Name: דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: חקור יצירת מפות הידבקות מפה באמצעות רשתות מיקרו-וסקולריות סינטטיות SynVivo. שיטה זו מאפשרת קבלת נתונים מניסוי בודד וחוסכת זמן וחומרים בהשוואה לשיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

טכנולוגית SynVivo פותחה תחת מענק # 2R44HL076034 מNHLBI.

1. קרקע מכשיר microfluidic SynVivo-SMN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל יציאה (כניסה / יציאה) של המכשיר מורכבת משתי יציאות במקבילות - אחד לזורם בmoieties ציפוי פני השטח (מולקולות הדבקות, מטריצות צמיחה, וכו &#39;) ו / או תאים לזריעה ואחרת להפעלת assay (איור 1 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלוטין להטביע את מכשיר microfluidic SynVivo-SMN (איור 1) בצלחת פטרי המכילה מים deionized סטרילי (DI) ומניח את הצלחת לייבוש ואקום. לאפשר ייבוש לרוץ עד שכל האוויר הוא להסיר את הערוצים של המכשיר. זה אמור לקחת כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הסרת ההתקן מהמים, במקום צינור Tygon (OD של 0.06 &quot;ותעודת זהות של 0.02&quot;) דרוך עם מים לכל יציאה של המכשיר עם מלקחיים בסדר נקודה. צינורות צריכים להיות כ 1 סנטימטר באורך. המכשיר כעת ניתן להסיר מן המים. תרשים 1C מציג תמונה של devicE עם צינורות. </li></ol> 2. ציפוי מכשיר microfluidic עם חלבון רצוי (למשל, Avidin) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, מקום טיפה של מים (כ 100 μl) מסביב לבסיס של צינור יציאת כניסה אחת. מוציא בזהירות את צינורות המשמשים לראש המכשיר. טיפת מים תמנע אוויר מלהיכנס למכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק 1 מיליליטר עמוס avidin בריכוז של 20 מיקרוגרם / מיליליטר. חבר את המזרק למחט נירוסטה 24 G וצינורות. הכנס את צינורות לאחת מיציאות המפרצון של המכשיר. הצמד את יציאת הכניסה לא מנוצל עם מהדק לסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק avidin בקצב זרימה של μl / 1 דקות ל10 דקות כדי לאפשר לטפטוף של המכשיר מלא. בסופו של זרימת הזמן, מהדק את צינורות עם מהדק הלסת ולהניח את המכשיר על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol> 3. מזרימים חלקיקי Biotinylated לניסויים בהידבקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להתקןמגיע לטמפרטורת חדר. מניחים את המכשיר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מצוידים בשלב ממונע וביצועים גבוהים מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 2 מיקרומטר חלקיקי biotinylated בריכוז של 5 x 10 6 / מיליליטר חלקיקים בפוספט הצפת מלוח (PBS). טען את החלקיקים לתוך מזרק 1 מיליליטר. הכן את מזרק 1 מיליליטר של PBS שני בלבד. טען כל מזרק במשאבת מזרק ולהתחבר למחט וצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, מקום טיפה של מים (כ 100 μl) מסביב לבסיס של צינור יציאת כניסה. מוציא בזהירות את צינורות משמשים מעיל המכשיר. טיפת מים תמנע אוויר מלהיכנס למכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את צינורות של חלקיקי biotinylated וPBS משלב 3.2 לכל אחת מיציאות המפרצון. איור 2A מציג תמונה של ההגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הזרקת חלקיקי biotinylated בקצב זרימה של 2.5 μl / min. לפקח על יציאת כניסה על המיקרוסקופ. עם הסימן הראשוןשל חלקיקים, מתחיל את שעון העצר ולהמשיך את הזרימה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של 3 דקות, לעצור את הזרם של חלקיקי biotinylated תוך בוהה הזרימה של PBS בקצב זרימה של 2.5 μl / min בו זמנית. לאפשר PBS לזרום במכשיר במשך 3 דקות כדי לשטוף את החלקיקים מאוגדים. </li></ol> 4. רכישת תמונות והפיכת שטח ריבית מדידות (AOI) באמצעות תוכנת הדמיה (NIKON אלמנטים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית &quot;תמונה גדולה סריקה&quot; בתוכנת ההדמיה לרכישת התמונה של המכשיר כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המספר ברצף bifurcations במכשיר וליצור AOI עגול עם הקוטר כפול של הערוצים. במקרה זה, קבע את קוטר AOI ל200 מיקרומטר מאז קוטר ערוץ 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקצית הספירה האוטומטית בתוכנת ההדמיה כדי לייצא את מספר החלקיקים בכל אחד AOI לגיליון MS Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, השתמש בתכונת הספירה האוטומטית לייצא את מספר החלקיקים בכלמכשיר. </li></ol> 5. חלקיקים שטף ניתוח באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית מודלים (CFD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סימולציות CFD מנוהלות באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי (CFD-ACE +, ESI Inc) לטופולוגיה מכשיר SynVivo-SMN. התוצאות מאוחסנות במסד נתונים לניתוח תצפיות ניסיוניות. לאחסן מידע תוצאות סימולציה על שיעורי קיר גזירה, מהירות, שטף חלקיקים, והידבקות שבמכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות הסימולציה משמשות כדי לקבוע את מספר החלקיקים הנכנסים כל AOI מבוסס על ריכוז חלקיקי כניסה נתון. </li></ol> 6. יצירה שאר הידבקות מפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב% מהידבקות על ידי חלוקת החלקיקים דבקו בהסתעפות על ידי החלקיקים הזורמים בהסתעפות כפי שמוצג במשוואה 6.1. <img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" /> שבו מספר חלקיקי דבק והחלקיקים זורמים מתקבלים מprotocol צעדים 4.3 ו5.2, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את מפת הידבקות הגזירה באמצעות שיעור הגזירה בכל הסתעפות של הרשתות נלקחו מבסיס הנתונים בשלב (5.1) וערכי הידבקות% מתקבלים ממשוואה 6.1. </li></ol>

