בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מבנים מבוססי פיברין שניתן להשתמש בהם כדי לחקור ארגון מחדש של תאים וקולגן. זה מושג על ידי בידוד תאי ספנוס ורידיים אנושיים מרקמת התורם והרחבתם בתרבית. השלב השני הוא הדבקת רצועות סקוטש על ממברנות גמישות.

בתחתית שש לוחות באר ליצירת חלל מרובע במרכז, שיחזיק את המבנה. לאחר מכן, תערובת של תאי תרומבין פיברינוגן וחרוזים עם תווית פלואורסצנטית מתווספת לחלל שבין רצועות הסקוטש ומותר לה להתפלמר ליצירת ג'ל. השלב האחרון הוא להתנות את התאים ולגרום להיווצרות מטריצה מכוונת על ידי הפעלת מתח מחזורי חד צירי על המבנה או על ידי שחרור מתח סטטי.

על ידי חיתוך ג'ל הפיברין מעמודי הסקוטש בכיוון אחד. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המתארות שינויים בארגון מחדש של התאים והקולגן על ידי ניטור המבנים לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שיפוץ הקולגן הנוגעות למהירות היווצרות הקולגן והכיוון מחדש על ידי סוגי תאים שונים.

כדי להתחיל, רכשו רקמת תורם אנושי מהסאנה מגנה הוורידית בהתאם להנחיות לשימוש משני בחומר. לאחר מכן בודד את תאי הספנוס הוורידי האנושי או H VSCs מהרקמה על ידי ביצוע הפרוטוקול של שנל ועמיתיו, ואחסן אותם בחנקן נוזלי. בעת הצורך, הרחיבו את התאים על ידי הנחת בקבוקון אחד המכיל 250,000 VSCs H להפשרה מהירה לתוך בקבוק T 75 עם 15 מיליליטר של גידול טרום חם.

בינוני המורכב מ-440 מיליליטר DMEM מתקדם 50 מיליליטר סרום בקר עוברי. חמישה מיליליטר של 100 X עט סטרפטוקוקוס וחמישה מיליליטר של 200 מילי-מולרי L glut מקסימום. החלף את מצע הגידול כל יומיים-שלושה למשך כשבועיים עד שהתאים מתלכדים.

לאחר התכנסות, קצרו ופצלו את התאים עד למעבר. תשע. שימוש בטריפסין עד שיהיה מספר מספיק של תאים לניסוי המתוכנן. נדרשים כ-1.5 מיליון תאים לכל מבנה.

כאשר גדל מספר מספיק של תאים, קצור אותם בשטף של 90% ולאחר מכן השהה את התאים במצע גידול ב-15 מיליון תאים למיליליטר. הניחו אותם על קרח עד שהם נחוצים. הכן דבק סיליקון על ידי ערבוב האלסטומר וחומר הריפוי ביחס של 10 לאחד.

השתמש בדבק זה כדי לחבר רצועות של שבעה מילימטר על שלושה מילימטר שנתפסו מהצד הרך של הסקוטש לקרום הגמיש של לוחות תאים גמישים. ליצירת צורת צלב עם מרכז פתוח, יבשו את דבק הסיליקון למשך הלילה בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס כדי להבטיח התקשות של הדבק. לאחר מכן יש לעקר את הצלחת על ידי הוספת חמישה מיליליטר של 70% אתנול לכל באר ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

שוטפים את הבארות שלוש פעמים עם PBS סטרילי. לאחר מכן הסר את ה- PBS מהבארות ורצועות הסקוטש. הנח את הצלחת ללא כיסוי מתחת למנורת ה-UV של מכסה מנוע לתרבית רקמות למשך 30 דקות כדי לעקר את המשטחים.

בסיום, מכסים את הצלחת ושומרים אותה סטרילית עד לשימוש. לאחר מכן, הכינו מדיום הנדסת רקמות על ידי הוספת 130 מיליגרם של חומצה אלית, שני פוספט ל-500 מיליליטר של מצע גידול במהלך שבעת הימים הראשונים של התרבית. כמו כן, הוסף מיליגרם אחד למיליליטר חומצה אמינוקפרואית אפסילון כדי למנוע את פירוק הפיברין, ממיס פיברינוגן לריכוז של 10 מיליגרם חלבון בפועל למיליליטר של הנדסת רקמות מדיום בתוספת חומצה אמינוקפרואית על ידי ערבוב עדין.

ואז סטרילי. מסננים את תמיסת הפיברינוגן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרון ומאחסנים אותה על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, הכינו את תמיסת התרומבין על ידי דילול תרומבין מלאי לריכוז סופי של 10 יחידות בינלאומיות למיליליטר במדיום הנדסת רקמות בתוספת חומצה אמינוקפרואית ואחסנו אותה על קרח עד לשימוש.

במקום הבא, 100 מיקרוליטר של תרחיף התא שהוכנו קודם לכן לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה עבור כל מבנה רקמה שייווצר. צנטריפוגה של התאים בעוצמה של 350 פעמים G למשך שבע דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת התרומבין והוסיפו ארבעה מיקרוליטר, מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות כחולות שישמשו כסמני ייחוס פנימיים. לאחר מכן, צייר 50 מיקרוליטר מתמיסת הפיברינוגן לקצה פיפטה.

