הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח אסטרטגיה פשוטה ויעילה לקיבוע כל חלבון מעניין על הידרוג'לים פולי אקרילאמיד על מנת לשלוט באופן עצמאי בפרמטרים שונים של מיקרו-סביבת התא. זה מושג על ידי פיזור תמיסת החלבון על פני משטח חותמת ה-PDMS. השלב השני הוא לייבש בזהירות את המשטח המובנה של חותמת ה-PDMS עם זרימה קבועה של גז חנקן בטוהר גבוה.

לאחר מכן, החותמת המצופה בחלבון ממוקמת עם משטח מובנה במגע עם משטח ההידרוג'ל המיובש ונקודות לחץ קצרות מוחלות על החלק העליון של חותמת ה-PDMS כדי להבטיח מגע טוב בין תכונות המיקרו של החותמת למשטח ההידרוג'ל, השלב האחרון הוא להסיר בעדינות את חותמת ה-PDMS ממשטח ההידרוג'ל ולנקות את החותמת לאחר האזורים שאינם מודפסים. עם BSA ניתן לשבת על משטח ההידרוג'ל של דפוס המיקרו. בסופו של דבר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך משמש להתבוננות בתכונות המיקרו של החלבון.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום התמרת המכאנו, כגון התרומה היחסית של תכונות מטריצה חוץ-תאיות, למשל, נוקשות, צפיפות ליגון תאים או אופי החלבון. בתהליך עסקת האנו, מומלץ לבצע הליך זה במכסה אדים כימי. התחל בהנחת החלקות כיסוי זכוכית עגולות בקוטר 25 מילימטר בצלחת פטרי ומריחת תמיסת נתרן הידרוקסיד 0.1 מולרית עליהן למשך חמש דקות.

הסר את תמיסת הנתרן הידרוקסיד וטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי ב-DD H2O סטרילי נדנד בעדינות במשך 20 דקות על צלחת נדנדה, רוקן את ה-DDH הסטרילי שני O הוסף עוד DDH שני O סטרילי כדי לטבול את החלקות הכיסוי במלואן ולנענע בעדינות למשך 20 דקות נוספות. הסר את החלקות הכיסוי בעזרת פינצטה סטרילית והניח אותם בצלחת פטרי חדשה. כאשר הצד המופעל פונה כלפי מעלה יבש, הכיסוי מחליק בזרימה קבועה של גז חנקן בטוהר גבוה.

לאחר שהחלקות הכיסוי יבשות, החזירו אותן למכסה המנוע הסטרילי ומרחו שכבה דקה של שלושה טרימתיל פרופיל אקרל על הצד המופעל של כל כיסוי. להחליק למשך שעה לאחר שעה. שטפו את החלקות כיסוי הזכוכית בהרחבה עם DD H2O סטרילי.

לאחר מכן טבלו את החלקות הכיסוי ב-DD H2O סטרילי בצלחת פטרי חדשה. אוטמים את צלחת הפטרי בניילון פרה ומניחים אותה על צלחת נדנדה תחת תסיסה עדינה למשך 10 דקות. לבסוף, השתמש בפינצטה סטרילית עם קצוות עדינים כדי להעביר את פתקי הכיסוי מה-DDH two O לצלחת פטרי חדשה.

עם הפנים המופעלות כלפי מעלה. מכסים את הכלי בנייר אלומיניום כדי למנוע הידבקות אבק להחלקות הכיסוי ושומרים בטמפרטורת החדר במקום יבש. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו חמישה מיליליטר של תמיסת הידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד סטרילית ו -100 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום טרייה של 10% לסולפט.

כמתואר בטקסט הפרוטוקול, הוסף 2.5 מיקרוליטר של טטרה מתילן דיאמין ו-25 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום לסולפט לתמיסת הידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד. כדי להתחיל את הפילמור, ערבבו את התמיסה על ידי שלוש פיפטינג רצופות ללא הכנסת בועות בתנאים סטריליים מתחת למכסה מנוע סטרילי, הניחו טיפה של 25 מיקרוליטר של תמיסת הידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד על החלקת כיסוי עגולה של 25 מילימטר והניחו מיד החלקת כיסוי זכוכית עגולה של 22 מילימטר על גבי הטיפה כדי לסחוט את תמיסת ההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד. החלקת כיסוי הזכוכית בגודל 22 מילימטר הופעלה בעבר על ידי חשיפה של שבע דקות במנקה אוזון UV.

מרכז את החלקת מכסה הזכוכית בפינצטה סטרילית והחליק את כל הבועות. אפשר להידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הפוך ידנית את תמיסת ההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד שנותרה בצינור.

כדי לעקוב אחר השלמת תהליך הפילמור, טבלו את החלקות הכיסוי במלואן עם D DH סטרילי שני o. הפרד בזהירות את החלקת כיסוי הזכוכית בגודל 22 מילימטר על ידי הכנסת קצה סכין הגילוח בין החלקת כיסוי הזכוכית 22 מילימטר לשכבת ההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד. שטפו את ההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד שלוש פעמים עם PBS סטרילי והשאירו את הג'ל שקוע לחלוטין ב-PBS סטרילי כדי לשמור על לחות.

