ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב Streptococcus pneumoniae שימוש צבעי ניאון

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בצבעים פלואורסצנטיים כדי לנטר שינויים בדינמיקת הממברנה וריכוזי יונים תוך תאיים במערכת חיידקים. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של חיידקים בשלב הצמיחה שלהם עם הפלואור המעניין עד שהוא מתאזן על פני הממברנות שלהם. לאחר מכן, החיידקים מטופלים בחומר המועדף ומעקב אחר הקרינה שלהם.

התוצאות יכולות להראות שינויים בדפולריזציה של הממברנה, שלמות הממברנה וריכוזי היונים התוך-תאיים בהתבסס על השינויים הנצפים בקרינה של צבעי האינדיקטורים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות אלקטרופיזיולוגיה קונבנציונליות כמו הידוק טלאי המשמש במערכות אוקריוטיות הוא שניתן כעת לנטר שינויים בדינמיקת הממברנה וריכוזי יונים תוך-תאיים בחיידקים באמצעות פלורסנט. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש מאמץ מסוים כדי לייעל את ריכוזי הצבע.

תנאי טעינה והגדרות זיהוי התחל עם תאי חיידקים. רק כדורים בתמיסת כביסה השעו תחילה את הגלולה בלפחות מיליליטר אחד של PBS עבור 100 מיליון CFU למיליליטר, וזה מספיק לחמש דגימות. העבירו מיליליטר אחד מהתאים השטופים לצינור מיקרו צנטריפוגה והוסיפו 25 מיקרוליטר של פילטר טוחנת אחת.

תמיסת מלאי מעוקרת של גלוקוז לאחר מכן דוגרת על התאים בבלוק חימום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תוספת הגלוקוז עשויה להשתנות בהתאם לניסוי. לאחר 15 דקות, הוסף חמישה מיקרוליטר של 50 מיקרו-מולרי גסיסה, ו-10 מיקרוליטר של תמיסת PI.

מערבבים היטב את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר מכן חלקו את תרחיף התאים הזה לחמש בארות דגימה של צלחת שקופה של 96 בארות. טען את הצלחת לתוך קורא צלחות חם מראש לזיהוי NP מוות.

כעת עקוב אחר שיווי המשקל על ממברנות התאים על ידי ביצוע מדידות אחת לדקה במשך 30 עד 40 דקות עד שהקריאה מתייצבת לערך הטיפול המקדים שלהן. לאחר מכן הוציאו את הצלחת והוסיפו את חומר הניסוי לבחירתכם. החזר מיד את הצלחת לקורא והמשך לעקוב אחר גסיסת המוות והפלואורסצנטיות של PI למשך הזמן הרצוי.

בעת הכנת מאגר הטעינה להליך זה, הקפד לערבב אותו לזמן קצר לפני הוספת PBS ו-Probenecid. לאחר הוספת התמיסות הללו, מערבב אותו שוב ועטוף אותו בנייר כסף למיליליטר אחד של תרחיף שני תאי x. הוסף מיליליטר אחד של שני x מאגר טעינה.

זה מספיק ל -10 דגימות. דגרו את התערובת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 75 דקות, מוגנים מאור לאורך כל הבדיקות הללו. ייתכן שיהיה צורך להתאים את ריכוז הצבע וזמן הדגירה כדי לייעל את הבדיקה ואת רמת זיהוי הקרינה הבסיסית, בהתאם למיני החיידקים הספציפיים ולמשתנים אחרים של מערכת הניסוי.

לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים לכל שטיפה. גלולה את התאים ב -2, 400 גרם למשך 10 דקות והשעו אותם מחדש בשני מיליליטר PBS המכילים x פרוניק אחד. לאחר שלוש השטיפות, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות.

זה מאפשר לאסטרו בתוך החיידקים להידרוליזה של קבוצות האסטר של הצבע, מה שהופך את הצבע לפעיל בתוך התא. לאחר מכן, התאים מסירים את החטיפה ומחזירים אותם לחיים בשני מיליליטר של PBS המכילים פרובנציד אחד. במידת הצורך, כעת ניתן להוסיף גלוקוז בחזרה כדי להמריץ מחדש את החיידקים להעמיס 200 מיקרוליטר מהתאים לבאר אחת של צלחת 96 בארות לכל דגימה ולהעמיס את הצלחת לקורא חם מראש בדגימה אחת.

ובכן, ראשית קבע קריאה בסיסית באורכי הגל המתאימים ובקצב של קריאה אחת לשנייה למשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את הצלחת והוסף כחמישה מיקרוליטר מהטיפול לבחירה. לזה.

ובכן, מהר פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב את הטיפול ולהחזיר מיד את הצלחת לקורא. המשך לבצע מדידות למשך הזמן הרצוי. כדי לנתח את הנתונים, חשב את היחס בין ערכי הפלואורסצנט עבור כל נקודת זמן על ידי חלוקת ערך, אחד בערך שתיים, ושרטט את ערכי היחס על גרף.

