Name: הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למד לבנות פיגום תאית תלת-ממדי להנדסת רקמות באמצעות גיליונות תאים ופולימרים תרמורגישים. השיטה מאפשרת יצירת רקמות שכבתיות לשתלים עם שמירה על שלמות התאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי פרס הפקולטה החדשה II מהמכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה (CIRM; RN2-00921-1), פרס המחקר הלאומי במימון ה-NIH (F32-HL104924) ומענק הכשרה של CIRM (TG21163). החומרים סופקו על ידי: Glycosan Biosystems Inc / BioTime וד"ר סטיבן בדילאק (אוניברסיטת פיטסבורג)

.1 יצירה של צלחות מצופות pNIPAAM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את g 2.6 של pNIPAAM ב2 מ&quot;ל של פתרון הקסאן / 40% 60 טולואן%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את התערובת ל60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עוררו, עד pNIPAAM נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך נייר סינון לתוך מעגל 60 מ&quot;מ קוטר ונייר מקום במשפך בוכנר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך המשפך בוכנר לתוך כוס הזכוכית שקל מראש (לא להשתמש בפלסטיק, כהקסאן ימס פלסטיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכוס והתוכן לתוך ואקום פעמון O (24 psi) / N (16 hr). הערה: עד השאריות הוא הגיב עם איזופרופיל זה יהיה לחמצן כדי לוודא זה לא בא במגע עם חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הכוס להקים את המשקל של pNIPAAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף באלכוהול רפואי לpNIPAAM, יצירת 50/50 w / w פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2 מ&quot;ל של הפתרון על פני השטח של צלחת תרבית הרקמה, ומעיל למשך 5 דקות תחת אור UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת עם 2 מ&quot;ל של PBS החם פעמייםלפני השימוש בתרבית תאים. </li></ol> .2 יצירת גיליונות סלולריים הערה: גיליונות תא של תאים ראשוניים לאיבר המטרה יכולים להיות שנוצרו באמצעות מספר השיטות שונות, או על ידי ציפוי משטחי תרבית רקמה עם פולימר תרמו מגיב כפי שמתואר כאן. צלחות תרמו רגיש טרום מצופים מוצעות גם על ידי מספר הספקים. הערה: פרוטוקול זה מיועד לתרבות באמצעות צלחת 35 מ&quot;מ. בקצרה, תאים מודגרת ראשון על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 24 שעות בנקודת המפגש ליצור חיבורי רוחב בין תאים סמוכים. לשחרר גיליונות תא, צלחות חשופים לטמפרטורות מתחת 32 ° C. גיליון התא הוא הועבר לאחר מכן למטריצה ​​הסיבית הבסיס החזק המכילה הידרוג&#39;ל מתירנית neovascular עם תאי האנדותל של כלי דם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את אוכלוסיית התאים. הערה: שיטה זו תלויה בנהלי גזירת פרט ואת הסוג של תאים. mu החלק אב העורקים עכברושתאי scle (RASMC) משמשים בדוגמא זו. אלה הם תאי שריר חלק עיקריים מבודדים מאב העורקים בבטן של חולדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים עם 2 מ&quot;ל של PBS החם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של טריפסין (או ביקוע / פתרון disassociating אחר) לתאים למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכב טריפסין על ידי התוספת של 3 מ&quot;ל של התקשורת והתרבות, או פתרון חיץ פוספט (PBS) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בצינור חרוטי ולספור aliquot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים ב 1,000 סל&quot;ד (228 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend התאים בתקשורת הצמיחה שלהם (בינוני תרבות SmGM2 בתוספת ערכת כדור משמש לRASMC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המדיה המכילה את התאים על צלחת 35 מ&quot;מ תרמו רגישה - צלחת מצופה pNIPAAM בריכוז שישיג 100 מפגש%. הערה: לקבלת RASMCs המספר שנקבע להיות 100,000 תאים / 2 סנטימטר. עם זאת, כתוצאה מאובדן של תאים במהלך החולף, 120% מva ש<html> משמש lue. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום לתוך חממה על 37 מעלות CO / N. שים לב: חשוב לשמור על התאים ב37 ° C כדי לשמור על הידבקות התא לצלחת. </li></ol> .3 הכנה של מטריקס המכונן הערה: מטריצות סיבי 3D שונים ניתן להשתמש כדי שכבת מטריצה ​​סיבית חזקה בין סדיני תא העדינים. כמה דוגמאות כוללות: gelfoam, bioglass, חומרי acellularized טבעיים 26 או nanospun חומרי 27,28 המטריצה ​​חזירי שתן בשלפוחית ​​השתן (UBM) משמשת במחקרים אלה סופקה בנדיבות ממשתף הפעולה שלנו, ד&quot;ר Badylak 29. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימוש, לקבוע מאפייני מטריצה ​​כולל חוסר התוכן סלולארי אם נעשה שימוש במטריצה ​​decellularized, 27,28 כדאיות ספציפית תא, וחלל הריק. 22 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את המטריצה ​​מעוקרת מראש לגודל וצורה רצויים. הערה: כאן, ניקוב חורים משמש לחיתוך עיגול בקוטר 4 מ&quot;מ. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 4. תאי האנדותל זריעה לNeovascular מתירנית Hydrogel הערה: ניתן להשיג תאי האנדותל ממגוון רחב של מקורות, כולל בידול מתאי גזע או אב. כאן, HUVECs משמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכל זמן כמו בפעם cross-linking הידרוג&#39;ל יתר (הפיברין, ג&#39;ל קולגן) הוא קצר מספיק כדי לאפשר לתאים להישאר בת קיימא. שים לב: כאן, ג&#39;ל hyaluronan (HA) המבוסס צולב עם גשר דיסולפיד משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הידרוג&#39;ל HA בהתאם לפרוטוקול החברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תאי האנדותל ולפזר לפתרון תא בודד באמצעות טריפסין 1x. הערה: Accutase או תא דיסוציאציה הצפת יכול לשמש גם לפיזור תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את אנזים טריפסין על ידי שימוש בכמות שווה של מעכבי טריפסין הסויה (אם זה חשוב כי תאים אינם באים במגע עם סרום) או 10 FBS% PBS, איסוף הפתרון / צינור חרוטי תאים לתוך 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Count התאים, ולחשב את הנפח הדרוש לממדי התיקון (לכמת בעבר). הערה: לקבלת תיקון 4 מ&quot;מ, המשמשים כאן 2 מיליון תאי האנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ 2 מיליון תאים, ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב( 228 XG) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant, עוזב את התאים כגלולה בצינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את החומרים נוזליים HA וטין ב1: מנת 1. לאחר מכן להוסיף 80% מהנפח הכולל לתוך צינור חרוטי המכיל גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי אנדותל ב1: 1 HA / התערובת לטין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התאים התלויים בתערובת HA / לטין לתוך המטריצה ​​הסיבית הבסיס מהשלב 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1/5 (20 אחוזים) מכלל הנפח הרצוי של צולב מקשר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של השעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. </li></ol> .5 בידוד של גיליונות סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות שטופלו pNIPAAM 35 מ&quot;מ המכילות את התאים מן החממה והמקום במכסת מנוע תרבית תאים בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשאוב את התקשורת מהתאים, ולהוסיף 2 מ&quot;ל של 6% ג&#39;לטין הרגיל שחומם ל37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד ג&#39;לטין הוא עדיין חם, מניח את סריג המתכת לתוך ג&#39;לטין, והשקיע אותה מתחת לפני השטח של ג&#39;לטין הרגיל (סרט 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת כולה על גבי קרח למשך 5 עד 7 דקות, המאפשר את הג&#39;לטין להקשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 דקות, להשתמש במרית כדי להפריד בזהירות את קצות ג&#39;לטין מהצד השני של הצלחת, ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי להרים את סריג המתכת מהערת הצלחת: ג&#39;לטין 6%, וגיליון התא צריך להרים עם הסריג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את גיליון התא לצלחת ומניח על גבי שילוב מטריצה-הידרוג&#39;ל הבסיס סיבי, הגדרת הרשת בראש המבנה בזהירות. הערה: צד הפסגה של גיליון התא עדיין יהיה במיקום העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של תקשורת החמה (37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O / N המאפשר הגיליון של תאים לדבוק פני השטח הידרוג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר tהוא סריג מתכת לאחר הפתרון מחמם (כ 1 שעה), או ביום שלמחרת. </li></ol>

<ol><li>Ohashi, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering+of+the+liver+and+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering of the liver and islets.</a> Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).</li>
<li>Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+in+cardiac+tissue+engineering%3A+Ten+years+of+research+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Mat+Sci+Eng+R%22%5BJournal%5D)">Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey.</a> Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).</li>
<li>Jakob, P., Landmesser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+cell-based+therapy+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Heart+Fail+Rep%22%5BJournal%5D)">Current status of cell-based therapy for heart failure.</a> Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).</li>
<li>Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+in+ischaemic+heart+disease%3A+promise%2C+uncertainties%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges.</a> Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).</li>
<li>Etzion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+embryonic+cardiomyocyte+transplantation+on+the+progression+of+heart+failure+in+a+rat+model+of+extensive+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).</li>
<li>Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering for heart tissue repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).</li>
<li>Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interv+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Strategies for myocardial repair.</a> J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).</li>
<li>Li, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bioengineered+cardiac+graft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Construction of a bioengineered cardiac graft.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).</li>
<li>Muller-Ehmsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+a+damaged+heart%3A+long-term+survival+of+transplanted+neonatal+rat+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction+and+effect+on+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function.</a> Circulation. , 105-1720 (2002).</li>
