הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

המטרה הכללית של הליך זה היא לפתח אסטרטגיה פשוטה ויעילה לקיבוע של כל חלבון רצוי על הידרוג'לים של poly acrylamide, במטרה לשלוט באופן עצמאי בפרמטרים שונים של המיקרו-סביבה של התא. דבר זה מושג תחילה על ידי פריסת תמיסת החלבון על פני השטח של חותמת ה-PDMS. השלב השני הוא ייבוש זהיר של פני השטח המובנים של חותמת ה-PDMS באמצעות זרימה קבועה של גז חנקן בדרגת טוהר גבוהה.

בשלב הבא, מניחים את החותמת המצופה בחלבון כך שהמשטח המובנה יהיה במגע עם פני השטח של ההידרוג'ל המיובש, ומפעילים נקודות לחץ קצרות בחלקו העליון של חותמת ה-PDMS כדי להבטיח מגע טוב בין המאפיינים המיקרוסקופיים של החותמת לבין פני השטח של ההידרוג'ל. השלב הסופי הוא הסרה עדינה של חותמת ה-PDMS מפני השטח של ההידרוג'ל וניקוי החותמת לאחר סימון אזורי האי-הדפסה. בעזרת BSA ניתן להנחית תאים על פני השטח של ההידרוג'ל בעל התבנית המיקרוסקופית. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך כדי לצפות במאפייני החלבון המיקרוסקופיים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההעברה המכנית (mechano transduction), כגון התרומה היחסית של תכונות המטריצה החוץ-תאית, לדוגמה קשיחות, צפיפות ליגנדים תאיים או מהות החלבון. בתהליך ה-ano transaction, מומלץ לבצע הליך זה במנדף כימי. התחילו בהנחת לבישי זכוכית עגולים בקוטר 25 מילימטר בתוך צלחת פטרי ומריחת תמיסת sodium hydroxide בריכוז 0.1 molar עליהם למשך חמש דקות.

הסיר את תמיסת נתרן ההידרוקסיד והטבל את לבישי הזכוכית (cover slips) באופן מלא ב-DD H2O סטרילי; נער בעדינות במשך 20 דקות על פלטת ניעור, נקז את ה-DD H2O הסטרילי, הוסף עוד DD H2O סטרילי כדי להטביל את לבישי הזכוכית באופן מלא ונער בעדינות למשך 20 דקות נוספות. הסר את לבישי הזכוכית באמצעות פינצטה סטרילית והנח אותם בצלחת פטרי חדשה. ייבש את לבישי הזכוכית בזרימה קבועה של גז חנקן בטוהר גבוה, כאשר הצד הפעיל פונה כלפי מעלה.

לאחר שזכוכיות הכיסוי התייבשו, העבירו אותן בחזרה למנדף התרבית הסטרילי ומריחו שכבה דקה של trimethyl propyl acrl בצד הפעיל של כל זכוכית כיסוי למשך שעה אחת. לאחר שעה, שטפו את זכוכיות הכיסוי ביסודיות ב-DD H2O סטרילי.

לאחר מכן, טבול את לוחות כיסוי המיקרוסקופ ב-DD H2O סטרילי בתוך צלחת פטרי חדשה. אטום את צלחת הפטרי בעזרת פארא-פילם (para film) והנח אותה על לוח נדנדה תחת ערבוב עדין למשך 10 דקות. לבסוף, השתמש בפינצטה סטרילית בעלת קצוות דקים כדי להעביר את לוחות הכיסוי מה-DD H2O לצלחת פטרי חדשה.

כאשר הצד הפעיל פונה כלפי מעלה. כסו את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הידבקות אבק לכיסויי הזכוכית (cover slips) ואחסנו בטמפרטורת החדר במקום יבש. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו 5 mL של תמיסת הידרוג'ל סטרילית של hydroxy poly acrylamide ו-100 µL של תמיסת ammonium per sulfate טרייה בריכוז 10%.

כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול, הוסיפו 2.5 µL של tetra methylene diamine, ו-25 µL של תמיסת ammonium per sulfate לתמיסת ה-hydroxy poly acrylamide hydrogel. כדי להתניע את הפולימריזציה, ערבבו את התמיסה באמצעות שלושה שלבי פיפטור רצופים ללא הכנסת בועות, בתנאים סטריליים תחת מ这篇文章מנשף סטרילי; הניחו טיפה של 25 µL של תמיסת ה-hydroxy poly acrylamide hydrogel על cover slip מעגלי בקוטר 25 mm, והניחו מיד מעליה cover slip זכוכית מעגלי בקוטר 22 mm כדי לדחוס את תמיסת ה-hydroxy poly acrylamide hydrogel. ה-cover slip זכוכית בקוטר 22 mm הופעל מראש באמצעות חשיפה למשך שבע דקות במנקה UV ozone.

מרכזו את כיסוי הזכוכית בעזרת פינצטה סטרילית והחליקו בועות אוויר אם קיימות. הניחו להידרוג'ל ה-hydroxy poly acrylamide להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הפכו ידנית את שאר תמיסת הידרוג'ל ה-hydroxy poly acrylamide בתוך המבחנה.

כדי לעקוב אחר השלמת תהליך הפולימריזציה, טבולו את לוחות הכיסוי לחלוטין ב-sterile DD H2O. הפרידו בזהירות את לוח הכיסוי מזכוכית בגודל 22 מילימטר על ידי החדרת קצה של להב תער בין לוח הכיסוי מזכוכית בגודל 22 מילימטר לבין שכבת ה-hydroxy poly acrylamide hydrogel. שטפו את ה-hydroxy poly acrylamide hydrogel שלוש פעמים ב-sterile PBS והשאירו את הג'ל טבול לחלוטין ב-sterile PBS כדי לשמור על ההידרציה.

