Name: בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: למדו לבודד ולתרבות תאי אנדותל מהמוח הקדמי העוברי לחקר אנגיוגנזה מוחית ואינטראקציות נוירו-וסקולריות. השיטה משתמשת בחלקיקים מגנטיים CD31 להפרדה טהורה ותומכת במחקר מנגנונים תאיים ומולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ברית לאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות מענק R01NS073635 לAV.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של צלחת תרבות 35 מ&quot;מ: פתרון סוג קולגן 1 מסופק כתמיסה מימית ב20 מ&quot;מ חומצה אצטית (~ 100 חלבון מ&quot;ג / בקבוקון). לדלל נפח מתאים של תמיסת קולגן לריכוז עבודה של 0.01% משימוש במים בכיתה רקמת סטרילית תרבות. מנות מעילים עם 1 מיליליטר של תמיסת קולגן ל3-4 שעות בטמפרטורת חדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס, או הלילה ב 2-8 ° C. הסר פתרון עודף מהצלחת המצופה ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה. יש לשטוף את הצלחת עם מים כיתה תרבית רקמה או PBS לפני הוספת מדיה. ניתן לאחסן כלים מצופים על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הנשר בינוני של Dulbecco המלא השתנה (DMEM). מוסף DMEM (500 מיליליטר) עם FBS 10% ופתרון האנטיביוטיקה antimycotic (ריכוז 1x; 1 ml/100 מיליליטר). ניתן לאחסן DMEM המלא על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot (50 מיליליטר) של DMEM עם DNase אני (0.001 מ&quot;ג / מיליליטר), (המכונה DMEM-DNase אני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot אחר (10 מיליליטר) של DMEM עם collagenase וdispase (1 מ&quot;ג / מיליליטר) (המכונה DMEM-collagenase/dispase). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא האנדותל תרבות בינונית (ECCM 500 מיליליטר), בתוספת EGF (5 מיקרוגרם), ECGs (100 מ&quot;ג) ו -5 μl של פתרון האנטיביוטיקה antimycotic. ניתן לאחסן ECCM על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm כל אמצעי התקשורת לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ טיהור: PBS, pH 7.2 עם BSA 0.5% ו2 מ&quot;מ EDTA. שמור על חיץ קר (2-8 ° C). </li></ol> 2. ההסרה של עוברים וDissection של telencephalon כל הניסויים באמצעות חיות מעבדה מאושרים על ידי ועדות טיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים מקלין ותואמים את הנחיות NIH לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים בעיתוי הריון CD1 (יום עוברי 15). היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב יום עוברי 0 (E0). סכרי CD1 בדרך כלל מייצרים המלטות גדולות, ולכן 10-12 עוברים צפוי מסכר בהריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לhysterotomy, להרדים עכברים בהריון עם זריקת intraperitoneal של קטמין / Xylazine (5 מ&quot;ג / קילוגרם) (100 מ&quot;ג / קילוגרם). לעכברים כ 20-30 גרם, לספק 0.3 מיליליטר של חומר הרדמה 10 מיליליטר / קילוגרם קטמין / Xylazine ולהבטיח שכאב והמצוקה היא מינימאלית במהלך זריקות intraperitoneal של חומר ההרדמה. השתמש ביד איפוק לזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן. הסר את העוברים מעכברים בהרדמה עמוקה. לערוף כל עובר מייד עם ההסרה מהאם. מניחים את הראשים העובריים בצלחות פטרי סטרילית בקרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב כריתת רחם על ידי המתת חסד מיידית עם מנת יתר של חומר הרדמה (130 מ&quot;ג / pentobarbital קילוגרם, ה-IP), שיטה להמתת חסד, אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים: 2013 Edition. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את המוח מהראש במספריים microtip בסדר ומלקחיים בסדר. הערה: לנתח באיכות גבוההיון הוא חיוני כדי להסיר בהצלחה את קרום pial מהמוח העוברי. זו מושגת על ידי תרגול. מלקחיים בסדר ומספריים microtip גם כלים מרכזיים להשגת נתיחה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי לקבל אחיזה איתנה על המוח ומספרי microtip לקלף את קרום pial. הסר את mesencephalon וmetencephalon ולבודד את telencephalon. העבר telencephalon pial נטול מכל העוברים למנת תרבות 35 מ&quot;מ עם 2 מיליליטר PBS בקרח. </li></ol> 3. בידוד תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר בtelencephalon ל1-2 ברי מ&quot;מ עם להב סכין מנתחים ולאסוף רקמה בצינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של DMEM המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הרקמה