<ol><li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li>
<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li>
<li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li>
<li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li>
<li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+distribution+during+sepsis%3A+an+experimental+study+on+the+interdependence+of+cell+activation%2C+shear+stress+and+endothelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury.</a> Crit Care. 14, 201(2010).</li>
<li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li>
<li>Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-selectin+binding+by+polyacrylamide-based+conjugates+under+defined+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions.</a> Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+significance+of+adhesion+molecules+on+cultured+endothelial+cells+in+response+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation.</a> Microcirculation. 8, 355-364 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunology. 2, 9(2001).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+cell+adhesion+by+combination+of+surface+chemistry+and+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography.</a> Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).</li>
<li>Qian, T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro%2Fnano-fabrication+technologies+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Micro/nano-fabrication technologies for cell biology.</a> Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).</li>
<li>Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+top-down+and+bottom-up+surface+nanofabrication%3A+techniques%2C+applications+%26+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects.</a> Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).</li>
<li>Rosano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcations%3A+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li>
</ol>

אגרת פרסום לכתבה זו בחסות חברת מחקר CFD.

זרימת צלחת תאים מקבילים, תוך מתן תובנות משמעותיות לתוך תאי תאי אינטראקציות ותא חלקיקים, סובלים מכמה מגבלות כגון הצריכה גבוהה של חומרים כימיים והצורך בריצות ניסיוניות מרובות כדי ליצור מפת הידבקות גזירה. השימוש ברשתות SynVivo סינטטיות כלי הדם (SynVivo-SMNs) מאפשר את הדור של מפת הידבקות גזירה מניסוי בודד בתנאי חיקוי בתנאי vivo. בנוסף, חיסכון משמעותי (&gt; 95%) בריאגנטים גם מתקבל. הצעד החשוב ביותר בניהול ניס...