הגדל את נפח הפיפטה ל -100 מיקרוליטר ולאחר מכן פיפטה את תמיסת 50 המיקרוליטר של פיברינוגן לתוך צינור הצנטריפוגה. עם תערובת התרומבין והתאים, מערבבים בעדינות את התרומבין והפיברינוגן יחד על ידי יצירת תערובת של 100 מיקרוליטר למניעת היווצרות בועות. לאחר שהתמיסה מעורבבת היטב, פיפטה את תערובת הג'ל לתוך ובין רצועות הסקוטש אנו מגיעים במהירות כזמן הג'ליאני הטיפוסי לג'ל הפיברין, לאחר הערבוב הוא בסדר גודל של 20 שניות, דגרו את המבנים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לח של 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר להם לג'ל.

לאחר מכן הוסיפו שישה מיליליטר של מדיום להנדסת רקמות עם חומצה אמינוקפרואית לכל באר, והניחו את הצלחת בחזרה לאינקובטור. החלף את המדיה כל יומיים-שלושה במשך שבעת הימים הראשונים. לאחר שבוע, הסר את תוסף החומצה האמינוקפרואית מהמדיה והמשיך לתרבית את הג'לים עם המדיה להנדסת רקמות.

עדיין החלפתו כל יומיים-שלושה במהלך חמשת הימים הראשונים בתרבית, מאפשרים למבנים לדחוס ולהתארגן מחדש תחת מתח סטטי היוצר סיבי קולגן, באופן דו-צירי עקב אילוצי הסיבים לגרום לארגון מחדש של קולגן בכיוון אחד בתנאים סטטיים. ראשית, תרבית את התאים למשך שבוע נוסף ביום ה-12, חתך את מבנה הרקמה משתי רצועות סקוטש בכיוון אחד. זה יגרום למתח בכיוון ההפוך כאשר הפיברין מתכווץ.

לחלופין, להעמסה מחזורית, הנח את הלוחות על גבי סט עמודי טעינה בלוחית בסיס תא גמיש, המצוידת באטם ביום השישי, עמודי הטעינה יתמכו בקרום הגמיש של הבארות ויאפשרו למשוך את בסיס העמודים כלפי מטה כדי ליצור מתח בכיוון אחד. לאחר מכן, הגדר את פרוטוקול התוכנה כדי להחיל מתח מחזורי על המבנה. התוכנית המוצגת כאן מיועדת למתח לסירוגין הדומה לגל סינוס, מאמץ המבנה מאפס ל-5% מתח בהרץ אחד לפרקי זמן של שלוש שעות, לסירוגין עם שלוש שעות מנוחה.

כשהתוכנית מוכנה, הפעל את משאבת הוואקום והתחל את התוכנית. הבקר יווסת את חוזק הוואקום במערכת, אשר מושך כלפי מטה את הממברנות סביב עמודי התמיכה כדי להפעיל עומס מחזורי על המבנים בהתאם לתוכנית. הפעל את התוכנית במשך שבוע והקפד להחליף את המדיה כל יומיים-שלושה לאחר שבוע של התניה לגרום לארגון מחדש של קולגן על ידי סיבוב העמוד המלבני ב-90 מעלות כדי לשנות את כיוון המתח למשך שלושה ימים.

כדי לדמיין שיפוץ קולגן פעיל בזמן אמת, הוסף כתום מעקב תאים. הוסף ריכוז של ארבעה מיקרומולר כדי לצבוע את הציטופלזמה ו-CNA 35 OG 4 88. הוסף ריכוז של מיקרוטולר אחד כדי לדמיין את סיבי הקולגן.

בדיקות אלו לא יפריעו לכדאיות התאים או להיווצרות הקולגן. לאחר מכן דגרו על התאים למשך שעה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר את לוחית התרבית מהחממה והעבר אותה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי כדי להמחיש תאים וקולגן.

צלם תמונות של הג'לים על פני השטח ועד כ-60 מיקרון לתוך הפיגום על מנת לראות את השינויים בארגון ברמות אלה לאורך זמן. לאחר מכן החזר את הצלחת למערך המיזוג המכני בתוך החממה. חזור על הליך זה כל כמה ימים כדי לעקוב אחר התקדמות הארגון מחדש של התאים בתגובה לגירויים.

המיקרוספירות הפלואורסצנטיות שנוספו לתערובת הפיברינוגן לפני הפילמור נלכדות ברשת הפיברין ופועלות היטב כסמני ייחוס כדי להבטיח הדמיה של אותו אזור בנקודות זמן שונות בעת תרבית בתנאים סטטיים ונצמדות לכל ארבעת העמודים. לא ניתן לראות סיבים אמיתיים או כיוון סלולרי שלושה ימים לאחר חיתוך שניים מחיבורי עמוד הסיבים. המתח החד-צירי הנגרם על ידי התכווצות יישר את סיבי הקולגן המוצגים בירוק.

תאים ספניים ורידיים אנושיים שעברו מתיחה מחזורית בכיוון אחד במשך שבוע מוצגים כאן על פני המבנה ו-60 מיקרון לתוך הג'ל. כאשר כיוון המתח סובב ב-90 מעלות, התגובה התאית לאחר שלושה ימים נמצאה מהירה יותר על פני השטח מאשר בליבת הרקמה. לאחר שליטה בהנדסה, ניתן לבצע מבני רקמות מבוססי FI אלה תוך כשעתיים.