בעדינות אך ביסודיות עם טפטפת מיליליטר 1 עד גושים נעלמים והשעיה חלבית מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ניתקה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את supernatant וגלול resuspend ב DMEM-DNase I. בזהירות בעדינות לנתק את ceLLS שוב באמצעות פיפטה 1 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 800-1,000 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בDMEM המלא החם. תאי סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר סטרילי. איסוף תאים מסוננים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תא החלקים נשמרו ברשת ולעכל נוסף עם DMEM-collagenase/dispase (2 מיליליטר) ל1-2 דקות ב RT. לשטוף 3x תאי DMEM-DNase אני באמצעות צנטריפוגה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT. בריכת תאים אלה עם התאים המסוננים שנאספו בשלב 3.5. שטוף תאים בסך הכל פעם אחת עם DMEM מלא. המשך כדי לקבוע מספר תא וצעדי תיוג מגנטיים. הערה: חשוב לקבל השעיה תא בודד לפני תיוג מגנטי. </li></ol> 4. תיוג מגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מראה את התיוג המגנטי של 10 7 תאים. למספרים סלולריים נמוך מ10 7, להשתמש באותו נפח ומגיבים למספרים סלולריים גדול מ10 7, בהיקף של עד כל הכרכים מגיב וכרכים בסך הכלבהתאם (למשל עבור 2 x 10 7 תאים בסך הכל, השתמש פעמיים בנפח של כל ריאגנטים מצויינים). שמור את כל חומרים כימיים ותאים בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר סלולרי עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 90 μl/10 7 תאים של חיץ טיהור לתא גלולה ואחרי 10 μl של microbeads CD31. Microbeads המסופק על ידי יצרן הם מצומדת לmonoclonal נוגדן CD31 אנטי עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר. הערה: בטמפרטורות גבוהות ו / או זמן דגירה ארוך יותר בתיוג מגנטי עלולות לגרום ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 1-2 ml/10 7 תאים של חיץ טיהור ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 500 μl של חיץ טיהור. המשך להפרדה מגנטית או צעד טיהור. </li></ol> 5. פוrification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עמודת MS בשדה המגנטי של MACS מפריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העמודה עם 500 μl של חיץ טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל השעיה תא על הטור. טען מספר המתאים של תאים לעמודת MS כמספר תאים גבוהים יותר עשוי לסתום את העמודה. זהירות: כל עמודת MS יכול להכיל מספר מרבי של 2 x 10 7 תאים, למספר תא גבוה יותר, להשתמש יותר עמודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף וזורקים זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור עם 500 μl של חיץ טיהור שלוש פעמים. במהלך שלבים לשטוף, לוודא כי מאגר העמודה ריק לפני הוספת aliquots חיץ טיהור שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה ממפריד MACS ולמקם אותו על צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוכנה מסופקת יחד עם עמודת הטרשת הנפוצה. פיפטה 1 מיליליטר של חיץ טיהור על טור MS ומייד לשטוף את התאים שכותרתו מגנטית על ידי תקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cel פלייטls על צלחת תרבות 35 מ&quot;מ precoated עם סוג קולגן 1 ולגדל תאים בECCM בחממה מוגדרת 37 ° C עם 95% O 2 ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל ארבעה ימים. השתמש PVECs לניסויים או תת לאחר 10-12 ימים כאשר המנה היא מחוברת. </li></ol> 6. תת של PV ECS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ECCM ולשטוף monolayer של PVECS עם 1-2 מיליליטר של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 1.5 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA כדי לכסות את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. בתוך 5-7 דקות, תאים להתנתק מהמשטח של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים יש מנותקים, מייד להוסיף נפח שווה של מעכבי טריפסין וtriturate מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור פלקון 15 מיליליטר סטרילי. צנטריפוגות הצינור ב XG 500 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של ECCM prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים להרחבת התרבות, imהזדקנות או מבחני אחרים. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