מבחני הנוכחיים ללמוד לתאי תאים ואינטראקציות חלקיקי תאים בדרך כלל כרוכים פורמט צלחת גם סטטי שבו חלקיקים או תאים מודגרת על מטריצות חלבונים או תאים חסיד. בסוף זמן הדגירה שצוין, המספרים של חלקיקים או תאים חסיד הם לכמת באמצעות מיקרוסקופ 1. למרות שמבחנים אלה מספקים תובנה משמעותית לתהליכים ביוכימיים מאחורי האינטראקציות הללו, למגבלה העיקרית היא חוסר זרימה פיזיולוגית נוזל (אופיינית של זרימת דם) והשפעתה על הידבקות של חלקיקים. כדי להתגבר על מגבלה זו, במבחנה זרימת תאים פותחו בשנים האחרונות. אלמנט משותף של זרימת תאים אלה הוא מנגנון שקוף perfused במספרי ריינולדס נמוכים כדי להתאים שיעורי גזירה קיר נצפו בכלי דם בvivo 2. קיר הכלי הוא מודל או על ידי ציפוי של ביומולקולות או צמיחה של תאים על משטח אחד של הזרימה גhamber 3. חלקיקים 4-7 או תאים 8-16 מכן זרמו בטווח רצוי של ספיקות לכמת את מספר הדבקות חלקיקים תחת שיעורי גזירה שונים. עם זאת, השימוש בזרימת צלחת תאים במקביל ללימודים ולאמת את התופעות ביוכימיות הוא די יקר וזמן רב. זאת בעיקר בשל העובדה כי ניסויים מרובים צריכים להתנהל ליצירת מפה של הגזירה fluidic לעומת מספר חלקיקים / תאים דבקים. בנוסף, זרימת צלחת תאים דורשים כמויות גדולות של חומרים כימיים בשל גודלם הגדול (גובה&gt; 250 מיקרומטר ומ&quot;מ הרוחב&gt; 1). לבסוף, מכשירים אלה אינם מדויקים מודל תכונות גיאומטריות (למשל, bifurcations) ותנאי זרימה (למשל, מתכנס לעומת לסטות תנועות) שנמצאות בגוף חי. ההתקדמות שחלה באחרונה בmicrofabrication יתוגרפיה מבוססת 17-19 האיצה את השדה של מעבדה על שבבהתקני 20-21. התקנים אלה כבר סייעו בפיתוח גרסה מוקטנת של זרימת צלחת קאמרית המקבילה עם ממדים במשטר מיקרומטר. הירידה בממד גם תשואות יתרונות משמעותיים במונחים של כמויות של חומרים כימיים, תאים או חלקיקים הנדרשים לניסויים. עם זאת, מגבלה העיקרית של המכשירים הזמינים כרגע היא השימוש בערוצים ליניארי למודל microvessels, שאינו מחקים את נימי הדם המורכבים שנצפו in vivo. יש לנו לאחרונה פיתחו מתודולוגיה חדשנית ליצירה מחדש של רשתות כלי הדם על גבי מצעי פלסטיק חד פעמי וכתוצאה מהייצוג סינטטי של in vivo התנאים. מכשירים אלה מכונים רשתות כלי הדם SynVivo-סינתטיות (SMN) מפותחים באמצעות PDMS תהליך הרך ליתוגרפיה מבוססת. מכשירי SynVivo-SMN יכולים לשמש כדי לקבל מפת הידבקות גזירה של הידבקות תא / חלקיקים 22, מחקר ממוקד משלוח סמים 23 ושעותולהעיף אומת נגד בנתונים vivo 24-25. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לדור של מפת הידבקות גזירה מניסוי בודד בכמויות קטנות כמו 1-5 μl ובכך וכתוצאה מכך החיסכון משמעותי של משאבים וזמן.

