Name: כרוני לטווח ארוך Pseudomonas aeruginosa זיהום דרכי הנשימה בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: למד כיצד ליצור זיהום כרוני בדרכי הנשימה בעכברים באמצעות שיטת חרוזי האגר עם Pseudomonas aeruginosa. שיטה זו מאפשרת שמירה על עומס חיידקי יציב למשך חודש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר במעבדתו של Bragonzi כבר מומן על ידי הקרן האיטלקית סיסטיק פיברוזיס (CFaCore) והאיחוד האירופי-F7-2009-223,670. חלק מהעבודה זו בוצע באביק, מעבדת מיקרוסקופיה מתקדמת, וhistopathology העכבר בוצע ביחידת הפתולוגי האנטומיה (מכון המדעי סאן רפאלה).

1. חיידקים מתכוננים לזיהום כרוני (שלושה ויומיים לפני מאוס אתגר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את פ המתאים זן aeruginosa להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן loopful של פ aeruginosa מ-80 ° C תרבות המניה לצלחת Trypticase סויה אגר (TSA) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבה אחת ולחסן לתוך 5 מיליליטר Trypticase סויה מרק (TSB) בצינור הכתיר הצמד 15 מיליליטר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה בחממה רועדת בסל&quot;ד 200. </li></ol> 2. הטבעת חיידקים בחרוזים אגר לזיהום כרוני (יום אחד לפני הזיהום) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot קטן של תרבות לילה חיידקים, לדלל 1:50 בופר פוספט (PBS) ולמדוד את הצפיפות האופטית (OD) ב600 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות חיידקים בלילה על ידי הוספת 2 OD בצינור הכתיר הצמד חדש המכיל 20 מיליליטר של TSB הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך כ - 34 שעות כדי להיכנס שלב בחממה רועדת בסל&quot;ד 200, עד סכום כולל של 10-15 OD הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את ה-TSA, עשויה TSB עם אגר 1.5%, החיטוי ולאזן על 50 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאזן 150 מיליליטר של שמן מינרלים כבדים preautoclaved בבקבוק Erlenmeyer על 50 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפ aeruginosa מגיע שלב היומן, לאסוף את תאי חיידקים על ידי צנטריפוגה ב2,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור החיידקים ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי ומערבולת ביסודיות כדי resuspend את הכדור לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה חיידקי מערבבים 1 מיליליטר עם 9 מיליליטר של נוזל TSA מראש equilibrated ב50 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את 10 מיליליטר TSA-פ תערובת aeruginosa לנפט כבד מינרלים (prewarmed על 50 מעלות צלזיוס) ומייד מערבבת במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. התסיסה חייבת לייצר מערבולת גלויה בנפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצנן את התערובת עד 4 ° C, תוך ערבוב בsp המינימוםeed ל35 דקות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תערובת שמן אגר חרוזים בקרח במשך 20 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אגר חרוזים ל50 צינורות מיליליטר פלקון ו צנטריפוגות ב 2,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במדויק להסיר את שמן מינרלים ולשטוף עם PBS סטרילי שש פעמים, כמתואר בשלב 2.11. לאחר שלושה שוטף, ניתן pelleted חרוזים על ידי כוח משיכה במקום להשתמש בצנטריפוגות. לאחר השטיפה האחרונה, resuspend אגר חרוזים ב20-30 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של חרוזים (כ 0.5 מיליליטר) וסביבה נקיה מחיידקי homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את של חרוזים הומוגני 100 μl ולדלל ב900 μl של PBS סטרילית. סדרתי לדלל 1:10 עד 10 -6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילול צלחת סידורי על צלחות ה-TSA, כוללים מדגם חי עד 10 -6 דגירה צלחות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את קוטר חרוז באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה במספר תחומים. קוטר חרוז חייב להיות בין 100-200 מיקרומטר ( <strאונג&gt; איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסנו את חרוזים לילה בשעה 4 ° C. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. סקירה של הזיהום בהכנת חרוזים ועכבר אגר. פ תאי aeruginosa הם resuspended ב 1 מיליליטר של PBS, והוסיפו ל9 מיליליטר של ה-TSA הנוזלי (50 מעלות צלזיוס). תערובת זו מתווספת ל150 מיליליטר שמן מינרלים כבד על 50 מעלות צלזיוס בבקבוק ובחש במהירות גבוהה במשך 6 דקות בטמפרטורה בחדר. כאשר הבקבוק הוא מקורר 4 ° C עם ערבוב איטי ל35 דקות, אגר מתמצק יצירת חרוזים, וחיידקים המצויים בתערובת מוטבעים בחרוזים אגר. פירוט של חרוז אגר המכיל תאים חיידקיים מוצג (א &#39;). לאחר הסרת שמן מינרלים עם כמה שטיפות באמצעות PBS סטרילי, ההשעיה אגר חרוזים מוכנה fאו חיסון לריאות של עכברים על ידי הזרקת intratracheal (ב &#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> 3. עכברי אתגר עם אגר-חרוזים הצהרת אתיקה: פרוטוקול וניסוי זה פעלו בהתאם להנחיות מוועדת הטיפול בבעלי החיים ואתיקה של המכון המדעי סאן רפאלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) על צלחות TSA כדי לקבוע את מספר CFU / מיליליטר בהשעיה אגר חרוזים. לדלל את אגר חרוזים עם PBS סטרילי ל2-4 x 10 7 CFU / מיליליטר כדי להגיע לבידוד אופטימלי של 1-2 x 10 6 ב50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי C57Bl/6NCr (ז 20-22, 6-8 שבועות) עכברי זכרים עם קטמין (50 מ&quot;ג / מיליליטר) ו xylazine (5 מ&quot;ג / מיליליטר) ב0.9% NaCl מנוהל בהיקף של 0.002 מיליליטר / גרם משקל גוף על ידי זריקת intraperitoneal. הערה: הרדמה נחשב adequate כאשר החיה נשארת עדיין בשקט, אינו מגיב לגירויים חיצוניים, ויש לו לב ונשימת שיעורים קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה. לחטא את המעיל של העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה על ידי חתך אנכי של העור וצנרר קנה הנשימה עם קטטר סטרילי, גמיש 22 G 0.9 מ&quot;מ x 25 IV מ&quot;מ, שמירה על תשומת לב כדי להסיר את stylette תוך כדי התנועה לתוך קנה הנשימה. הכנס את הקטטר לא עמוק מדי לתוך קנה הנשימה. עצור לפני שהגיע לקארינה (הסתעפות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לקחת נפח של 50 μl של השעיה חרוז אגר על ידי מזרק 1 מ&quot;ל ולצרף אותו לקטטר. דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק, המאפשר את חרוזים שמושתלים לתוך הריאות. סגירת החתך באמצעות קליפים תפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על כרית חימום עד ער לחלוטין. </li></ol> 4. הערכת עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב לעכברים יומיים לסימנים קליניים כוללים באיכות מעיל, יציבה,ניידות, ומצב הידרציה. לפקח על משקל גוף ביום. עכברים שמאבדים ≥ 20% במשקל גוף חייבים להיות מורדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב נקודה 5 לאוסף של נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ונקודות 6 או 7 לאוסף של ריאות והניתוח של CFU סך הכל, ניתוח היסטולוגית, תגובה דלקתית במונחים של ספירת תאים מוחלטת והפרש בBAL, ניתוח ציטוקינים, ו myeloperoxidase פעילות (MPO). </li></ol> 5. אוסף נוזל BAL וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה. לחטא את המעיל של העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את קנה הנשימה ואת כלוב בית החזה על ידי חתך אנכי של העור. לחשוף את הריאות על ידי קיצוץ הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס חוט תפר מתחת לקנה הנשימה באמצעות פינצטה וצנרר קנה הנשימה עם קטטר סטרילי, גמיש 22 גרם 0.9 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ IV. משוך את שני קצוות של חוט התפירה כדי לאגד את catheter לקנה הנשימה ולקשור החוט סביב קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הנפח של 1 מיליליטר של RPMI 1640 באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ולצרף אותו לקטטר. לדחוף את הבוכנה של המזרק כדי לשטוף את הריאות ומייד לשחזר את הנוזל, לאחסן אותו בצינור 15 מיליליטר. שים לב: אם ציטוקינים הם להיות מנותחים, להוסיף מעכבי פרוטאז לRPMI 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה זו שלוש פעמים עם סכום כולל של 3 מיליליטר של RPMI. מעתה והלאה, לאחסן את נוזל BAL על קרח. עבור לשלב 6 לאיסוף והניתוח של ריאות. הערה: אנא שים לב כי לא כל הנוזל להאסף (2.8 מרבי מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות של חיידקים נמצאים בנוזל BAL, לטעום aliquot קטן (300 μl), סדרנו לדלל 1:10 ב PBS סטרילי, צלחת על צלחות TSA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים הכולל שימוש במיקרוסקופ אופטי אור הפוך דילול aliquot של 1:02 נוזל BAL עם פתרון Tuerk בתא ספירת תאים &#39;שודד גופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה remaining נוזל BAL ב330 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C. קח את supernatant לניתוח ציטוקינים ELISA, לאחסן אותו ב -80 ° C. בצע את פעולות 5.10-5.13 לספירת תאי ההפרש ידי cytospin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם גלולה היא אדומה, lyse אריתרוציטים resuspending גלולה ב 250-300 μl של חיץ תמוגה RBC מדולל 1:10 ב מים מזוקקים אולטרה טהור במשך 3 דקות. לנטרל עם 2 מיליליטר PBS ו צנטריפוגות ב 330 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 10% בסרום שור עוברי RPMI (FBS). השתמש בנפח שיספק 1 x 10 6 מיליליטר תאים /, המבוסס על סך ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות מיקרוסקופ ומסננים לחריצים מתאימים בcytospin עם מסנני הקרטון מול מרכז cytospin. פיפטה 150 μl של כל דגימה לתוך הבארות המתאימות של cytospin ו צנטריפוגות בcytocentrifuge XG 300 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם שקופיות על ידי Romanowsky מכתים באמצעות ערכה מסחרית, על פי maההוראות של nufacturer וכפי שתואר לעיל 12. בצע את פעולות 5.14-5.17 לניתוח פעילות MPO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הנפח הנותר של BAL ב380 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 250 μl של כלוריד Hexadecyltrimethylammonium 0.5% במים מזוקקים אולטרה טהור לlyse התאים. ההשעיה יכולה להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני ביצוע assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 16,000 ל30 דקות ב 4 ° C ולהשתמש supernatant לבצע assay MPO בצלחות 96 היטב, ומוסיף את המדגם בשני עותקים לכל טוב ואם יש צורך, גם דילולים הנכונים של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לכל דגימה בבארות נפח שווה של 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) כמצע לperoxidase. לאפשר התגובה לתתקיים בחושך במשך 5 דקות לפחות ועד שלא יהיה התפתחות נוספת בצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 2 MH 2 SO 4nd למדוד את OD ב 450 ננומטר. ערך OD יהיה ביחס ישר לפעילות peroxidase. </li></ol> 6. מדידה של עומס בקטריאלי בריאה וציטוקין ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר איסוף נוזל BAL, ריאות בלו מהעכבר, יש לשטוף אותם בPBS סטרילי, אונות נפרדות, לשים אותם בצינור מסביב לתחתית עם 2 מיליליטר של PBS סטרילי ולאחסן על קרח. שים לב: אם ציטוקינים הם להיות מנותחים, להוסיף מעכבי פרוטאז לPBS לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מהחיידקים homogenize ריאות, לקחת aliquot קטן (300 μl) מhomogenate, סדרנו לדלל 1:10 ב-PBS, צלחת על צלחות TSA ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. שים לב שסך עומס החיידקים בדרכי האוויר יהיה הסכום של CFUs נמצא בנוזל BAL וריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate שנותר בXG 16,000 ל30 דקות ב 4 ° C. קח את supernatant לניתוח ציטוקינים ELISA, ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol> 7. בדיקה היסטולוגית &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח היסטולוגית רק על הריאות שבנוזל BAL לא נאסף, כדי לשמר את היבט ריאות ומאפיינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר על ידי CO 2 שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את כלוב בית החזה על ידי חתך אנכי של העור, לחשוף את הריאות על ידי חיתוך הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאות והבלו, לשטוף אותם ב-PBS, להפריד בין האונות, לשים אותם בצינור המכיל פורמלין 5-10 מיליליטר 10% ניטראליים שנאגרו (פורמלין 4%) ולאחסן ב 4 ° C המוגנים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאות להטביע בפרפין, באמצעות נהלים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 5 מיקרומטר חלקים עבים באמצעות microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות כתם עם hematoxylin ו eosin ולכסות את השקופיות עם coverslip, על פי נהלים קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ brightfield הפוך ולרכוש תמונות על ידי חיבור למיקרוסקופ למצלמה. </li></ol>