PVEC של יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תאי בוגרים מוח אנדותל וECs ממקורות רקמות אחרים ללימודים המתמקדים באינטראקציות עצבים וכלי דם וגם יש פוטנציאל טיפולי. להכנת PVEC, זה קריטי עם תחילת נתיחה כדי לעבוד מהר כדי להשיג את כדאיות טובה שכן תאים מתים עלולים להיקשר nonspecifically לmicrobeads CD31. בנוסף, אם ההשעיה תא בודד לא תושג לפני צעד התיוג המגנטי, זה יביא לפתרון בעיות שכן גושי תא יהיה לסתום את העמודה. יתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בדגירה עם טריפסין לנתק את התאים מחרוזים מגנטיי...

אנגיוגנזה, נוירוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים קריטיים במערכת עצבים מרכזית (CNS) פיתוח, תיקון והתחדשות. מספר מחקרים אלגנטיים הראו כי תאי האנדותל לעורר התפשטות עצבית ולהיפך באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים ועל ידי מגע ישיר. מצאנו את זה מוזר, כי ברוב המחקרים הללו 1-3, ואילו אבות עצביים / תאי גזע עצביים מבודדים מהמוח העוברי, הם cocultured עם תאי אנדותל מהמוח הבוגר, מקורות רקמות מבוגרים אחרים, או עם שורות תאי האנדותל. זה עשוי בחלקו להיות בשל הקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וculturing אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מהמוח העוברי. עם זאת, אנגיוגנזה, נוירוגנזה, ונדידת נוירונים הן אירועים מקבילים המתרחשים בסדרי גודל חזק יותר במוח העוברי מאשר במוח המבוגר הנורמלי. רשת כלי דם periventricular של embryoniמוח קדמי ג (telencephalon) מקורו בכלי הממוקם בתוך primordium הגרעינים הבזליים ומתפתח בצורת הדרגתית מסודר מגחון להגבה telencephalon ידי היום עוברי 11 (E11) 4,5. מקלעת זו של כלי שיט של רשת כלי דם periventricular נבדלת כלי pial מבוסס על מקורות, מיקום האנטומי, דפוסי צמיחה, ורגולציה התפתחותית 4,5. הכיוון של התפשטות של שיפוע אנגיוגנזה periventricular תואם את שיפוע neurogenetic הרוחבי telencephalic. בתוך telencephalon, שיפוע אנגיוגנזה periventricular והשיפוע של נוירונים GABA הנודדים בעקיפין חופף מרחבית, כמו גם 6. עם כל כבוד לעיתוי, שיפוע אנגיוגנזה הוא מראש של שיפוע השיפוע ונוירון GABA neurogenetic ידי על יום. לכן, תאי האנדותל periventricular הם מרחב ובזמן בעמדה טובה כדי לספק רמזים קריטיים לתמוך נוירוגנזה telencephalic ו4,6 נדידת נוירונים. לכן, שימוש בתאי אנדותל periventricular עובריים בניסויי coculture עם אבות ו / או נוירונים עצביים יספק מודל חיובי יותר ללימוד אינטראקציות עצבים וכלי דם ובפיתוח אפיקים חדשים לטיפול במחלות ניווניות או פגיעה המוחית איסכמי / טראומטית. אנו מדגישים את החשיבות של הסרת קרום pial, לא רק כדי להגביל את זיהום תאי אפיתל, אלא גם כדי להפריד בין תאי האנדותל pial אשר מולקולריים ומובחנים מבחינה פונקציונלית מתאי האנדותל של הרשת periventricular כלי דם 4,6 (PVECs מכונה להבדיל מECs pial) . כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו משתמשים באופן שיגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג תשואה עשירה וטהורה של PVECs. תאי האנדותל אלה הוכנו מforebrains העוברי בודד מעכבר מתוזמן בהריון אחד. הם יכולים להיות מורחבים, subcultured, וקפוא למטה בהצלחה לשימוש עתידי.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קולגן, תמיסה מסוג 1 מזנב חולדה&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>איכות DPBS</td><td>ביולוגית</td><td>114057-131</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טור MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים CD31</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מפריד MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מעמד רב MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מסננת תאים 70 ומיקרו; מ</td><td>BD ביוסיינס</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת אנטיביוטיקה ואנטי-פטריית</td><td>סיגמא</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>סיגמא</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קולגנאז/דיספאז</td><td>רוש</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>לונזה</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת תרבית 35 מ"מ</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 מ"ל שפופרת פלקון&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 מ"ל שפופרת בז</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת ECCM</td> ערכת <td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>כוללת תוסף צמיחת תאי אנדותל, EGF ומעכב טריפסין</td></tr><tr><td>פולי סויה תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)</td><td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>יישומי תא</td> <td>RBECGM</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מים בדרגת תרבית רקמה</td><td>Life Technologies</td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 ערכת תיוג תאים</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קרום פלזמה CellLight-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן ביוטינילציה לאיזולקטין B4</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>גורם אנטי-פון ווילברנד</td><td>סיגמא</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-CD31/PECAM-1</td><td>BD פארמינגן</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מדיית הרכבה קשיח VECTASHIELD עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קטמין</td><td>באטלר שיין אספקת בריאות בעלי חיים</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מעבדות קסילזין</td><td>לויד</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>מוטי</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>מכשיר כירורגי Roboz</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים מיקרוטיפ עדינים</td><td>Roboz מכשיר כירורגי</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