<table><tbody><tr><td>מחקר CFD</td> של <td>SynVivo-SMN</td><td>SMN-001</td><td>בלעדי ב- CFDRC</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>כל מקור avidin יעבוד עבור בדיקה זו</td></tr><tr><td>חלקיקים ביוטיניים</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>כל מקור של חלקיקים ביוטיניליים יעבוד עבור הבדיקה</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>הגודל אופייני לשימוש עם SynVivo-SMN</td></tr><tr><td>NIKON Elements NIKON</td><td>Instruments</td><td>N/A</td><td>כל הדמיה אחרת ניתן להשתמש בתוכנה</td></tr></tbody></table>

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים synvivo

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

מבחני הידבקות תא / חלקיקים הם קריטיים להבנת האינטראקציות ביוכימיים מעורבות בפתופיזיולוגיה מחלה ויש יישומים חשובים במסע לפיתוח תרופות חדשניות. מבחני באמצעות תנאים סטטיים מצליחים ללכוד את התלות של הידבקות בגזירה, הגבלת המתאם שלהם עם סביבת in vivo. תאי זרימת צלחת מקבילים שלכמת הידבקות תחת זרימת נוזל פיזיולוגית צריכים ניסויים מרובים עבור הדור של מפת הידבקות גזירה. בנוסף, הם לא מייצגים את vivo קנה מידה ומורפולוגיה ובדורשים כמויות גדולות (~ מיליליטר) של חומרים כימיים לניסויים. במחקר זה, אנו מדגימים את הדור של מפת הידבקות גזירה מניסוי בודד באמצעות רשת כלי הדם מכשיר microfluidic, SynVivo-SMN מבוסס. מכשיר זה יוצר מחדש מורכב בכלי דם vivo כולל בקנה מידה גיאומטרית, אלמנטים מורפולוגיים, זרימת תכונות ואינטראקציות הסלולר בפורמט במבחנה, ובכך לספק סביבה ביולוגית מציאותית למחקר בסיסי ויישומי בהתנהגות סלולרית, אספקת סמים, וגילוי תרופות. Assay הודגם על ידי בוחן את האינטראקציה של 2 מיקרומטר החלקיקים מצופה ביוטין עם משטחים מצופים avidin של השבב האלקטרוני. מגוון השלם של גזירה שנצפתה בנימי הדם מתקבל בהידבקות assay מאפשר אחת לעומת מפת גזירה לחלקיקים בתנאים פיסיולוגיים.

איור 1 א מציג סכמטית ותמונת שדה בהירה של מכשיר SynVivo-SMN. איור 1 מציג את מכשיר SynVivo-SMN רכוב על שקופיות זכוכית. תרשים 1C מציג את המכשיר עם צינורות הבאים תחול במים בייבוש ואקום. איור 2 א מראה תמונה של למעלה להגדיר הניסיוני. איור 2B מראה מכשיר מצופה avidin טיפוסי SynVivo-SMN הבא מחייב של 2 מיקרומטר חלקיקי biotinylated. שים לב ...

תאי זרימה המשמשים בניסויי הידבקות מורכבים בדרך כלל ממסלולי זרימה ליניאריים ודורשים ניסויים מרובים בקצבי זרימה שונים כדי ליצור מפת הידבקות גזירה. SynVivo-SMN מאפשר יצירת מפת הידבקות גזירה באמצעות ניסוי יחיד תוך שימוש בנפחי מיקרוליטר וכתוצאה מכך חיסכון משמעותי בזמן ובחומרים מתכלים.