<ol><li>Gibson, R., Burns, J. L., Ramsey, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+management+of+pulmonary+infections+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. 168, 918-951 (2003).</li>
<li>Bragonzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+acute+and+chronic+lung+infection+with+cystic+fibrosis+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Murine models of acute and chronic lung infection with cystic fibrosis pathogens.</a> IJMM. 300, 584-593 (2010).</li>
<li>Cash, H. A., McCullough, B., Johanson, W. G. Jr, Bass, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+respiratory+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 119, 453-459 (1979).</li>
<li>Starke, J. R., Langston, C., Baker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+chronic+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa+and+Pseudomonas+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas cepacia.</a> Pediatr. Res. 22, 698-702 (1987).</li>
<li>Pedersen, S. S., Hansen, B. L., Hansen, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+with+P.+aeruginosa+entrapped+in+alginate+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection with P. aeruginosa entrapped in alginate microspheres.</a> APMIS. 98, 203-211 (1990).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmucoid+Pseudomonas+aeruginosa+expresses+alginate+in+the+lungs+of+patients+with+cystic+fibrosis+and+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nonmucoid Pseudomonas aeruginosa expresses alginate in the lungs of patients with cystic fibrosis and in a mouse model.</a> J. Infect. Dis. 192, 410-419 (2005).</li>
<li>van Heeckeren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim%22%5BJournal%5D)">Murine models of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> Lab. Anim. 36, 291-312 (2002).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence+AJRCCM%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence AJRCCM.</a> 180, 138-145 (2009).</li>
<li>Kukavica-Ibrulj, I., Facchini, M., Cigana, C., Levesque, R. C., Bragonzi, A. Assessing Pseudomonas aeruginosa virulence and the host response using murine models of acute and chronic lung infection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKukavica-Ibrulj%2C+I+%22Methods+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+Humana+Press%22">Methods in Pseudomonas aeruginosa: Humana Press</a>. Filloux, S., Ramos, J. L. , (2014).</li>
<li>Moalli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Therapeutic+Potential+of+the+Humoral+Pattern+Recognition+Molecule+PTX3+in+Chronic+Lung+Infection+Caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Therapeutic Potential of the Humoral Pattern Recognition Molecule PTX3 in Chronic Lung Infection Caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Immunol. 186, 5425-5534 Forthcoming.</li>
<li>Paroni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+CFTR-deficient+mice+to+long-term+Pseudomonas+aeruginosa+chronic+infection+and+PTX3+therapeutic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Response of CFTR-deficient mice to long-term Pseudomonas aeruginosa chronic infection and PTX3 therapeutic treatment.</a> J. Infect. Dis. In press, Forthcoming.</li>
<li>Maxeiner, J., Karwot, R., Hausding, M., Sauer, K. A., Scholtes, P., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+enable+the+investigation+of+murine+bronchial+immune+cells%2C+their+cytokines+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method to enable the investigation of murine bronchial immune cells, their cytokines and mediators.</a> Nat. Protoc. 2, 105-112 (2007).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+microevolution+during+cystic+fibrosis+lung+infection+establishes+clones+with+adapted+virulence.%5BTitle%5D)+AND+%22AJRCCM%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa microevolution during cystic fibrosis lung infection establishes clones with adapted virulence.</a> AJRCCM. In press, (2009).</li>
<li>Pirone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+cenocepacia+strains+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+are+apparently+more+invasive+and+more+virulent+than+rhizosphere+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Burkholderia cenocepacia strains isolated from cystic fibrosis patients are apparently more invasive and more virulent than rhizosphere strains.</a> Environ. Microbiol. 10, 2773-2784 (2008).</li>
<li>Bragonzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+co-infection+of+the+cystic+fibrosis+lung+by+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cenocepacia+reveals+influences+on+biofilm+formation+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modelling co-infection of the cystic fibrosis lung by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia reveals influences on biofilm formation and host response.</a> PLoS One. 7, Forthcoming.</li>
<li>Bianconi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+signature-tagged+mutagenesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+tracking+patho-adaptive+mutations+promoting+long-term+airways+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">Positive signature-tagged mutagenesis in Pseudomonas aeruginosa: tracking patho-adaptive mutations promoting long-term airways chronic infection.</a> PLoS Pathog.. 7, (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים בפ הכנת aeruginosa-חרוזים ואתגר עכבר מדווחים להלן. זן פ aeruginosa משמש לאתגר עכברים הוא קריטי. תמותה, זיהום או פינוי כרוני עשוי להיות שונה באופן משמעותי בהתאם לזן החיידקים המשמש לאתגר. פ זן קליני aeruginosa RP73 הועדף על זן המעבדה התייחסות PAO1 שכן היא גרמה לתמותה נמוכה יחסית, נגעים חמורים יותר, וזיהום כרוני גבוה יותר. בדיקות סמים במחקרים פרה צריכה להת...

סיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מחלה גנטית הנגרמת על ידי מוטציות ברגולטור המוליכות הטרנסממברני סיסטיק פיברוזיס גן (CFTR). גן זה מקודד לערוץ כלוריד הביע על הממברנה של רוב תאי האפיתל. הרס bronchiectasis, סתימת הריר וparenchymal נגרמים בעיקר על ידי זיהומי Pseudomonas aeruginosa בהדרגה לגרום למחלת ריאות קשה ותמותה ברוב של חולי CF 1. פתוגנזה CF הבנה ופיתוח נוסף של טיפולים חדשניים מסתמכים על מודל חיה עם תכונות אופייניות של CF. כמה עכברים, מהונדסים גנטי לגן CFTR, כבר נוצרו, אבל מגבלות ביכולתם של מינים אלה לשחזר מחלת ריאות כמו CF וכמה חריגות איבר אחרות ראו בחולי CF תועדו 2 באופן נרחב. התפתחות הזיהום היא אחד האתגרים העיקריים במודל החיה CF. CL הספרותמוקדם מצביע על כך שזיהום כרוני שנמשך יותר מפעם אחת בחודש יכול להיות מושגת רק אם עכברים מחוסן עם חיידקים מוטבעים בסוכן משתק כגון אגר, agarose, או אלגינט אצות 3-5. סוכנים לשתק אלה מספקים את תנאי microaerobic / אנאירובי המאפשרים לחיידקים לגדול בצורה של microcolonies, בדומה לצמיחה בליחה של חולי CF 6. מודל זה של זיהום כרוני מוביל להתמדה של החיידקים לריאות וגורמות לדלקת בדרכי הנשימה ונזק 7. עם זאת, בהתאם לשיטה, זן החיידקים והמינון מחוסן לריאות, את האחוז של עכברים נגועים כרוניים ועומס החיידקים התאושש בתוך הריאות בנקודות זמן שונות יכולים להיות שונה במידה ניכרת. בפרט, האתגר העיקרי לזיהום כרוני לטווח ארוך נותר נטל החיידקים הנמוך על ידי פ &#39; aeruginosa ואחוז הנמוך של שבועות עכברים נגועים לאחר אתגר, המציין thaתאי חיידקיים לא נמחקים בהדרגה על ידי המארח. על ידי בחירת פ זן קליני aeruginosa RP73 מתוך אוסף של CF מבודד 8 השגנו הצלחת תמותה נמוכה, נגעים חמורים יותר, ואחוז הגבוה של זיהום כרוני עם מטען יציב חיידקים עד חודש בעכברי C57Bl/6NCrl. מאמר זה מפרט את המתודולוגיה להטבעת פ aeruginosa בחרוזים אגר, אנחנו נגועים בעכברים על ידי החדרת intratracheal, מדדנו את עומס החיידקים וציטוקינים בריאות, אספנו נוזל BAL וביצעו בדיקה היסטולוגית. בסך הכל, בפרוטוקול זה יסייע לחוקרים בהתמודדות עם שאלות חשובות ביסודו על 8,9 פתוגנזה ובדיקת טיפולים חדשניים נגד פ זיהום כרוני aeruginosa 10,11.