חותמות המיקרו פולי דימתיל סואן או PDMS המשמשות בהליך זה יוצרו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הנח את חותמות המיקרו PDMS בתמיסת מי אתנול של 50 עד 50 וסוניקט למשך 15 דקות. יבש את החותמות עם קיטור של זרימת חנקן והניח אותן בתבנית במנקה אוזון UV למשך שבע דקות.

מתחת למכסה מנוע סטרילי, הניחו טיפה של 150 מיקרוליטר של תמיסת חלבון רצויה על פני השטח המיקרו-מובנים של A-P-D-M-S. Stamp FI nin משמש בהדגמה זו. מורחים את תמיסת החלבון על פני משטח החותמת על ידי הזזתה עם קצה פיפטה סטרילי לכיוון כל פינה של החותמת.

השאירו את תמיסת החלבון להיספג על חותמת ה-PDMS למשך 60 דקות. מתחת למכסה המנוע הסטרילי הזה, כבה את המנורות כדי למנוע נזק לחלבון. לאחר מכן, העבירו את הכיסוי המצופה הידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד לצלחת פטרי חדשה.

הסר עודפי PBS מפני השטח של מצעי הידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד עם זרם החנקן הנמוך בתנאים סטריליים. הפסק את ההליך. ברגע שלא נצפתה עדות למים עומדים על משטח הג'ל.

אין לייבש את הג'ל היטב בשלב זה. יבש בזהירות את המשטח המובנה של חותמת ה-PDMS עם זרימה קבועה של גז חנקן בטוהר גבוה. אחוז בחותמת המצופה חלבון עם מלקחיים של רקמת חבישה והנח משטח מובנה במגע עם משטח ההידרוג'ל המיובש.

החל נקודות לחץ קצרות עם קצה הפינצטה בחלק העליון של חותמת ה-PDMS כדי להבטיח מגע טוב בין תכונות המיקרו של החותמת למשטח ההידרוג'ל, השאר את חותמת ה-PDMS על משטח ההידרוג'ל למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר שעה. הסר בעדינות את חותמת ה-PDMS מההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד עם מלקחיים לרקמות חבישה ונקה את החותמת על ידי זנות בתמיסת מי אתנול למשך 15 דקות. שטפו את ההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד המוטבע בהרחבה על ידי שלוש החלפות של PBS בתנאים סטריליים למשך 10 דקות לכל החלפה.

לאחר שטיפת ה-PBS האחרונה, הוסיפו תמיסה סטרילית של BSA ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס תחת תסיסה עדינה על צלחת נדנדה. זה יאכל את האזורים שאינם מודפסים למחרת. שטפו את ההידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד המוטבע בהרחבה על ידי שלוש החלפות של PBS בתנאים סטריליים למשך 10 דקות לכל החלפה.

ניתן לאחסן הידרוג'לים הידרוקסי פולי אקרילאמיד מוטבעים בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. התוצאות מראות מתאם ליניארי בין התפתחות הנוקשות של הידרוג'לים הידרוקסי פולי אקרילאמיד לבין כמות התמונות הפלואורסצנטיות של ביס אקרילאמיד קרוסלינקר אפי של דפוסי מיקרו מלבניים למינציה המופקדים על הידרוקסי פולי אקרילאמיד הידרוג'לים של שלוש קשיחות שונות מדגימים את הכוונון העצמאי של גיאומטריית מיקרו-דפוס וקשיחות מטריצה. ניתן לווסת את צפיפות הליגנד של התא על ידי שינוי ריכוז תמיסת החלבון המשמשת לדגירת חותמות ה-PDMS.

מוצגות כאן שתי תמונות פלואורסצנטיות מהדפסות מיקרו-מגע עוקבות. פסים של פיברונקטין באדום ולמינין בירוק, מוצלבים ב-90 מעלות ופסי למינין ופיברין וקולגן מודפסים במיקרו ברצף על מצע הידרוג'ל פסקל הידרוקסי פולי אקרילאמיד במשקל 25 קילו. כאשר תאים ראשוניים צופו על משטחי הידרוג'ל הידרוקסי פולי אקרילאמיד מצופים באופן הומוגני ומיקרו, כדאיות התא הייתה לפחות 80% עד שלושה ימים לאחר הציפוי.

כמו כן, נצפה כי התאים מתרבים יותר על מצעים נוקשים בהשוואה למצעים רכים. כאשר מצופים על דפוסי מיקרו מצופים פיברונקטין מלבניים המופקדים על הידרוג'לים הידרוקסי פולי אקרילאמיד בשלוש קשיחות שונות. תאי אנדותל ראשוניים מציגים צפיפות נמוכה של סיבי אקטין וגרעין מעוגל על הרך.

המצעים על מצעים נוקשים יותר, סיבי האקטין ישרים ועבים יותר והגרעין מעוות לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההתמרה המכנית לחקור את התפקיד האינדיבידואלי של הפרמטרים של מיקרו-סביבות התא במגוון רחב של מערכות תאיות כגון תאי גזע ראשוניים, רמת רקמה, אורגניזם מודל, אופנה, דמוגרפיה או מערכות איברים.