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג מפת הידבקות תחת גזירה של הידבקות חלקיקים תאיים מניסוי בודד תוך שימוש ברשתות מיקרו-וסקולריות סינתטיות. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי המכשיר המיקרופלואידי בחלבון הנושאי עניין, ובמקרה זה avadon. כשלב שני, חלקיקים ביוטיניליים מוזרקים למכשיר בקצבי גזירה פיזיולוגיים, אשר נקשרים למכשיר המצופה ב-avadon בתבניות משתנות התלויות בקצבי הגזירה המקומיים.בשלב הבא, נספר מספר החלקיקים הקשורים על מנת להפיק מפת הידבקות תגזיתית של החלקיקים, באמצעות מאגר נתונים שנוצר באופן חישובי של ערכי קצב גזיז ברשת. התוצאות מראות כי ניתן להפיק מפת הידבקות תגזיתית מניסוי בודד, דבר המוביל לחיסכון משמעותי בזמן ובריאגנטים בהשוואה לתאי זרימה בעלי לוחות מקבילים קונבנציונליים. היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני שיטות קיימות, כגון תעלות זרימה ליניאריות, הוא היכולת להפיק מפות הידבקות מניסוי בודד, מה שמביא לחיסכון משמעותי בעלויות ובזמן.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הולכת תרופות, כגון יכולתם של נשאי התרופות להיקשר למטרות הרצויות. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר השתמשנו בתאי זרימה בעלי לוחות עם כנפיים (paddle plate flow chambers) כדי להבין נגעים תאיים ספציפיים בתנאי זרימה של נוזלים. עם זאת, מטרת בדיקה זו היא לספק תובנות בסיסיות לגבי הידבקות של חלקיקים ותאים.ניתן להחיל את פלטפורמת ה-syn vivo על מגוון מערכות אחרות, כגון סרטן והובלה למערכת העצבים המרכזית (CNS), זיהום ודלקת, תרומבוזה ושיבוש במיקרו-סירקולציה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי התפעול של התקן המיקרו-פלואידי הם קשים ללמידה, דורשים הסתגלות לנפחי דגימה קטנים, והשיטות המומלצות למניעת היווצרות בועות מועברות בצורה יעילה יותר באופן חזותי. את הפרוצדורה תדגים Ashley Smith, מדענית מחקר מהמעבדה שלנו.מכשיר המיקרופלואידיקה SynVivo SMN מורכב משני סטים של פתחים מקבילים, אחד להזרמת ציפוי פני, מויטיים (moieties) ו/או תאים להצבה, והשני להרצת הבדיקה. כדי להתחיל, טבולו את המכשיר לחלוטין בצלחת פטרי המכילה מים דה-יוניים סטריליים והניחו את הצלחת בוואקום. בצעו ייבוש (desiccation) והמתינו עד שכל האוויר יסולק מהתעלות של המכשיר.פעולה זו צריכה להימשך כ-15 דקות לפני הוצאת המכשיר מהמים. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להניח צינוריות tigon שמונעות במים בכל אחד מפתחי המכשיר. אורך הצינוריות צריך להיות כ-one inch.כעת ניתן להוציא את המכשיר מהמים באמצעות פיפטה או מזרק. טפטפו טיפה של מים סביב בסיס צינורית של אחד מפתחי הכניסה. הסירו את הצינורית בזהירות.טיפת המים תמנע מאוויר להיכנס למכשיר. לאחר מכן, הכינו מזרק של מיליליטר אחד טעון ב-avadon בריכוז של 20 micrograms per milliliter. חברו את המזרק למחט פלדת אל חלון בכי মাপ 24 ולצינור. סגרו את פתח הכניסה שאינו בשימוש באמצעות תליבהכנס את הפיתול לתוך פתח הכניסה של המכשיר. הזרק avadon בקצב זרימה של 1 µL לדקה למשך 10 דקות כדי לאפשר פרפוזיה מלאה של המכשיר. בסיום זמן הזרימה.סגרו את כל הפיתולים באמצעות תפסני לסת והניחו את המכשיר בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך לילה. המתינו עד שהמכשיר יגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את המכשיר על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בבמה ממוטרת ובמצלמה בעלת ביצועים גבוהים.הכינו תמיסה של חלקיקים ביוטיניליים בגודל שני מיקרון בריכוז של 5 מיליון חלקיקים למיליליטר בבופר פוספט סלין (PBS). העמיסו את החלקיקים למזרק של מיליליטר אחד. הכינו מזרק שני של מיליליטר אחד המכיל PBS.יש להניח כל מזרק על משאבת מזרקים, ולאחר מכן לחברם למחט ולצינורית באמצעות מזרק פיפטור. הניחו טיפה של מים מסביב לבסיס הצינורית של פתח הכניסה והסירו בזהירות את הצינורית ששימשה לציפוי המכשיר. הכניסו בזהירות את הצינוריות עבור החלקיקים הביוטיניליים ועבור ה-PBS לכל אחד מפתחי הכניסה.