כרוני לטווח ארוך

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור זיהום כרוני מתמשך לטווח ארוך של pseudomonas aerogen בדרכי הנשימה של עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי תרבית של זן החיידק הנבחר pseudomonas aerogen. השלב השני הוא הטמעת החיידקים בחרוזי אגר קטנים על ידי ערבוב החיידקים עם אגר ושמן מינרלי בטמפרטורה של 50 °C, ולאחר מכן קירור התערובת בטמפרטורה של 4 °C תחת ערבוב איטי ורציף.

בשלב הבא, השמן המינרלי מוסר על ידי מספר שטיפות עם PBS, ואליקוט של חרוזי האגר עובר הומוגניזציה ופיזור על צלחות אגר. כדי לקבוע את התוכן הבקטריאלי, השלב הסופי הוא הזרקת מספר מיקרוליטרים של תרחיף חרוזי האגר לקנה הנשימה של עכברים ליצירת זיהום ריאתי כרוני של pseudomonas aerogen. לבסוף, ניתן לאסוף נוזל שטיפה ברונכאוולאולרי וריאות בנקודות זמן שונות לאחר החשיפה ולפזרם על צלחות אגר כדי לזהות את אחוז העכברים שנדבקו בזיהום כרוני ואת העומס הבקטריאלי בדרכי הנשימה של העכברים ששרדו. היתרון המרכזי של שיטות חרוזי האגר אלו על פני השיטות הקיימות הוא שהן מאפשרות זיהום כרוני יציב לטווח ארוך באחוז גבוה של עכברים, דבר המוביל להתמדה של עומס בקטריאלי יציב למשך עד חודש אחד.

שיטות ה-AGA מספקות בריאת העכבר תנאי מיקרו-אוורובי המאפשרים לחיידקים לצמוח בצורה של מיקרו-מושבות. בדומה לצמיחה ברירית של חולי סיסטיק פיברוזיס, שיטות אלו יכולות לסייע לחוקרים במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לפתוגנזה של סיסטיק פיברוזיס ומחלות נשימה אחרות, ובבחינת טיפולים חדשניים נגד זיהום ריאתי כרוני של Pseudomonas aeruginosa. ניתן להשתמש בשיטות אלו גם כדי להשיג זיהום כרוני עם פתוגנים אחרים, כולל Burkholderia cepacia או Staphylococcus aureus, או זיהום משולב עם פתוגנים שונים או ניסויי תחרות. את הפרוצדורה ידגימו פנו, פוסט-דוקטורנט, וקמיל ריבה, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי. שלושה ימים לפני החשפת העכבר, יש להעביר לולאה מלאה של Pseudomonas aeruginosa מתרבית מאגר ב-80°C- לתוך צלחת Tryptic Soy Agar ולהדגיר ב-37°C למשך לילה.

ביום למחרת. בחר קולוניה בודדת שהוחדרה ל-5 milliliters של try toay soy broth ודגרה ב-37 degrees Celsius למשך לילה במקטרת נערת במהירות של 200 RPM. למחרת בבוקר, דלל מנה קטנה של תרבית חיידקים מהלילה בתוך phosphate buffered saline ביחס של 1:50. לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 nanometers.

בשלב הבא, דללו את תרבית החיידקים מהלילה על ידי הוספת שני OD של תרחיף החיידקים לשפבור חדש המכיל 20 milliliters של TSB טרי, והדגרימו ב-37 degrees Celsius למשך כשלוש עד ארבע שעות עד לשלב הלוגי (log phase), באינקובטור נערנער ב-200 RPM עד להגעה לערך כולל של 10 עד 50 OD. ברגע ש-pseudomonas aerosa מגיעה לשלב הלוגי, אספו את תאי החיידקים על ידי סנטריפוגציה ב-2,700 ×g למשך 15 דקות ב-4 degrees Celsius והשליכו את העליון (supernatant). לאחר מכן.

יש להשעות את משקע החיידקים ב-1 mL של PBS סטרילי ולערבב ב-vortex ביסודיות עד להשעיה מלאה. לאחר מכן, יש לערבב 1 mL מהתשעיה החיידקית עם 9 mL של TSA נוזלי שהובא לטמפרטורה של 50 °C. יש להוסיף תערובת זו לשמן מינרלי כבד שחומם מראש ל-50 °C.

ערבבו מיד במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. על הערבוב להוות מערבולת נראית לעין בשמן. לאחר מכן, קררו את התערובת ל-4 °C תוך כדי ערבוב במהירות מינימלית למשך 35 דקות.

