דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג מפת הידבקות תחת גזירה של הידבקות חלקיקים תאיים מניסוי בודד תוך שימוש ברשתות מיקרו-וסקולריות סינתטיות. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי המכשיר המיקרופלואידי בחלבון הנושאי עניין, ובמקרה זה avadon. כשלב שני, חלקיקים ביוטיניליים מוזרקים למכשיר בקצבי גזירה פיזיולוגיים, אשר נקשרים למכשיר המצופה ב-avadon בתבניות משתנות התלויות בקצבי הגזירה המקומיים.

בשלב הבא, נספר מספר החלקיקים הקשורים על מנת להפיק מפת הידבקות תגזיתית של החלקיקים, באמצעות מאגר נתונים שנוצר באופן חישובי של ערכי קצב גזיז ברשת. התוצאות מראות כי ניתן להפיק מפת הידבקות תגזיתית מניסוי בודד, דבר המוביל לחיסכון משמעותי בזמן ובריאגנטים בהשוואה לתאי זרימה בעלי לוחות מקבילים קונבנציונליים. היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני שיטות קיימות, כגון תעלות זרימה ליניאריות, הוא היכולת להפיק מפות הידבקות מניסוי בודד, מה שמביא לחיסכון משמעותי בעלויות ובזמן.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הולכת תרופות, כגון יכולתם של נשאי התרופות להיקשר למטרות הרצויות. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר השתמשנו בתאי זרימה בעלי לוחות עם כנפיים (paddle plate flow chambers) כדי להבין נגעים תאיים ספציפיים בתנאי זרימה של נוזלים. עם זאת, מטרת בדיקה זו היא לספק תובנות בסיסיות לגבי הידבקות של חלקיקים ותאים.

ניתן להחיל את פלטפורמת ה-syn vivo על מגוון מערכות אחרות, כגון סרטן והובלה למערכת העצבים המרכזית (CNS), זיהום ודלקת, תרומבוזה ושיבוש במיקרו-סירקולציה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי התפעול של התקן המיקרו-פלואידי הם קשים ללמידה, דורשים הסתגלות לנפחי דגימה קטנים, והשיטות המומלצות למניעת היווצרות בועות מועברות בצורה יעילה יותר באופן חזותי. את הפרוצדורה תדגים Ashley Smith, מדענית מחקר מהמעבדה שלנו.

מכשיר המיקרופלואידיקה SynVivo SMN מורכב משני סטים של פתחים מקבילים, אחד להזרמת ציפוי פני, מויטיים (moieties) ו/או תאים להצבה, והשני להרצת הבדיקה. כדי להתחיל, טבולו את המכשיר לחלוטין בצלחת פטרי המכילה מים דה-יוניים סטריליים והניחו את הצלחת בוואקום. בצעו ייבוש (desiccation) והמתינו עד שכל האוויר יסולק מהתעלות של המכשיר.

פעולה זו צריכה להימשך כ-15 דקות לפני הוצאת המכשיר מהמים. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להניח צינוריות tigon שמונעות במים בכל אחד מפתחי המכשיר. אורך הצינוריות צריך להיות כ-one inch.

כעת ניתן להוציא את המכשיר מהמים באמצעות פיפטה או מזרק. טפטפו טיפה של מים סביב בסיס צינורית של אחד מפתחי הכניסה. הסירו את הצינורית בזהירות.

טיפת המים תמנע מאוויר להיכנס למכשיר. לאחר מכן, הכינו מזרק של מיליליטר אחד טעון ב-avadon בריכוז של 20 micrograms per milliliter. חברו את המזרק למחט פלדת אל חלון בכי মাপ 24 ולצינור. סגרו את פתח הכניסה שאינו בשימוש באמצעות תליב

הכנס את הפיתול לתוך פתח הכניסה של המכשיר. הזרק avadon בקצב זרימה של 1 µL לדקה למשך 10 דקות כדי לאפשר פרפוזיה מלאה של המכשיר. בסיום זמן הזרימה.

סגרו את כל הפיתולים באמצעות תפסני לסת והניחו את המכשיר בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך לילה. המתינו עד שהמכשיר יגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו את המכשיר על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בבמה ממוטרת ובמצלמה בעלת ביצועים גבוהים.

הכינו תמיסה של חלקיקים ביוטיניליים בגודל שני מיקרון בריכוז של 5 מיליון חלקיקים למיליליטר בבופר פוספט סלין (PBS). העמיסו את החלקיקים למזרק של מיליליטר אחד. הכינו מזרק שני של מיליליטר אחד המכיל PBS.

יש להניח כל מזרק על משאבת מזרקים, ולאחר מכן לחברם למחט ולצינורית באמצעות מזרק פיפטור. הניחו טיפה של מים מסביב לבסיס הצינורית של פתח הכניסה והסירו בזהירות את הצינורית ששימשה לציפוי המכשיר. הכניסו בזהירות את הצינוריות עבור החלקיקים הביוטיניליים ועבור ה-PBS לכל אחד מפתחי הכניסה.