תאי האנדותל המוח עובריים יכולים לשמש ככלי חשוב במחקר של אנגיוגנזה ופיתוח neurovascular ואינטראקציות. שתי רשתות כלי הדם של המוח הקדמי העוברי, pial וperiventricular, הן במרחב ייחודיים ויש להם מקורות שונים ודפוסי צמיחה. יש תאי אנדותל מרשתות כלי דם pial וperiventricular פרופילים ייחודיים ביטוי גנים ופונקציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מרשת periventricular כלי הדם (PVECs) של המוח הקדמי העוברי (telencephalon). בגישה זו, telencephalon נטולת קרום pial מתקבל מיום עוברי 15 עכברים טחונים, מעוכל עם collagenase / dispase, והתפזרה באופן מכאני לתוך השעיה תא בודדת. PVECs הם מטוהרים מהשעית תא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן anti-CD-31/PECAM-1 מצומדת לmicrobeads באמצעות חזק מגנטישיטת הפרדה. תאים מטוהרים בתרבית על קולגן 1 מנות תרבות מצופים במדיום תרבית תאי האנדותל עד שהם הופכים ומחוברות וsubcultured נוסף. PVECs שהושג עם מרוצף זה פרוטוקול תערוכה ופנוטיפים ציר בצורה, כפי שדמיין ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טוהר של תרבויות PVEC הוקם עם סמני תא האנדותל. בידיים שלנו, שיטה זו אמינה ועקבי תשואות אוכלוסיות טהורות של PVECs. פרוטוקול זה יהיה לטובת מחקרים שמטרתם להשיג תובנות מכניסטית לאנגיוגנזה המוח הקדמי, הבנת אינטראקציות PVEC, ושיחות צולבות עם סוגים עצביים תא ובעל פוטנציאל אדיר לאנגיוגנזה הטיפולית.