לאחר מכן, התחילו להזריק חלקיקים ביוטיניליים בקצב זרימה של 2.5 µL לדקה. עקבו אחר פתח הכניסה במיקרוסקופ עם הסימן הראשון להופעת חלקיקים. הפעילו את הטיימר והמשיכו בזרימה למשך שלוש דקות.בסיום שלוש הדקות, הפסיקו את זרימת החלקיקים הביוטיניליים ובמקביל התחילו את זרימת ה-PBS בקצב זרימה של 2.5 microliters per minute. אפשרו ל-PBS לזרום במכשיר במשך שלוש דקות כדי לשטוף חלקיקים שאינם קשורים. כדי להתחיל את הרכישה, השתמשו בפונקציית scan large image בתוכנת ההדמיה כדי לרכוש תמונה של המכשיר כולו, לאחר מכן מספר את ההסתעפויות במכשיר באופן רצופי וצרו אזור עניין (area of interest) מעגלי שקוטרו כפול מקוטר התעלים.במקרה זה, הגדירו את קוטר אזור העניין ל-200 microns מאחר שקוטר התעלה הוא 100 microns. השתמשו בפונקציית הספירה האוטומטית בתוכנת הדימוג כדי לייצא את מספר החלקיקים בכל אזור עניין לגיליון אלקטרוני. באופן דומה, השתמשו בתכונת הספירה האוטומטית כדי לייצא את מספר החלקיקים במכשיר כולו.סימולציות CFD מורצות והתוצאות נשמרות במסד נתונים לצורך ניתוח המשך. המידע הכלול בתוצאות כולל קצבי גזירה של הדופן (wall shear rates), שטף חלקיקים מהירותי והצמדה למכשיר. המידע כאן משמש לקביעת מספר החלקיקים הנצמדים בכל אזור עניין, בהינתן קלט מוגדר של ריכוז חלקיקים.כדי להפיק מפת הידבקות לגזירה, חשב את אחוז ההידבקות כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט כשלב סופי. שרטט את מפת ההידבקות לגזירה באמצעות קצב הגזירה בכל התפצלות של הרשתות וערכי אחוז ההידבקות. תמונה זו מציגה מכשיר SMN syn vivo מצופה avidan טיפוסי לאחר קישור של חלקיקים ביוטיניליים בגודל שני מיקרון.שימו לב כי חלקיקים נצמדים באופן מועדף ליד ההתפצלוּת ברשת. ניתן לראות כאן את ההתפצלויות המסופרות ברשת ה-SMN in vivo. תמונה זו היא מפת מאמץ הגזירה על הדופן של הדגם שהופקה באמצעות מודל ה-CFD של המכשיר.קצב הגזירה במכשיר משתנה בין 250 inverse seconds ל-15 inverse seconds, כפי שנצפה בכלי דם זעירים in vivo. שימו לב כי לא ניתן להשיג קצבי גזירה משתנים אלה בו-זמנית בתעלות מיקרופלואידיות ליניאריות, שכן אלו מספקות קצב גזירה קבוע עבור כל ספיקת זרימה. הגרף המוצג כאן של ערכי קצב הגזירה בכל אחת מהפיצולים של הרשת חושף כי דפוסי קצב הגזירה הם מורכבים ולא ניתן להשיגם באמצעות קשר אנליטי פשוט, בניגוד לתעלות זרימה ליניאריות.יתרה מכך, ברשת קיימות מספר התפצלוּתים (bifurcations) הנופלים תחת אותה רמת גזירה (sheer bin), דבר המוסיף לביטחון הסטטיסטי של הנתונים המוצגים. להלן תוצאות לדוגמה של ניתוח CFD עבור שטפי חלקיקים ברשת, המשמשים לחישוב שטפי החלקיקים בענפים ובהתפצלוּתים של הרשת הניסויית.מפת ההידבקות תחת גזירה שחושבה מניסוי SMN בודד ב-syn vivo עוקבת אחר הקשר ההפוך שנצפה במפות הידבקות תחת גזירה שהתקבלו מניסויי תעלות ליניאריות. עם זאת, בשימוש במערך SynVivo, ניסוי בודד מאפשר יצירה של מפת גזירה זו, בעוד שבשימוש בתעלות ליניאריות נדרשים מספר הרצות ניסוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש במכשירי SynVivo SMN ליצירת ההידבקות תחת גזירה מניסוי בודד.בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לזכור לא להחדיר בועות למכשיר המיקרופלואיד SynVivo SMN לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדלקות ללמוד את האינטראקציה בין לוקוציטים לאנדותל בקצבי גזירה שונים בניסוי אחד. בדור הבא של המכשירים, חוקרים יוכלו ללמוד גלגול, היצמדות ונדידה של לוקוציטים בבדיקה אחת, דבר שאינו אפשרי כיום.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות הבוחנות היצמדות של תרופות, נשאי תרופות ותאים, כדי לחקור שאלות כגון ההשפעה הפיזיולוגית של זרימה על היצמדות בין תאים, היצמדות של תאים לתרופות והיצמדות של תאים לנשאי תרופות.