<li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+integration%2C+and+differentiation+of+cardiomyocyte+grafts%3A+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. , 100-193 (1999).</li>
<li>Roell, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+cardiomyoplasty+improves+survival+after+myocardial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury.</a> Circulation. 105, 2435-2441 (2002).</li>
<li>Soonpaa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+approaches+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Potential approaches for myocardial regeneration.</a> Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).</li>
<li>Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+tissue+engineering+mend+broken+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Can tissue engineering mend broken hearts.</a> Circ Res. 90, 120-122 (2002).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity+in+muscle+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.</a> Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).</li>
<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transplantation+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Myoblast transplantation for heart failure.</a> Lancet. 357, 279-280 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myoblast+transplantation+for+repair+of+myocardial+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis.</a> J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).</li>
<li>Orlic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+adult+bone+marrow+cells+repair+myocardial+infarcts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice.</a> Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).</li>
<li>Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-hyaluronan-based+composite+hydrogels%3A+a+novel%2C+securable+vehicle+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Appl%22%5BJournal%5D)">Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery.</a> J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).</li>
<li>Kai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-loaded+nanofibrous+patch+promotes+the+regeneration+of+infarcted+myocardium+with+functional+improvement+in+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model.</a> Acta Biomater. , (2014).</li>
<li>Hong, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+chondrocytes+seeded+on+a+poly%28l-lactic-co-glycolic+acid%29-fibrin%2Fhyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan.</a> J Biomed Mater Res A. , (2014).</li>
<li>Serpooshan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bioengineered+acellular+collagen+patch+on+cardiac+remodeling+and+ventricular+function+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).</li>
<li>Turner, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+development+for+delivery+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+and+cardiac+cells+in+natural+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).</li>
<li>Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+regeneration+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage regeneration using cell sheet technology.</a> Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).</li>
<li>Sawa, Y., Miyagawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+perspectives+on+cell+sheet-based+myocardial+regeneration+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy.</a> Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).</li>
<li>Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+therapies+with+and+without+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Advanced cell therapies with and without scaffolds.</a> Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+the+partial+replacement+of+functional+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium.</a> Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+alignment+and+biaxial+mechanical+behavior+of+porcine+urinary+bladder+derived+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix.</a> Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).</li>
<li>Luna, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+biomimetic+topography+for+the+alignment+of+neonatal+and+embryonic+stem+cell-derived+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים: ציפוי משטחי צלחת עם פולימר thermoresponsive ומניפולציה של גיליונות התא לאחר קירור הצלחות. מכיוון שתאים שונים להציג תכונות פיזיות שונות, כמו adhesivity, זמן ההרמה צריך להיות מותאם לכל סוג תא אחר. המרכיב השני, ורוב מאתגר באופן משמעותי של פרוטוקול זה, מתמקד במניפולציה של גיליון התא, היבט קריטי של שיטות להרכבת רקמה. שכבת התא בודדת בגיליון התא היא די שבירה ויכולה לקרוע בקלות אם מניפולציות עם מלקחיים. יתר על כן, כאשר גיליונות התא אינם מוחזקים במקום, הם ...