לאחר מכן, השאירו על קרח למשך 20 דקות נוספות. לאחר מכן, העבירו את חרוזי האגר למבחנות פלקון של 50 מיליליטר וסובבו במערך צנטריפוגה ב-2,700 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

הסר במדויק את השמן המינרלי ושטוף את משקע חרוזי האגר ב-PBS סטרילי. חזור על הפרוצדורה שש פעמים לאחר שלושה שטיפות. ניתן להשקיע את החרוזים באמצעות כבידה במקום להשתמש בצנטריפוגה לאחר השטיפה האחרונה.

שחזר את כדורי האגר ב-20 עד 30 מיליליטר של PBS והומוגן באופן אספטי 0.5 מיליליטר מהכדורים. לאחר מכן, דלל 100 מיקרוליטר מהכדורים ההומוגניים ב-900 מיקרוליטר של PBS סטרילי ובצורה סדרתית. דלל את הכדורים שש פעמים עד ל-10⁻⁶ ביחס של 1 ל-10.

לאחר מכן, פריסו את סדרת המדללים על צלחות TSA, כולל דגימה שאינה מדוללת. דללו את הדגימה עד ל-10⁻⁶ והדגירו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C. מדדו את קוטר החריזים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך במספר שדות ראייה.

קוטר החרוזיקים חייב להיות בין 100 ל-200 מיקרון לפני ההדבקה של העכברים. ספרו את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) על לוחות ה-TSA כדי לקבוע את מספר ה-CFU למיליליטר בתרחיף חרוזיקי האגר. לאחר מכן, התאימו את נפח חרוזיקי האגר ל-2 עד 4 כפולות של 10⁷ CFU למיליליטר כדי להגיע למוסף (inoculum) אופטימלי של 1 עד 2 כפולות של 10⁶ ב-50 µL.

הנח עכבר זכר בן שש עד שמונה שבועות, שהורדם בעזרת ketamine ו-xylazine, במצב שכיבה על גב (supine) על משטח חימום, וחטא את פרוותו באמצעות 70% ethanol. חשוף את הקנה באמצעות חיתוך אנכי של העור. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להפריד את השרירים המכסים את הקנה.

לאחר מכן, שאבו עד 50 µL מתליית חרוזי האגר באמצעות מזרק של 1 mL. לאחר מכן, בצעו אינטובציה של הקנה באמצעות קטטר וחברו את מזרק ה-1 mL עם תליות חרוזי האגר לקטטר. דחפו בעדינות את בוכנת המזרק כדי לאפשר את השתלת החרוזים לתוך הריאה.

לאחר מכן, סגרו את החתך באמצעות קליפסים לתפרים. בשלב זה, הניחו את העכבר שהורדמה במצב שכיבה על הגב וחטאו את פרוותו ב-70% ethanol.

בשלב הבא, חשפו את הקנה ואת כלוב בית החזה באמצעות חתך אנכי בעור. לאחר מכן, חשפו את הריאות על ידי חיתוך הסרעפת. השחילו חוט תפירה מתחת לקנה באמצעות פינצטה ובצעו אינטובציה של הקנה באמצעות קטטר.

לאחר מכן, משוך את שני קצות חוט התפירה כדי לקשור את הקטטר לקנה הנשימה, ולא את החוט סביב קנה הנשימה. כעת קח מיליליטר אחד של מצע תרבית תאים באמצעות מזרק של 1 mL וחבר אותו לקטטר. דחף את בוכנת המזרק כדי לשטוף את הריאות, ואסוף מיד את הנוזל ואחסנה אותו במבחנה של 15 mL.

חזור על שלב זה שלוש פעמים עם סה"כ 3 mL של מצע, ולאחר מכן שמור את נוזל שטיפת הסימפונות והנאדימים (bronchoalveolar lavage fluid) על קרח לצורך איסוף וניתוח הריאות. הוצא את הריאות מהעכבר. שטוף אותן ב-PBS סטרילי.

לאחר מכן הפרד את האונות. העבר אותן למבחנה בעלת תחתית עגולה עם 2 mL של PBS סטרילי ושמור על קרח. בצע הומוגניזציה אספטית של הריאות באופן סדרתי.

דללו את ההומוגנאט ב-PBS ביחס של 1:10. לאחר מכן, זרעו דילולים סדרתיים, כולל את הדגימה ללא דילול, על צלחות TSA והדגימו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. הוציאו את נוזל ה-BAL מהקרח ודללו אותו עם תמיסת Turk ביחס של 1:2 תחת מיקרוסקופ אור פתוך הפוך.

לספירת המספר הכולל של התאים בתא ספירה מסוג Bürker לצורך ספירה דיפרנציאלית, סבבו את נוזל ה-BAL בצנטריפוגה במהירות של 330 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) בריכוז של 1 מיליון תאים למל בתוך מצע גידול תאים המכיל 10% fetal bovine serum. הניחו את תגליות המיקרוסקופ ואת המסננים בחריצים המתאימים ב-cytospin, כאשר המסננים מקרטון פונים למרכז המכשיר.

