרנטנט, הקפד לא לשבש את הרקמה הטחונה המיושבת. הוסף שלושה מיליליטר של ה- MCM שחומם בעבר לרקמה הטחונה, ולאחר מכן טרף את הרקמה בכוח.
לא אמורה להישאר רקמה מוצקה שניתן להבחין בה כאשר הטרייר הושלם. הוסף עוד שלושה מיליליטר של MCM באמצעות אותו קצה פיפטה כדי לאסוף שאריות דגימה משולשת מהקצה. לאחר האיסוף, צנטריפוגה את הרקמה הטחונה כדי לגלול את התאים.
בסיום החזר את התאים הגלולים לארון הבטיחות הביולוגי. הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנט. החייאה בעדינות.
השעו את גלולת התא בשני מיליליטר MCM חם, ואז הוסיפו את תרחיף החייאת התא לבקבוק שהוכן קודם לכן. דגרו על התאים למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, יש לטפוח בעדינות על כף היד כדי לשבש את שאריות הרקמות.
בדוק את התאים לפני ואחרי ההקשה כדי לוודא שהפסולת מוסרת לחלוטין. לאחר מכן, החלף את המדיה ב- MCM טרי והחזיר את הבקבוק לחממה. בדוק את התאים מדי יום כדי לעקוב אחר צמיחה וזיהום.
לאחר כ-17 עד 21 יום, תאי מיקרוגליה יהיו מוכנים לקציר כדי לקבוע אם התאים מוכנים, לבחון אותם תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה. מיקרוגליה מוכנה לקציר. כאשר הם הגיעו לשטף של כ-40%, הם נראים כתאים כדוריים קטנים ובהירים הגדלים כחד-שכבה על גבי אחרים.
כדי לבודד, מיקרוגליה מקישה במרץ את הבקבוק על ספסל המעבדה. תסיסה זו עוזרת להפריד מיקרוגליה מתאי גליה אחרים בשל תכונות ההיצמדות הנמוכות של מיקרוגליה. אטמו את מכסי הבקבוק עם פרפורם וסובבו את תרביות הגליה המעורבות באמצעות שייקר סיבובי לא לח מבוקר טמפרטורה למשך חמש שעות.
לאחר זמן זה, בדוק ויזואלית שהמיקרוגליה התרוממה ממשטח הבקבוק. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך, מיקרוגליה הם תאים כדוריים בהירים צפים חופשיים. תהיה שכבה שיורית של אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים הנצמדים לתחתית הבקבוק
.לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל את המיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי וחך. החייאה. השעו את גלולת המיקרוגליה במדיום גידול מיקרוגליאלי חם וקבעו את ריכוז התאים באמצעות צלחת ציטומטר המו. התאים בפורמט צלחת 24 בארות על כיסוי פלסטיק או זכוכית סטרילית מחליקים 24 שעות לאחר מכן.
החלף את המדיה ב-MGM חם וטרי כדי להסיר תאים צפים ופסולת. שלב זה הוא קריטי להישרדות התאים וכדי לשמור על מיקרוגליה רגועה, תאי מיקרוגליה מוכנים לניסויים מיד לאחר שלב ההזנה מחדש כדי להעריך את טוהר המיקרוגליה. תרביות תאים שמקורן במיקרוגליה המבטא GFP באופן אנדוגני נצבעו עבור אנטיגן המקרופאגים IBA אחד ונצבעו נגדית ב-dapi.
על מנת לדמיין את גרעין התא, יותר מ-95% מהתאים הראו קו-לוקליזציה של GFP IBA one ו-dpi. לאחר שאתגר את התאים עם LPS, המיקרוגליה אימצה שינוי מורפולוגי חד מפנוטיפ דו-קטן לצורה דמוית אמבואיד. צביעה אימונו-פיטוכימית עבור P 65 מעידה כי בתנאים רגילים P 65 ממוקם באופן מפוזר בכל הציטופלזמה.
בעוד שלאחר חשיפה של שעתיים ל-Pam P 65, התגובה החיסונית שינתה באופן דרמטי את הלוקליזציה לגרעין התא כדי לאשר שמיקרוגליה מבודדת שמרה על הפונקציונליות החיסונית הביוכימית שלה. הפרשת הציטוקין הפרו-דלקתי TNF אלפא נקבעה לאחר חשיפה ל-PAM או LPS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד מיקרוגליה קליפת המוח משיקוף יילודים לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
חשוב לשמור על טכניקה סטרילית ולהסיר ביסודיות רקמת קרום המוח מאזור קליפת המוח המנותחת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מתאר נוהל לבידוד מיקרוגליה קורטיקלית מתינוקות עכברים, תוך הדגשת החשיבות של שמירה על התפקוד החיסוני של המיקרוגליה במהלך התהליך. שיטת הבידוד כוללת ניתוח מיקרוס של רקמת מוח, טיפוח תאים גליאליים מעורבים ולאחר מכן בידוד המיקרוגליה לצורך ניסויים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאים
- אימונולוגיה
רקע
- למיקרוגליה יש תפקיד מכריע במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- שיטות בידוד יכולות להשפיע על תפקוד התאים המיקרוגליאליים.
- שימור התפקוד החיסוני הוא חיוני לתוצאות ניסוי מדויקות.
- גירויים פרו-דלקתיים משמשים להערכת הפעלת המיקרוגליה.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול אמין לבידוד מיקרוגליה מתינוקות עכברים.
- לוודא שהמיקרוגליה המבודדת שומרת על הפנוטיפ החיסוני והתפקוד שלה.
- לאפשר ניסויים נוספים על ביולוגיה של המיקרוגליה.
שיטות בשימוש
- ניתוח מיקרוס של רקמת מוח קורטיקלית מתינוקות עכברים.
- טיפוח תאים גליאליים מעורבים למשך 17 עד 21 ימים in vitro.
- בידוד מיקרוגליה מתרביות תאים גליאליים מעורבים.
- שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו-ELISA להערכת תפקוד המיקרוגליה.
תוצאות עיקריות
- פרוטוקול הבידוד מניב תרביות מיקרוגליאליות טהורות מאוד.
- המיקרוגליה שומרת על מאפיינים פונקציונליים חיסוניים לאחר הבידוד.
- הפעלה עם LPS ו-Pam 3 CSK 4 מדגימה תפקוד משומר.
- הדמיה פלואורסצנטית ואימונוציטוכימיה מאששות את התוצאות.
מסקנות
- שיטת הבידוד המתוארת יעילה להשגת מיקרוגליה פונקציונלית.
- שימור התפקוד החיסוני הוא קריטי לחקר ביולוגיה של המיקרוגליה.
- פרוטוקול זה ניתן ליישם על התקנים ניסיוניים שונים הכוללים מיקרוגליה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