<table><tbody><tr><td>מרק סויה טריפטי Bacto</td><td>Becton Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, מגורען</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי כבד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>S-(+)-קטמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל 25 גרם 5/8 אינץ'&nbsp; 0.5 מ"מ x 16 מ"מ</td> צנתר <td>3071250300350</td><td></td><td>PIC</td></tr><tr><td>22 גרם 0.9 מ"מ x 25 מ"מ</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe - 0.5 מ"מ טיפים</td><td>Curved Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים, איריס, 11 ס"מ, ישר</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>תפרים</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>תפר חוט</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 תא חד פעמי Burker</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk Solution</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC מאגר ליזה</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>EZ ציטומשפך</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost אולטרה פלוס מיקרוסקופ שקופיות</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Romanowsky סט צביעה</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות EIA/RIA צלחת</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris המטוקסילין non Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosin בתוספת תמיסה אלכוהולית</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>חממה רועדת</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>מענק</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיוק איזון</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>ציטוצנטריפוגה</td><td>תרמו מדעי</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום בעלות נמוכה</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת הומוגניזציה</td><td>Ystral</td><td>2366925(קטן)</td><td></td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ אופטי הפוך</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה (מיקרוסקופ)</td> <td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

כרוני לטווח ארוך<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

מודל עכבר של זיהום דרכי הנשימה הכרונית הוא נכס מרכזי בסיסטיק פיברוזיס מחקר (CF), אם כי יש מספר חששות לגבי המודל עצמו. שלבים מוקדמים של דלקת וזיהום נחקרו בהרחבה על ידי שימוש במודל העכבר אגר חרוזים Pseudomonas aeruginosa, בעוד שרק כמה דיווחים התמקדו בזיהום הכרוני לטווח הארוך בגוף חי. האתגר העיקרי לזיהום כרוני לטווח ארוך נותר נטל החיידקים הנמוך על ידי פ &#39; aeruginosa ואחוז הנמוך של שבועות עכברים נגועים לאחר אתגר, המציין כי תאי חיידקיים נמחקים בהדרגה על ידי המארח. מאמר זה מציג שיטה להשגת זיהום כרוני לטווח ארוך יעיל בעכברים. שיטה זו מבוססת על ההטבעה של פ זני aeruginosa קליניים באגרו חרוזים במבחנה, ואחריו החדרת intratracheal בעכברי C57Bl/6NCrl. דלקת ריאות דו צדדית קשורה sevקריאה פסקי מדידים eral כולל ירידה במשקל, תמותה, זיהום כרוני, ותגובה דלקתית. פ זן קליני aeruginosa RP73 הועדף על זן המעבדה התייחסות PAO1 שכן היא גרמה לתמותה נמוכה יחסית, נגעים חמורים יותר, וזיהום כרוני גבוה יותר. פ קולוניזציה aeruginosa יכולה להתמיד בריאה במשך למעלה משלושה חודשים. הפתולוגיה ריאות Murine דומה לזו של חולי CF עם מחלת ריאות כרונית מתקדמת. מודל עכברי זה מחקה באופן קרוב ביותר את מהלך המחלה האנושית ויכול לשמש הן ללימודים בפתוגנזה ולהערכת טיפולים חדשים.

כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, פ אגר חרוזים aeruginosa ימדדו בין 100-200 מיקרומטר וניתן להבחין במיקרוסקופ אור הפוכה על ידי pipetting נפח קטן של ההשעיה אגר חרוזים בשקופית. תאי חיידקים בודדים נראים בחרוזים אגר, כפי שמוצגים בפירוט באיור 1. הבחירה של פ זן aeruginosa משמש בהכנה אגר חרוזים הוא קריטי. איור 2 וטבלה 1 מציגים את הנתונים המתקבלים בע...