האפיון פנוטיפי של PVECs מהיום 1-12 מוצג על ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד (איור 2). התאים מחוברים לצלחת על מאפיין מורפולוגיה מופע יום 1 של חלוקת תא (איור 2 א). בין 5-8 ימים, מעבר PVECs מאבן חלוק לציר מורפולוגיה בצורה אופיינית לתאי האנדותל ודומים יותר למצבו בvivo (2B דמויות ו2C). ביום 12 תרבות PVEC משיגה מפגש מלא (איור 2 ד). ניתן subcultured PVECs קלות להרחיב את המושבה (איורים 2E-G). הטוהר ש...

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין תרביות טהורות של תאים אנדותליאליים ממוחות עובריות של דגיג-זבב (four brains) כדי לחקור אנגיוגנזה מוחית ואינטראקציות נוירו-וסקולריות. זאת מושג על ידי קילוף תחילה של ממברנת הקליפה ובידוד הצפאלון (cephalon) ממוחות עובריות. השלב השני של ההליך הוא הפקת סספנסיה של תאים בודדים באמצעות דיסוציאציה, סינון ועיכול של הרקמה שנאספה.השלב השלישי הוא סימון מגנטי של התאים באמצעות חרוזי מיקרו CD 31. השלבים הסופיים הם טהרה של התאים המסומנים ב-CD 31 באמצעות הפרדה מגנטית ולאחר מכן תרביות שלהם. בסופו של דבר, נוצרות אוכלוסיות טהורות של תאי אנדותל פראוונטריקולריים למחקר המשך באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה ובדיקות אנגיוגנזה.שיטה זו תועיל למחקרי מנגנונים תאיים ומולקולריים. עבור מחקרים על המוח, היא יכולה לשמש ככלי להבהרה של אינטראקציות בין תאי אנדותל פרי-וונטריקולריים ותקשורת בינם לבין סוגי תאי עצב. היא גם טומנת בחובה פוטנציאל עצום למטרות טיפוליות.הדגמה של שיטה זו היא קריטית כדי לסלק חלק מהקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וגידול של אוכלוסיות טהורות של תאים אנדותליאליים מהמוח העוברי. עבור פרוטוקול זה, הניחו ראשי גורים בשלב E 15 מאמהות CD one ב-PBS קר בקרח תחת סטראוסקופ. הסירו את המוחות באמצעות מספרי מיקרו-טיפ עדינים ופינצטה עדינה.ניתוח מדויק הוא קריטי, והוא מושג באמצעות תרגול ושמירה על הכלים במצב מצוין. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לאחוז במוח ובמספריים בעלות חוד דק כדי להסיר את קרום העטיפה. שלב זה הוא המאתגר ביותר בהליך, אך המיומנויות הנדרשות נרכשות עם התרגול.לאחר מכן, הסירו את המזנצפאלון (mesencephalon) ואת המטצפאלון (metcephalon). בודדו את הצפאלון (cephalon). לאחר מכן, העבירו אותו, ללא קרומי קליפה, לכלי תרבית בנפח 35 מילימטר המכיל 2 מיליליטר של PBS על קרח.אספו את כל הטפרים לצלח אחד. התחילו בקיצוץ הטפרים לרסיסים של מילימטר אחד או שניים באמצעות להב סקלפל. אספו את הרקמה לפ tubes של 15 milliliters המכיל שני milliliters של DMEM מלא.בצעו דיסוציאציה של הרקמה בעדינות אך ביסודיות באמצעות פיפטה של 1 mL עד להיעלמות הגושים והשגת תרחיף חלבי. סבבו את התרחיף בצנטריפוגה במהירות של 800 עד 1000 G למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות שאיבה ובצעו רסספנסיה.שHו את המשקע ב-DMEM עם DS one. כעת הפרידו שוב את התאים באמצעות טיטול עדין וחזרו על שלב הסרטיפוגציה. לאחר מכן, השהו שוב את המשקע ב-DMEM מלא מחומם.