לאחר מכן, התחילו להזריק חלקיקים ביוטיניליים בקצב זרימה של 2.5 µL לדקה. עקבו אחר פתח הכניסה במיקרוסקופ עם הסימן הראשון להופעת חלקיקים. הפעילו את הטיימר והמשיכו בזרימה למשך שלוש דקות.

בסיום שלוש הדקות, הפסיקו את זרימת החלקיקים הביוטיניליים ובמקביל התחילו את זרימת ה-PBS בקצב זרימה של 2.5 microliters per minute. אפשרו ל-PBS לזרום במכשיר במשך שלוש דקות כדי לשטוף חלקיקים שאינם קשורים. כדי להתחיל את הרכישה, השתמשו בפונקציית scan large image בתוכנת ההדמיה כדי לרכוש תמונה של המכשיר כולו, לאחר מכן מספר את ההסתעפויות במכשיר באופן רצופי וצרו אזור עניין (area of interest) מעגלי שקוטרו כפול מקוטר התעלים.

במקרה זה, הגדירו את קוטר אזור העניין ל-200 microns מאחר שקוטר התעלה הוא 100 microns. השתמשו בפונקציית הספירה האוטומטית בתוכנת הדימוג כדי לייצא את מספר החלקיקים בכל אזור עניין לגיליון אלקטרוני. באופן דומה, השתמשו בתכונת הספירה האוטומטית כדי לייצא את מספר החלקיקים במכשיר כולו.

סימולציות CFD מורצות והתוצאות נשמרות במסד נתונים לצורך ניתוח המשך. המידע הכלול בתוצאות כולל קצבי גזירה של הדופן (wall shear rates), שטף חלקיקים מהירותי והצמדה למכשיר. המידע כאן משמש לקביעת מספר החלקיקים הנצמדים בכל אזור עניין, בהינתן קלט מוגדר של ריכוז חלקיקים.

כדי להפיק מפת הידבקות לגזירה, חשב את אחוז ההידבקות כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט כשלב סופי. שרטט את מפת ההידבקות לגזירה באמצעות קצב הגזירה בכל התפצלות של הרשתות וערכי אחוז ההידבקות. תמונה זו מציגה מכשיר SMN syn vivo מצופה avidan טיפוסי לאחר קישור של חלקיקים ביוטיניליים בגודל שני מיקרון.

שימו לב כי חלקיקים נצמדים באופן מועדף ליד ההתפצלוּת ברשת. ניתן לראות כאן את ההתפצלויות המסופרות ברשת ה-SMN in vivo. תמונה זו היא מפת מאמץ הגזירה על הדופן של הדגם שהופקה באמצעות מודל ה-CFD של המכשיר.

קצב הגזירה במכשיר משתנה בין 250 inverse seconds ל-15 inverse seconds, כפי שנצפה בכלי דם זעירים in vivo. שימו לב כי לא ניתן להשיג קצבי גזירה משתנים אלה בו-זמנית בתעלות מיקרופלואידיות ליניאריות, שכן אלו מספקות קצב גזירה קבוע עבור כל ספיקת זרימה. הגרף המוצג כאן של ערכי קצב הגזירה בכל אחת מהפיצולים של הרשת חושף כי דפוסי קצב הגזירה הם מורכבים ולא ניתן להשיגם באמצעות קשר אנליטי פשוט, בניגוד לתעלות זרימה ליניאריות.

יתרה מכך, ברשת קיימות מספר התפצלוּתים (bifurcations) הנופלים תחת אותה רמת גזירה (sheer bin), דבר המוסיף לביטחון הסטטיסטי של הנתונים המוצגים. להלן תוצאות לדוגמה של ניתוח CFD עבור שטפי חלקיקים ברשת, המשמשים לחישוב שטפי החלקיקים בענפים ובהתפצלוּתים של הרשת הניסויית.

מפת ההידבקות תחת גזירה שחושבה מניסוי SMN בודד ב-syn vivo עוקבת אחר הקשר ההפוך שנצפה במפות הידבקות תחת גזירה שהתקבלו מניסויי תעלות ליניאריות. עם זאת, בשימוש במערך SynVivo, ניסוי בודד מאפשר יצירה של מפת גזירה זו, בעוד שבשימוש בתעלות ליניאריות נדרשים מספר הרצות ניסוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש במכשירי SynVivo SMN ליצירת ההידבקות תחת גזירה מניסוי בודד.

בעת ביצוע ניסוי זה, חשוב לזכור לא להחדיר בועות למכשיר המיקרופלואיד SynVivo SMN לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדלקות ללמוד את האינטראקציה בין לוקוציטים לאנדותל בקצבי גזירה שונים בניסוי אחד. בדור הבא של המכשירים, חוקרים יוכלו ללמוד גלגול, היצמדות ונדידה של לוקוציטים בבדיקה אחת, דבר שאינו אפשרי כיום.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות הבוחנות היצמדות של תרופות, נשאי תרופות ותאים, כדי לחקור שאלות כגון ההשפעה הפיזיולוגית של זרימה על היצמדות בין תאים, היצמדות של תאים לתרופות והיצמדות של תאים לנשאי תרופות.