חותמות המיקרו מ-poly dimethyl siloxane או PDMS ששימשו בהליך זה יוצרו כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הניחו את חותמות המיקרו של ה-PDMS בתמיסת אתנול ומים ביחס של 50 ל-50 ובצעו סוניקציה למשך 15 דקות. ייבשו את החותמות באמצעות זרם של חנקן והניחו אותן כאשר התבנית פונה כלפי מעלה במכשיר לניקוי UV ozone למשך שבע דקות.

מתחת למכסה סטרילית, הנח טיפה של 150 µL של תמיסת חלבון רצויה על פני השטח בעלי המבנה המיקרוסקופי של A-P-D-M-S. בהדגמה זו נעשה שימוש בחלבון FI nin. פזר את תמיסת החלבון על פני השטח של החתם על ידי הזזתה בעזרת קצה של פיפטה סטרילית לעבר כל אחת מפינות החתם.

השאירו את תמיסת החלבון להיספג על חותמת ה-PDMS למשך 60 דקות. תחת מנדף סטרילי זה, כבו את המנורות כדי למנוע נזק לחלבון. לאחר מכן, העבירו את לביבות הזכוכית (cover slips) המצופות בהידרוג'ל hydroxy poly acrylamide לצחנת פטרי חדשה.

הסר את עודפי ה-PBS מפני השטח של תשתי ה-hydroxy poly acrylamide hydrogel באמצעות זרם חנקן נמוך תחת תנאים סטריליים. הפסק את הפעולה ברגע שלא נצפה עוד עדות למים עומדים על פני השטח של הג'ל.

אין לייבש את הג'ל לחלוטין בשלב זה. ייבשו בזהירות את המשטח המובנה של חותמת ה-PDMS באמצעות זרימה קבועה של גז חנקן בדרגת טוהר גבוהה. אחזו בחותמת המצופה בחלבון בעזרת פינצטה רפואית והניחו את המשטח המובנה במגע עם פני השטח המיובשים של ההידרוג'ל.

הפעילו נקודות לחץ קצרות בעזרת קצה הפינצטה בחלקו העליון של חותמת ה-PDMS כדי להבטיח מגע טוב בין המבנים המיקרוסקופיים של החותמת לבין פני השטח של ההידרוג'ל, והשאירו את חותמת ה-PDMS על פני השטח של ההידרוג'ל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הסירו בעדינות את חותמת ה-PDMS מההידרוג'ל מסוג hydroxy poly acrylamide בעזרת פינצטה כירורגית, ונקו את החותמת על ידי השריה בתמיסת אתנול ומים למשך 15 דקות. שטפו את ההידרוג'ל מסוג hydroxy poly acrylamide שהוחתם באופן יסודי באמצעות שלושה סבבים של PBS בתנאים סטריליים, למשך 10 דקות לכל סבב.

לאחר שטיפת ה-PBS האחרונה, הוסיפו תמיסה סטרילית של BSA והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תחת ערבול עדין על גבי פלטת נדנדה. פעולה זו תחסום את האזורים שאינם מודפסים למחרת. שטפו את הידרוג'ל ה-hydroxy poly acrylamide שהוטבע באופן יסודי באמצעות שלושה החלפות של PBS בתנאים סטריליים למשך 10 דקות לכל החלפה.

ניתן לאחסן הידרוג'לים של hydroxy poly acrylamide המוטבעים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. התוצאות מראות מתאם ליניארי בין התפתחות הקשיחות של הידרוג'לים של hydroxy poly acrylamide לבין כמות ה-bis acrylamide crosslinker. תמונות epi fluorescent של מיקרו-דפוסים מלבניים למינריים שהורספו על גבי הידרוג'לים של hydroxy poly acrylamide בשלוש דרגות קשיחות שונות מדגימות כיוונון עצמאי של גאומטרית המיקרו-דפוס ושל קשיחות המטריצה. ניתן לווסת את צפיפות הליגנדים התאיים על ידי שינוי ריכוז תמיסת החלבון המשמשת להדגרת חותמות ה-PDMS.

מוצגות כאן שתי תמונות פלואורסצנטיות מהדפסות מיקרו-מגע (micro contact printings) רצופות. פסים של פיברונקטין באדום ולמינין בירוק, המוצלבים בזווית של 90 מעלות, ופסי פיברין, למינין וקולגן שהודפסו במיקרו באופן רצופי על תשתית של הידרוג'ל הידרוקסי פולי-אקרילאמיד ב-25 kilo pascal. כאשר תאים ראשוניים הונחו על משטחי הידרוג'ל הידרוקסי פולי-אקרילאמיד בעלי ציפוי הומוגני ודפוסי מיקרו, חיוניות התאים הייתה לפחות 80% עד שלושה ימים לאחר ההנחה.

כמו כן, נצפה כי התאים שוכפלים יותר על מצעים קשיחים בהשוואה למצעים רכים. כאשר הונחו על מיקרו-תבניות מלבניות מצופות פיברונקטין שהופקדו על הידרוג'לים של הידרוקסי-פולי-אקרילאמיד בשלוש דרגות קשיחות שונות, הפגינו תאי אנדותל ראשוניים צפיפות נמוכה של סיבי אקטין וגרעין עגול על המצע הרך.

על מצעים קשיחים יותר, סיבי האקטין ישרים ועבים יותר והגרעין מעוות לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום ההעברה המכנית (mechanical transduction) לבחון את התפקיד האינדיבידואלי של פרמטרים של הסביבה המיקרוסקופית של התא במגוון רחב של מערכות תאיות, כגון תאים ראשוניים או תאי גזע, ברמת רקמה, אורגניזמי מודל, או מערכות דמוגרפיות ואיברים.