generation-shear-adhesion-map-using-synvivo-synthetic-microvascular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

פרוטוקול זה מתאר את היישום של פירוק הידרוג'ל מונחה תמונה ומבוסס לייזר לייצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-נוזליות הנגזרות מכלי דם המוטמעות בהידרוג'לים פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט (PEGDA). מערכות מיקרופלואידיות ביומימטיות אלו עשויות להיות שימושיות עבור יישומי הנדסת רקמות, יצירת מודלים של מחלות מבחנה וייצור מכשירים מתקדמים "על שבב".

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את הדור ואת הניתוח הנפחי של שווה ערך לעור אנושי וסקולרי באמצעות טכניקות נגישות ופשוטות לתרבות ארוכת טווח. ככל האפשר, הרציונל לצעדים מתואר כדי לאפשר לחוקרים את היכולת להתאים אישית בהתבסס על צרכי המחקר שלהם.

דור של שווה ערך לעור אנושי בהרכבה עצמית

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

הנבטת אנגיוגנזה, הבסיסית להתפתחות ומחלות, כרוכה בתהליכים מולקולריים ומכניים מורכבים. אנו מציגים מודל 2.5D ex vivo רב-תכליתי המנתח נביטה תאית מעורקי הצוואר החזיריים, וחושף אנגיוגנזה תלוית קשיחות ומכניקת תאים מובילה-עוקב מובהקת. מודל זה מסייע בקידום אסטרטגיות הנדסת רקמות וגישות לטיפול בסרטן.

מודל 2.5D לאפיון מכני ex vivo של אנגיוגנזה מונבטת ברקמה חיה

חקור יצירת מפות הידבקות מפה באמצעות רשתות מיקרו-וסקולריות סינטטיות SynVivo. שיטה זו מאפשרת קבלת נתונים מניסוי בודד וחוסכת זמן וחומרים בהשוואה לשיטות מסורתיות.

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

גלה סרטונים נוספים