הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

המטרה הכללית כאן היא להדגים את המתודולוגיה של השתקת גנים באמצעות וירוס (virus induced gene silencing) לצורך זיהוי גנים המעורבים בעמידות של צמחים שאינם מאוכלים, כדי להשיג VIGs של הצמח האנדוגני. עבור הגן המטרה, יש להחדיר לצמחי nicotiana hamama קונסטרקט של tobacco rattle virus הנושא פרגמנט של הגן המטרה, להכין ולהחדיר תרביות של פתוגנים שאינם מאוכלים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (green fluorescent protein) אל על עליי הצמח שגניו הושתקו. לאחר מכן, יש להעריך את מושבות הפתוגן הפלואורסצנטיות הירוקות תחת תאורה UV בחשיכה.

על מנת לזהות צמחים שבהם השתתיקה הגנטית פגעה בעמידות של צמחים שאינם מארחים, יש לזהות את הגן המטרה על ידי ריצוף המקטע המוכנס לתוך וקטור הווירוס. באופן כללי, מתודולוגיה זו של סריקה גנטית קדימה באמצעות VIGS מאפשרת לחוקרים לזהות בקלות גנים המעורבים בעמידות של צמחים שאינם מארחים מפני פתוגנים חיידקיים. בפרק זמן קצר, הבנו את החשיבות של שילוב גנטיקה קדימה המתווכת על ידי השתתקת גנים המושרית על ידי וירוסים עם פתוגנים המבטאים GFP UV, כדי לזהות את הגנים האחראים לעמידות מסוג non-ST.

בעבר ביצענו סריקה גנטית קדימה מייגעת באמצעות דירוג של מוות תאי מושרה על ידי תגובת-יתר ומוות תאי מושרה על ידי מחלה. זרעו זרעי Nicotiana benthamiana בתערובת שתילה ללא קרקע והנביטו את הזרעים בתא גידול. לאחר שלושה שבועות, השתילו את השתילים לעציצים בודדים, וגדלו אותם בחממה למשך יומיים עד שלושה ימים לפחות לפני ההדבקה ב-tobacco rattle virus.

בזריעת וקטורים לתאיי תאנה, הפסיקו בהדרגה את הקפאת הגבעולים הקפואים של Agrobacterium המכילים את שיבוטי ה-cDNA. תחת תנאי סטריליות, זרקו שני וקטורים של תרביות Agrobacterium בודדות על גבי מצעי Luria Berti agro. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 28 °C למשך עד יומיים.

גדלו ארבע מושבות חוזרות עבור כל שיבט, כך שיהיה זמין תמריר אגרובקטריום מספיק להחדרה לשני צמחים. הדריכו את TRV one לתוך מצע נוזלי של Luria berti. אספו את התרביות שגדלו במהלך הלילה באמצעות סנטריפוגה, השעיקו את החיידקים במבשר החדרה, והדריכו במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר על שייקר במהירות של 50 RPM.

לאחר קצירת התאים באמצעות סרCיפוגציה, מדוד את הצפיפות האופטית והשהה מחדש את משקעי החיידקים בבופר MES בריכוז 5 mM ב-pH 5.5. לאחר מכן, הזרק את תרבית החיידקים של TRV1 בעלת OD 600 של 0.3 לצד האקסילרי (ציר) של שלושה עד ארבעה עלים של Nicotiana hamama באמצעות מזרק ללא מחט באתרי ההזרקה של TRV1. דבב את העלים עם אינוקולום של מושבות TRV2 המתאימות באמצעות קיסם במשך שבועיים. תחזק את הצמחים בטמפרטורה נמוכה עם תזונה נאותה, שכן צמיחה נמרצת חשובה להשתיקה יעילה של גנים על ידי PiG.

כדוגמה, בניסוי זה נעשה שימוש ב-pseudomonas senge PV tomato T one. על הפתוגנים לשאת פלסמיד המסוגל לבטא G-F-P-U-V. יש לגדל את זני ה-PGE במצע נוזלי מסוג kings be, בתוספת 10 µg/mL של Rifampicin ו-50 µg/mL של canmycin, בטמפרטורה של 28 °C למשך 12 שעות.

קצרו את תרביות החיידקים באמצעות סרכזגוגה, ולאחר מכן אשרו את נוכחות הפלואורסצנציה הירוקה באמצעות מנורת UV באורך גל ארוך בחושך. לאחר שתי שטיפות במים סטריליים, השהו מחדש את התאים בריכוז הרצוי של מים סטריליים וכווןנו את ה-OD 600. לאחר מכן, פתחו את הפתוגנים המתאימים אל הצד האקסיאלי של המטרה.