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור זיהום כרוני מתמשך לטווח ארוך של pseudomonas aerogen בדרכי הנשימה של עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי תרבית של זן החיידק הנבחר pseudomonas aerogen. השלב השני הוא הטמעת החיידקים בחרוזי אגר קטנים על ידי ערבוב החיידקים עם אגר ושמן מינרלי בטמפרטורה של 50 °C, ולאחר מכן קירור התערובת בטמפרטורה של 4 °C תחת ערבוב איטי ורציף.בשלב הבא, השמן המינרלי מוסר על ידי מספר שטיפות עם PBS, ואליקוט של חרוזי האגר עובר הומוגניזציה ופיזור על צלחות אגר. כדי לקבוע את התוכן הבקטריאלי, השלב הסופי הוא הזרקת מספר מיקרוליטרים של תרחיף חרוזי האגר לקנה הנשימה של עכברים ליצירת זיהום ריאתי כרוני של pseudomonas aerogen. לבסוף, ניתן לאסוף נוזל שטיפה ברונכאוולאולרי וריאות בנקודות זמן שונות לאחר החשיפה ולפזרם על צלחות אגר כדי לזהות את אחוז העכברים שנדבקו בזיהום כרוני ואת העומס הבקטריאלי בדרכי הנשימה של העכברים ששרדו. היתרון המרכזי של שיטות חרוזי האגר אלו על פני השיטות הקיימות הוא שהן מאפשרות זיהום כרוני יציב לטווח ארוך באחוז גבוה של עכברים, דבר המוביל להתמדה של עומס בקטריאלי יציב למשך עד חודש אחד.שיטות ה-AGA מספקות בריאת העכבר תנאי מיקרו-אוורובי המאפשרים לחיידקים לצמוח בצורה של מיקרו-מושבות. בדומה לצמיחה ברירית של חולי סיסטיק פיברוזיס, שיטות אלו יכולות לסייע לחוקרים במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לפתוגנזה של סיסטיק פיברוזיס ומחלות נשימה אחרות, ובבחינת טיפולים חדשניים נגד זיהום ריאתי כרוני של Pseudomonas aeruginosa. ניתן להשתמש בשיטות אלו גם כדי להשיג זיהום כרוני עם פתוגנים אחרים, כולל Burkholderia cepacia או Staphylococcus aureus, או זיהום משולב עם פתוגנים שונים או ניסויי תחרות. את הפרוצדורה ידגימו פנו, פוסט-דוקטורנט, וקמיל ריבה, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי. שלושה ימים לפני החשפת העכבר, יש להעביר לולאה מלאה של Pseudomonas aeruginosa מתרבית מאגר ב-80°C- לתוך צלחת Tryptic Soy Agar ולהדגיר ב-37°C למשך לילה.ביום למחרת. בחר קולוניה בודדת שהוחדרה ל-5 milliliters של try toay soy broth ודגרה ב-37 degrees Celsius למשך לילה במקטרת נערת במהירות של 200 RPM. למחרת בבוקר, דלל מנה קטנה של תרבית חיידקים מהלילה בתוך phosphate buffered saline ביחס של 1:50. לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית ב-600 nanometers.בשלב הבא, דללו את תרבית החיידקים מהלילה על ידי הוספת שני OD של תרחיף החיידקים לשפבור חדש המכיל 20 milliliters של TSB טרי, והדגרימו ב-37 degrees Celsius למשך כשלוש עד ארבע שעות עד לשלב הלוגי (log phase), באינקובטור נערנער ב-200 RPM עד להגעה לערך כולל של 10 עד 50 OD. ברגע ש-pseudomonas aerosa מגיעה לשלב הלוגי, אספו את תאי החיידקים על ידי סנטריפוגציה ב-2,700 ×g למשך 15 דקות ב-4 degrees Celsius והשליכו את העליון (supernatant). לאחר מכן.יש להשעות את משקע החיידקים ב-1 mL של PBS סטרילי ולערבב ב-vortex ביסודיות עד להשעיה מלאה. לאחר מכן, יש לערבב 1 mL מהתשעיה החיידקית עם 9 mL של TSA נוזלי שהובא לטמפרטורה של 50 °C. יש להוסיף תערובת זו לשמן מינרלי כבד שחומם מראש ל-50 °C.ערבבו מיד במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. על הערבוב להוות מערבולת נראית לעין בשמן. לאחר מכן, קררו את התערובת ל-4 °C תוך כדי ערבוב במהירות מינימלית למשך 35 דקות.לאחר מכן, השאירו על קרח למשך 20 דקות נוספות. לאחר מכן, העבירו את חרוזי האגר למבחנות פלקון של 50 מיליליטר וסובבו במערך צנטריפוגה ב-2,700 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.הסר במדויק את השמן המינרלי ושטוף את משקע חרוזי האגר ב-PBS סטרילי. חזור על הפרוצדורה שש פעמים לאחר שלושה שטיפות. ניתן להשקיע את החרוזים באמצעות כבידה במקום להשתמש בצנטריפוגה לאחר השטיפה האחרונה.שחזר את כדורי האגר ב-20 עד 30 מיליליטר של PBS והומוגן באופן אספטי 0.5 מיליליטר מהכדורים. לאחר מכן, דלל 100 מיקרוליטר מהכדורים ההומוגניים ב-900 מיקרוליטר של PBS סטרילי ובצורה סדרתית. דלל את הכדורים שש פעמים עד ל-10⁻⁶ ביחס של 1 ל-10.לאחר מכן, פריסו את סדרת המדללים על צלחות TSA, כולל דגימה שאינה מדוללת. דללו את הדגימה עד ל-10⁻⁶ והדגירו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C. מדדו את קוטר החריזים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך במספר שדות ראייה.קוטר החרוזיקים חייב להיות בין 100 ל-200 מיקרון לפני ההדבקה של העכברים. ספרו את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) על לוחות ה-TSA כדי לקבוע את מספר ה-CFU למיליליטר בתרחיף חרוזיקי האגר. לאחר מכן, התאימו את נפח חרוזיקי האגר ל-2 עד 4 כפולות של 10⁷ CFU למיליליטר כדי להגיע למוסף (inoculum) אופטימלי של 1 עד 2 כפולות של 10⁶ ב-50 µL.הנח עכבר זכר בן שש עד שמונה שבועות, שהורדם בעזרת ketamine ו-xylazine, במצב שכיבה על גב (supine) על משטח חימום, וחטא את פרוותו באמצעות 70% ethanol. חשוף את הקנה באמצעות חיתוך אנכי של העור. לאחר מכן, השתמש בפינצטה כדי להפריד את השרירים המכסים את הקנה.