סננו את התאים התלוים דרך רשת ניילון של 70 מיקרון, אספו את חלקי התאים שנשארו על הרשת והמשיכו בעיכול בשני מיליליטר של DMEM עם collagenase ו-dis bays. המתינו מספר דקות ולאחר מכן שטפו את הרקמה. שלוש עד לשימוש בסנטריפוגציה וסספנסיה מחדש של המשקע ב-DMEM עם DS one pool, את האספוף השטוף יחד עם התסנין שנשמר על קרח.לאחר מכן, שטפו את התערובת באמצעות DMEM מלא בעזרת צנטריפוגציה והשעיו. כעת קבעו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר והמשיכו לסימון מגנטי. הנפחים בפרוטוקול זה מתאימים לעד 10 מיליון תאים; עבור מספרים גדולים יותר של תאים, פשוט הגדילו את הכמויות באופן יחסי.התחילו בצנטריפוגציה של תרחיף התאים ב-300 G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, שאבו את העליון לחלוטין והוסיפו 90 µL של באפר טהרה מקורר למשקע התאים, ולאחר מכן 10 µL של חרוזי מיקרו מצומדים ל-CD 31. ערבבו היטב את התאים באמצעות פיפט של 200 µL והדגרימו את התרחיף למשך 15 דקות במקרר, אך לא למשך זמן ממושך יותר, כדי לשמור על ספציפיות הסימון. שטפו את התאים על ידי הוספת 1 עד 2 מ"ל של באפר טהרה מקורר וביצוע צנטריפוגציה ב-300 G למשך 10 דקות.הסיר את הנוזל העליון והשעה מחדש את התאים ב-500 microliters של בופר טיהור מקורר. כעת, טען עמודת MS לשדה המגנטי של ה-max separator. לאחר מכן, שטוף את העמודה עם 500 microliters של בופר טיהור בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לעמודה. היא מתאימה לעד 20 מיליון תאים. אספו והשליכו את כל הנוזל שעבר דרך העמודה (flow through), המכיל את התאים שאינם מסומנים.שטפו את העמודה עם 500 µL של בופר טיהור שלוש פעמים. ודאו תמיד שמאגר העמודה ריק לפני הוספת מנות נוספות של בופר הטיהור. כעת הסירו את העמודה מה-max separator והניחו אותה על מבחנה של 15 mL.הוסיפו 1 mL של בופר טיהור לעמודה ושטפו מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי לחיצה חזקה של הבוכנה המסופקת לתוך לוח העמודה. התאים שנשטפו יעברו לצ그러ת תרבית של 35 מ"מ המצופה מראש ב-collagen type one.כעת גדלו את התאים עם ECCM באינקובטור המכוון ל-37 °C עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. החליפו את המצע בכל ארבעה ימים. עקבו מדי יום אחר צמיחת התאים בצלחת התרבית באמצעות מיקרוסקופ.האפיון הפנוטיפי של תאי אנדותל פרי-וונטריקולריים או PVE CS משתנה מהיום הראשון ועד היום ה-12, כפי שנראה במיקרוסקופיה של אור בניגוד מופעים (phase contrast). התאים שהיצמדו למנתחה ביום הראשון מראים מורפולוגיה האופיינית לחלוקת תאים בין היום החמישי לשמיני. ה-PVE CS עוברים ממורפולוגיה של "ריצוף" (cobblestone) למורפולוגיה בצורת כישור, האופיינית לתאי אנדותל ודומה יותר למצבם in vivo.עד ליום 12, תרבית ה-PVEC מגיעה למסוף (confluence) מלא. ניתן לבצע תת-תרבית (subculture) של ה-p vs בקלות כדי להרחיב את המושבה לאחר תת-התרבית.טוהר התרביות של התאי האנדותליאליים נקבע כ-100% באמצעות הסמנים האנדותליאליים הבאים: ISO selectin, von Willbrand factor, CD 31 PE, cam one ו-VE cadherin. תמונות בהגדלה גבוהה של PV Cs שהוכנו מעוברים מסוג CD one, כמו גם מעוברים מסוג tie two GFP שתאי האנדותליום שלהם ביטאו GFP, סומנו עם ISO lectin לפני שהפגינו את המורפולוגיות השכיחות של cobblestone ושל צורת כישורי (spindle), וכן מורפולוגיות פוליגוניות עם שלוחות דקיקות בכלי תרבית מסוימים מצופים בקולגן. בהיעדר matrigel, תאי pve, CS יצרו תבניות סריג הדומות למאפיין הייחודי של רשת כלי הדם הפריוונטריקולרית in vivo.