במידת הצורך, יש להקיף עיגולים בקוטר של כ-1.5 סנטימטר בעלים שעברו השתקה גנטית. במקביל, יש לבחון מספר פתוגנים שאינם פונדמאליים למארח כדי לבדוק את צמיחתם בצמחים שבהם הושתק הגן המטרה, כולל ביסורת של ביקורת וקטור לצורך השוואה. יש להטמיע צמיחה בקטריאלית בין שניים לחמישה ימים.

חשפו את העלים המוחדרים לאור UV באורך גל ארוך בחושך. הקפידו להשתמש במיגון לעור ולעיניים. עקבו אחר המושבות החיידקיות כנקודות פלואורסצנטיות ירוקות בצדו האקסיאלי של העלה, על רקע פלואורסצנציה אדומה הנפלטת מפני העלה.

אששו את הפלואורסצנציה הירוקה הנפלטת מהפתוגן המארח המשמש כביקורת חיובית. עקבו אחר צמיחת הפתוגן מדי יום, מהיום השני ועד היום החמישי לאחר ההדבקה. רשמו רשימה של השיבובים שבהם השתקה הובילה לצמיחה של פתוגן אחד או יותר שאינו פתוגן של המארח.

כדי להסיר את התוצאות החיוביות השגויות מהסינון הראשון, יש לחזור על ה-VIGs עבור השיבוטים שנבחרו, ושוב, לבחון את תגובתם של הצמחים שבהם הושתק הגן לפתוגנים שאינם רלוונטיים. יש להשתמש ב-colony PCR על השיבוט הנבחר כדי להגביר את המקטע המוכנס באמצעות הפריימרים A TTB one ו-TB two בווקטור T RV two, או פריימרים החסומים את אתר השיבוט.

הריצו את תוצר ה-PCR על ג'ל אגרוז ואמתו את ההגברה של פס אחד בודד. לאחר מכן, רצפו את מקטע הגן של הצמח בוקטור T RV two באמצעות הפריימרים A TTB או פריימרים המקיפים את אתר השכפול. בצעו blast באמצעות הרצף וזהו את פרטי הגן.

פרוטוקול כללי להשתקת מספר רב של גנים באמצעות וקטורים המבוססים על נגיף רעיכה של הטבק (tobacco rattle virus) ב-Nicotiana hamana, כפי שמוצג בתרשים הזרימה זה. חלק מהצמחים עם הגנים המושתקים הראו שינויים פנוטיפיים שונים, כולל עיכוב בצמיחה, הצהבה ופנוטיפים של הלבנה עקב חשיפה לאור (photobleaching).

נתונים אלו מראים פלואורסצנציה ירוקה של פתוגן שנחשף לאור UV בחושך לפניe הדבקת הצמח, ואת שתלי הצמיחה שלהם שלושה ימים לאחר ההדבקה; עלה זהה שנחשף לאור לבן מוצג כביקורת. ניסוי זה עוקב אחר הצמיחה של חיידקים המבטאים G-F-P-U-V בשלושה צמחים שאינם מאוכלים.

פתוגנים שימשו להדגמת תהליך הזיהוי של הצמח שבו הושתק הגן, אשר רגיש לפתוגנים של אי-מארחים, לעומת צמחי nicotiana hamama מסוג wild type שבהם הגן לא הושתק והם בעלי חסינות. פתוגנים אלו לא גדלו. עם זאת, לפחות שני פתוגנים של אי-מארחים גדלו על NB sgt.

עלים עם השתקה של גן אחד. נתונים כמותיים על צמיחת חיידקים מדגימים את התהליך של זיהוי צמחים עם השתקת גנים שבהם פגמה העמידות ל-non-ST. באמצעות גישה זו של גנטיקה קדימה מתווכת על ידי figs, השתקנו כ-5,000 גנים ב-nicotiana hamana וזיהינו צמחים שבהם פגמה העמידות ל-non-ST לאורך תקופה של כשנה וחצי.

כדוגמה, מוצג כאן צמיחה של פתוגנים שאינם מארחים בשני צמחים עם השתקה של גנים שזוהו בסריקה זו. אנו מקווים שהדגמנו כיצד לבצע השתקת גנים מושראת על ידי וירוס עבור מאות גנים, ולאחר מכן להעריך את הצמחים המהושתקים באמצעות תצפית על צמיחה של פתוגנים שאינם מארחים בצמחים כדי לנתח עמידות שאינה תלוית מארח. באמצעות פרוטוקול זה להשתקת גנים המתווכת על ידי וירוס, ניתן להשתיק מאות גנים בפרק זמן של כשבועיים עד שלושה שבועות, ולאחר מכן להעריך את הצמיחה של פתוגנים שאינם מארחים המסומנים ב-GFP UV בערך כשתיים עד שלוש שעות ביום, לאורך כשניים עד חמישה ימים.