לאחר מכן, שאבו עד 50 µL מתליית חרוזי האגר באמצעות מזרק של 1 mL. לאחר מכן, בצעו אינטובציה של הקנה באמצעות קטטר וחברו את מזרק ה-1 mL עם תליות חרוזי האגר לקטטר. דחפו בעדינות את בוכנת המזרק כדי לאפשר את השתלת החרוזים לתוך הריאה.לאחר מכן, סגרו את החתך באמצעות קליפסים לתפרים. בשלב זה, הניחו את העכבר שהורדמה במצב שכיבה על הגב וחטאו את פרוותו ב-70% ethanol.בשלב הבא, חשפו את הקנה ואת כלוב בית החזה באמצעות חתך אנכי בעור. לאחר מכן, חשפו את הריאות על ידי חיתוך הסרעפת. השחילו חוט תפירה מתחת לקנה באמצעות פינצטה ובצעו אינטובציה של הקנה באמצעות קטטר.לאחר מכן, משוך את שני קצות חוט התפירה כדי לקשור את הקטטר לקנה הנשימה, ולא את החוט סביב קנה הנשימה. כעת קח מיליליטר אחד של מצע תרבית תאים באמצעות מזרק של 1 mL וחבר אותו לקטטר. דחף את בוכנת המזרק כדי לשטוף את הריאות, ואסוף מיד את הנוזל ואחסנה אותו במבחנה של 15 mL.חזור על שלב זה שלוש פעמים עם סה"כ 3 mL של מצע, ולאחר מכן שמור את נוזל שטיפת הסימפונות והנאדימים (bronchoalveolar lavage fluid) על קרח לצורך איסוף וניתוח הריאות. הוצא את הריאות מהעכבר. שטוף אותן ב-PBS סטרילי.לאחר מכן הפרד את האונות. העבר אותן למבחנה בעלת תחתית עגולה עם 2 mL של PBS סטרילי ושמור על קרח. בצע הומוגניזציה אספטית של הריאות באופן סדרתי.דללו את ההומוגנאט ב-PBS ביחס של 1:10. לאחר מכן, זרעו דילולים סדרתיים, כולל את הדגימה ללא דילול, על צלחות TSA והדגימו בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. הוציאו את נוזל ה-BAL מהקרח ודללו אותו עם תמיסת Turk ביחס של 1:2 תחת מיקרוסקופ אור פתוך הפוך.לספירת המספר הכולל של התאים בתא ספירה מסוג Bürker לצורך ספירה דיפרנציאלית, סבבו את נוזל ה-BAL בצנטריפוגה במהירות של 330 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) בריכוז של 1 מיליון תאים למל בתוך מצע גידול תאים המכיל 10% fetal bovine serum. הניחו את תגליות המיקרוסקופ ואת המסננים בחריצים המתאימים ב-cytospin, כאשר המסננים מקרטון פונים למרכז המכשיר.העבירו בפיפטה 150 µL מכל דגימה לבארים המתאימות של הסייטוספין (cytospin) וסובבו בציטריפוגה במהירות של 300 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש להבחין בכתם של תאים; לאחר צביעת הכתם ניתן לבצע ספירה דיפרנציאלית תחת המיקרוסקופ. איור זה מציג את מהלך הזמן של זיהום כרוני של *Pseudomonas aeruginosa* עם זן הייחוס PAO1 ועם RP73.זן קליני עבור כל נקודת זמן. ההיסטוגרמות מייצגות את אחוז התמותה שנגרמה על ידי בקטרמיה באדום ואת ההישרדות באפור, או את אחוז בעלי החיים שסלקו את הזיהום בלבן, ואלו שהצליחו לפתח זיהום כרוני בירוק. הזן הקליני pseudomonas aerogen RP 73 יעיל יותר ביצירת זיהום כרוני בהשוואה לזן המעבדה PA oh one.עכברים ששרדו הוקרבו בנקודות הזמן המצוינות והריאות הוסרו, עברו הומוגניזציה ונזרעו על צלחות TSA כדי לקבוע את העומס החיידקי. עקומות הצמיחה של זני P oh one ו-RP 73 בריאות העכברים מראות כי כמות החיידקים שלושה ימים לאחר ההדבקה גבוהה יותר עבור P oh one בהשוואה ל-RP 73. לאחר מכן, מהיום השביעי ואילך, כאשר התבססה זיהום כרוני, העומס החיידקי התייצב בין 10⁴ ל-10⁵ CFU לריאה עבור שני הזנים. לאחר שבעה ימים של זיהום כרוני עם זן ה-RP 73 הקליני, הוערך גיוס תאי הדלקת בנוזל BAL.מספר הלוקוציטים הכולל גבוה באופן משמעותי בעכברים שהודבקו ב-RP 73 בהשוואה לעכברים שאינם מודבקים. התאים הנפוצים ביותר הם נויטרופילים, דבר המעיד על תגובה משמעותית של מערכת החיסון המולדת לזיהום כרוני. בתיבה למטה, החצים מצביעים על נויטרופילים ועל מקרופאג, כפי שנראים בנקודה על שקופית לאחר סבוב ציטוסנטריפוגי (cyto spin).מוצגים כאן צביעת המטוקסילין ואוזין של חתכים היסטולוגיים של ריאות עכבר לאחר שבעה ימים של זיהום כרוני עם זן קליני rp. 73; ניתן להבחין בחרוזיים המסומנים על ידי חצים בתוך הלומן הברונכיאל ובמושבות מיקרוסקופיות של תאי חיידקים. באזורים המזוהמים, הברונכיה והפרנכימה הריאתית מאופיינים בגיוס מאסיבי של תאי דלקת.בעוד שדרכי הנשימה של עכבר שאינו מזוהם היו נקיים מתאי דלקת, הקוטר והריכוז הסופי של ה-BES הם פרטים חשובים מאוד. כדי להשיג תוצאה טובה, חשוב לזכור כי גודל החשבון מושפע מקצב השקיעה במהלך שלב הקירור, וכי כמות החיידקים ההתחלתית עשויה להשפיע על הדילול הסופי של החרוזים. יתרה מכך, בחירה של זן pseudomona מתאים, הגורם לתמותה נמוכה של עכברים ולאחוז גבוה של זיהום כרוני, תמזער את מספר העכברים שנעשה בהם שימוש.לאחר הדבקת העכברים, מבוצע ספירת חיידקים. בנוסף, ניתן לבצע בדיקה של התגובה הדלקתית במונחים של ספירת תאים כוללת ודיפרנציאלית ברמה הברונכיאלית, ניתוח ציטוקינים בנוזל, בדיקת mieloperoxidase וניתוח היסטולוגי, וזאת כדי לחקור את תגובת כיבוי הנזק כתוצאה מזיהום חיידקי. יש לזכור שעבודה עם פתוגנים אופורטוניסטיים כגון pseudomonas עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות, טיפול בחיידקים תחת מCבט בטיחות ביולוגית ושימוש בטכניקות סטריליות.פיתוחם של מודלים רלוונטיים בבעלי חיים אפשר את הבדיקה הפרה-קלינית של מולקולות אנטיבקטריאליות ואנטי-דלקתיות חדשניות. זהו שלב חשוב להתערבויות טיפוליות עתידיות עבור זיהומי ריאה בחולים הסובלים מסיסטיק פיברוזיס או ממחלות נשימה אחרות.