העבירו בפיפטה 150 µL מכל דגימה לבארים המתאימות של הסייטוספין (cytospin) וסובבו בציטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש להבחין בכתם של תאים; לאחר צביעת הכתם ניתן לבצע ספירה דיפרנציאלית תחת המיקרוסקופ. איור זה מציג את מהלך הזמן של זיהום כרוני של *Pseudomonas aeruginosa* עם זן הייחוס PAO1 ועם RP73.

זן קליני עבור כל נקודת זמן. ההיסטוגרמות מייצגות את אחוז התמותה שנגרמה על ידי בקטרמיה באדום ואת ההישרדות באפור, או את אחוז בעלי החיים שסלקו את הזיהום בלבן, ואלו שהצליחו לפתח זיהום כרוני בירוק. הזן הקליני pseudomonas aerogen RP 73 יעיל יותר ביצירת זיהום כרוני בהשוואה לזן המעבדה PA oh one.

עכברים ששרדו הוקרבו בנקודות הזמן המצוינות והריאות הוסרו, עברו הומוגניזציה ונזרעו על צלחות TSA כדי לקבוע את העומס החיידקי. עקומות הצמיחה של זני P oh one ו-RP 73 בריאות העכברים מראות כי כמות החיידקים שלושה ימים לאחר ההדבקה גבוהה יותר עבור P oh one בהשוואה ל-RP 73. לאחר מכן, מהיום השביעי ואילך, כאשר התבססה זיהום כרוני, העומס החיידקי התייצב בין 10⁴ ל-10⁵ CFU לריאה עבור שני הזנים. לאחר שבעה ימים של זיהום כרוני עם זן ה-RP 73 הקליני, הוערך גיוס תאי הדלקת בנוזל BAL.

מספר הלוקוציטים הכולל גבוה באופן משמעותי בעכברים שהודבקו ב-RP 73 בהשוואה לעכברים שאינם מודבקים. התאים הנפוצים ביותר הם נויטרופילים, דבר המעיד על תגובה משמעותית של מערכת החיסון המולדת לזיהום כרוני. בתיבה למטה, החצים מצביעים על נויטרופילים ועל מקרופאג, כפי שנראים בנקודה על שקופית לאחר סבוב ציטוסנטריפוגי (cyto spin).

מוצגים כאן צביעת המטוקסילין ואוזין של חתכים היסטולוגיים של ריאות עכבר לאחר שבעה ימים של זיהום כרוני עם זן קליני rp. 73; ניתן להבחין בחרוזיים המסומנים על ידי חצים בתוך הלומן הברונכיאל ובמושבות מיקרוסקופיות של תאי חיידקים. באזורים המזוהמים, הברונכיה והפרנכימה הריאתית מאופיינים בגיוס מאסיבי של תאי דלקת.

בעוד שדרכי הנשימה של עכבר שאינו מזוהם היו נקיים מתאי דלקת, הקוטר והריכוז הסופי של ה-BES הם פרטים חשובים מאוד. כדי להשיג תוצאה טובה, חשוב לזכור כי גודל החשבון מושפע מקצב השקיעה במהלך שלב הקירור, וכי כמות החיידקים ההתחלתית עשויה להשפיע על הדילול הסופי של החרוזים. יתרה מכך, בחירה של זן pseudomona מתאים, הגורם לתמותה נמוכה של עכברים ולאחוז גבוה של זיהום כרוני, תמזער את מספר העכברים שנעשה בהם שימוש.

לאחר הדבקת העכברים, מבוצע ספירת חיידקים. בנוסף, ניתן לבצע בדיקה של התגובה הדלקתית במונחים של ספירת תאים כוללת ודיפרנציאלית ברמה הברונכיאלית, ניתוח ציטוקינים בנוזל, בדיקת mieloperoxidase וניתוח היסטולוגי, וזאת כדי לחקור את תגובת כיבוי הנזק כתוצאה מזיהום חיידקי. יש לזכור שעבודה עם פתוגנים אופורטוניסטיים כגון pseudomonas עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, טיפול בחיידקים תחת מCבט בטיחות ביולוגית ושימוש בטכניקות סטריליות.

פיתוחם של מודלים רלוונטיים בבעלי חיים אפשר את הבדיקה הפרה-קלינית של מולקולות אנטיבקטריאליות ואנטי-דלקתיות חדשניות. זהו שלב חשוב להתערבויות טיפוליות עתידיות עבור זיהומי ריאה בחולים הסובלים מסיסטיק פיברוזיס או ממחלות נשימה אחרות.