בהכנה, צור טווח של חמישה או שישה חוצצי אשלגן גבוהים עם ערכי pH בין 6.5 ל -8.0. כמו בהליך הקודם, השתמש במערבולת כדי להכין את שני מאגר הטעינה מתרבית שלב אמצע בול עץ לשטוף ולרכז את התאים. לאחר מכן החלף את ה- SNAT בשני מיליליטר BS כדי ליצור מתלה תאים פי ארבעה.

שלב מיליליטר אחד של מתלה ארבעת התאים עם מיליליטר אחד של מאגר הטעינה של שני x. כעת דגרו את התאים באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. הגן עליו מפני אור.

כעת שטפו את התאים שלוש פעמים. גלולה את התאים כפי שהוצג קודם לכן. הוסף בחזרה ארבעה מיליליטר PBS המכילים שני x פרופ בנין, וגלוקוז מילימולרי אחד וחזור על הצנטריפוגה לאחר שלוש השטיפות.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות נוספות. כדי לקבוע את מסנן הקרינה ברקע, יש לעקר כ-500 מיקרוליטר מהתרחיף החיידקי האנרגטי כדי להסיר את החיידקים. לאחר מכן העבירו 200 מיקרוליטר של המסנן לצלחת 96 באר ומדדו את הספיגה מאותה באר למשך דקה.

כדי להשיג עקומת כיול in vivo, סובב 500 מיקרוליטר ALI וואט של התאים והחייאה הטעונים והאנרגטיים. השעו אותם בסדרה של מאגרי אשלגן גבוהים בעלי pH שונה לכל דגימה, הוסיפו 20 מיקרומולר של ריסין. זה מאזן את ה-pH התוך-תאי של התאים ל-pH של המאגר שמסביב.

לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, העבירו את הדגימות לצלחת 96 באר בקורא הצלחות. מדוד את הקרינה של כל דגימה למשך מספר דקות כדי לקבוע קריאת מחקר עבור כל אחת מהן. ובכן.

כדי לנתח נתונים אלה, הפחיתו את ערכי הקרינה ברקע, ולאחר מכן חישבו את היחס בין ערכי הקרינה על ידי חלוקת ערך. אחד לפי ערך שתיים, שרטט את ערכי היחס עבור כל מאגר pH כדי ליצור את עקומת הכיול למדידת שינויים ב-pH התוך-תאי. טען 200 דגימות מיקרוליטר של התאים המופעלים לצלחת ומדוד את הקרינה כל חמש שניות למשך חמש דקות.

במקביל, הוסף 10 CCCP מיקרומולרי לדגימה אחת תוך הוספת החומרים המעניינים לדגימות האחרות. ה-CCCP הוא בקרה חיובית מיושרת בזמן להפחתת pH תוך-תאי. החזר מיד את הצלחת לקורא והמשך למדוד את הקרינה כל חמש שניות למשך 10 דקות.

כבקרה נוספת, הוסף 20 מיקרו טוחנות NI לכל הדגימות כדי לאזן את ה-pH של החיידקים לזה של המאגר למשך חמש דקות נוספות. כאשר בוחנים את קוטביות הממברנה, יש לדגור את החיידקים עם גוון למשך כ-40 דקות כדי לאפשר לצבע להתייצב על הממברנה. זה מסומן על ידי הירידה המתמדת בקרינה שמתייצבת.

PI אינו דורש שיווי משקל, אך יחד עם גסיסה, הוא מועיל לניטור קרע בממברנה. במקביל לקוטביות, דה-פולריזציה וקרע של החיידקים מסומנים על ידי עלייה בעוצמת הפלואורסצנט של שני הצבעים למשך פחות מ-2:00 לפנות בוקר, מחושב היחס בין שני אותות פלואורסצנטיים ועלייה או ירידה ביחס זה תואמת את הסידן התוך-תאי. עבור PBFI, אשלגן תוך-תאי נמדד על ידי יחסי פלואורסצנטיות.

מימן תוך-תאי נמדד באמצעות יחסי פלואורסצנטיות של B-C-E-C-F am. עם הוספת הסידן יונו ארבעה יונים מיצין סידן זורם לתוך התא וגורם לעלייה ביחס הקרינה. לתוספת של ולמי יש השפעה הפוכה הגורמת לאשלגן לזרום החוצה מהתא, מה שמסומן על ידי ירידה ביחס הקרינה.

B-C-E-C-F מאפשר מדידה של pH תוך-תאי, עקומות כיול ראשונות נעשות במאגרים שונים של pH ידוע. ירידה ביחס הקרינה של הצבע מקבילה לירידה ב-pH. ניתן לראות זאת עם תוספת של פרוטון כוח CCCP, הקו השחור, ולאחר הוספת מפזר כוח מניע פרוטון הקו הכחול.

החץ השני מראה תוספת של ניסין, המאזנת את ריכוזי המימן התוך-תאיים והחוץ-תאיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד דפולריזציה של הממברנה, שלמות הממברנה וריכוזים תוך-תאיים של יונים בתאי חיידקים. אתה אמור להיות מסוגל להשתמש בפרוטוקול זה כנקודת התחלה לחקר תכונות ותאי חיידקים אחרים.