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: דה פריס, ס. ר., et.al. מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני של פסאודומונס aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)הווידאו הזה מדגים את ההעברה המאוחרת של Pseudomonas aeruginosa זוהרת לעכבר הנושא שני פצעים עוריים בעובי מלא המכוסים בתחבושת שקופה. דבר זה מסייע ביצירת ביופילם ובהקמת זיהום כרוני. ניטור ביולומינסנציה סדיר מאפשר לכמת את נטל החיידקים ומעקב אחר התקדמות הזיהום לאורך זמן.

פיתוח מודל עכבר של זיהום פצע עור כרוני של פסאודומונס aeruginosa 

פיתחנו מודל פגיעה ריאתית של עכבר על ידי הזרקה תוך-קנה של חיידקים Pseudomonas aeruginosa. מודל זה מחקה פגיעה ריאתית במהלך דלקת ריאות והוא רלוונטי מבחינה קלינית.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטות אוטומטיות לכימות פתולוגיות ריאה כרוניות במודל עכברי של COPD. הפרוטוקול כולל חשיפת עכברים לעשן סיגריות (CS), מדידת תפקוד ריאתי, ניפוח הריאות ושימוש בשיטות מורפומטריה למדידת אמפיזמה ושיפוץ דרכי נשימה קטנות בעכברים.

מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

מחקר זה מתאר את הדור מוצלחת של מודל חדש של בעלי חיים מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון.

דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון

כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

אנו מתארים פרוטוקול חיסונים מושהה ליצירת זיהומים כרוניים הפצע בעכברים המוסמכים.

מדבקת החיסון נגד הידבקות כרונית בנגיף הדלקת בפצע

כתב יד זה מתאר את ביסוס מודל זיהומי של דלקת ריאות בעכברים ואת אפיון פתרון הפגיעה בהתאמה יחד עם שיטות לגידול חיידקים והחדרה תוך טרכיאלית. מתוארת גם גישה חדשנית המשתמשת בציטומטריית זרימה בממד גבוה להערכת הנוף החיסוני.

מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות

עכברים בדרך כלל עמידים לזיהומים על ידי Mycobacterium abscessus, מה שמסבך את הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה נחוצה מאוד נגד זיהומים ריאתיים. כאן, אנו מתארים שיטה להכנת חיסון וזיהום תוך-קנה שהוכח כגורם לזיהום מתמשך בעכברים בעלי יכולת חיסונית.

הכנת מורסה מיקובקטריום משובצת חרוז אגר לחיסון עכברים בעלי יכולת חיסונית תוך קנה הנשימה

למד כיצד ליצור זיהום כרוני בדרכי הנשימה בעכברים באמצעות שיטת חרוזי האגר עם Pseudomonas aeruginosa. שיטה זו מאפשרת שמירה על עומס חיידקי יציב למשך חודש.

כרוני לטווח ארוך

גלה סרטונים נוספים