דבר זה משקף את הפוטנציאל האנגיוגני הגבוה של pve. Cs. בוצע ניסוי אנגיוגנזה שבו 20,000 PVE CS הוספו לצלחות תרבית מצופות ב-matrix gel matrix. תאי PV Cs אלו הראו יצירה רבבית של צינורות בתוך 18 שעות.ניתן לבצע מחקר ארוך טווח של pve CS, הכולל נדידה, מורפולוגיה של תנועתיות, בדיקות לתפקוד תאים וכן ניסויים in vivo, על ידי סימון PV המבודד מעוברים של CD one באמצעות ננו-גבישים של Q dot. ננו-גבישים אלו מספקים פלורסצנציה עזה ויציבה לתוך הציטופלזמה של תאים חיים.ניתן להעביר טרנספקציה לתאי Pve EECS באמצעות סמני תאים כגון cell light plasma membrane. RFP back MAM 2.0 משמש לוויזואליזציה ברורה של מורפולוגיית התאים בניסויי דימות תאים חיים. תאי Pve CS תורבעו במספר מצעי גידול, ומורפולוגיית התאים הושוותה באמצעות מיקרוסקופיית ניגוד מופע (phase contrast) ו-ISO selectin לפני הצביעה.בעוד שתאי PV CS שגודלו ב-ECCM הראו מורפולוגיה בצורת כישמיים והגיעו למצב של התמזגות (confluent) עד היום ה-12, תאי pve CS שגודלו במצע גידול לתאי אנדותל של מוח חולדה הראו מורפולוגיה מוארכת מאוד והגיעו למצב של התמזגות עד היום ה-20. מאידך, תאי PV CS שגודלו במצע D-M-E-M-F 12 הראו מורפולוגיה שטוחה ופוליגונית בלבד ללא היווצרות כישמיים, הפגינו צמיחה מהירה מאוד והגיעו למצב של התמזגות עד היום הרביעי.תאי PVEC גודלו ב-ECCM עד לשלושה מעברים ללא אובדן של הפנוטיפ והתפקוד. לפיכך, ECCM הוא המצע המועדף לתרבית של PVEC. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים שלב זה בשלוש שעות אם הוא מבוצע כהלכה.תרבית משותפת של תאי אנדותל פריוונטריקולריים עם תאי מוצא עצביים עשויה לעודד נוירוגנזה ונדידה עצבית באופן יעיל הרבה יותר מאשר תאי אנדותל ממוח של בוגר או ממקורות אחרים. לפיכך, הם עשויים להיות בעלי ערך לסיוע בהשבה של תפקודים נוירולוגיים בתרחישים שונים רבים.

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

שיטה זו מתארת ​​כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

סרטון זה מציג את הבידוד של כלי דם זעירים ממוח חולדה באמצעות שילוב של צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות ומהוד עיכול אנזימטי. את כלי הדם המבודדים ניתן לגדל בתרבית בבקבוק תרבית המצופה מראש במטריצת קולגן ופיברונקטין כדי להשיג מושבות תאי אנדותל.

תרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה: הליך לבידוד ותרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה

סרטון זה מדגים פרוטוקול להשראת התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתאי אנדותל במוח.

יצירת תאי אנדותל במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

אנו מדווחים על שיטה אמינה לבידוד ותרבית תאי אנדותל ראשוניים ספציפיים לגידול ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

למדו לבודד ולתרבות תאי אנדותל מהמוח הקדמי העוברי לחקר אנגיוגנזה מוחית ואינטראקציות נוירו-וסקולריות. השיטה משתמשת בחלקיקים מגנטיים CD31 להפרדה טהורה ותומכת במחקר מנגנונים תאיים ומולקולריים.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

גלה סרטונים נוספים