הזרקת תאים ו/או חומרים בודדים בלבד הראתה הצלחה משתנה במערכות איברים אחרות והצלחה מוגבלת בהתחדשות הלב. 5,7-12 נכון לעכשיו, תאים שמקורם בתאי גזע מועברים לרקמות פגועות במגוון שיטות אספקה כולל: הזרקת תאים ישירה לרקמה וזלוף לאספקת הדם. 13-17 אחרים השתילו תאים לבד, חומרים לבד ו/או בשילוב עם נשאי חומרים כדי לסייע בחידוש איברים פגומים. 18-21 עיצוב זה משלב אסטרטגיות מרובות המספקות חוזק חומר, דפוס בחומרים מרובים וסוגי תאים מרובים. 
באופן ספציפי, המטריצה הסיבית הבסיסית מספקת את הכוח הפיזי הבסיסי למבנה, מה שהופך אותו למתאים לתפירה לתוך המטופל, במידת הצורך. החללים החללים במטריצת הבסיס מלאים בתאי אנדותל בהידרוג'ל מתירני ניאו-וסקולרי22 לביסוס מהיר של כלי הדם של המבנה המושתל. מרוכב זה משולב לאחר מכן עם יריעות תאים מעוצבות מראש המאפשרות תקשורת משופרת בין תאים, מחקה יותר את הרקמה הטבעית. 1,23-25 תהליך הייצור הכולל של התיקון הסלולרי השכבתי מתואר על ידי תרשים הזרימה באיור 1.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים</td></tr><tr><td>>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>גשש תאים / צבע חי</td></tr><tr><td>Lysotracker אדום</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>גשש תאים</td></tr><tr><td>ניטרלי אדום</td><td>סיגמא</td><td>N7005</td><td>צבע תא גלוי</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>412780250</td><td>פולי (N-isopropylacrylamide)</td></tr><tr><td>טולואן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>לונזה</td><td>R-ASM-580</td><td>חולדה תאי שריר חלק אבי העורקים</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>תקשורת שריר חלק</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>תאי אנדותל ורידים אנושיים</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glycosan / Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד ספציפי</חזק></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Ahlstrom&nbsp;</td><td>6310-0900&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>משפך בוכנר&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>לוחות UpCell&nbsp;</td><td>Nunc&nbsp;</td><td>2014-11&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אור UV</td><td>חברת Jelight&nbsp;</td><td>מנקה UVO דגם מס '42</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3d פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

רקמות רבות, כגון לב האדם הבוגר, אינן מסוגלות להתחדש כראוי לאחר נזק. 2,3 אסטרטגיות בהנדסת רקמות להציע חידושים על מנת לסייע לגוף בהתאוששות ותיקון. לדוגמא, גישות TE ייתכן שתוכלנה להחליש לב שיפוץ לאחר אוטם שריר הלב (MI) ואולי להגדיל את סך תפקוד לב לרמתו ערב MI הנורמלי ליד. 4 כמו בכל רקמה פונקציונלית, התחדשות מוצלחת של רקמת לב כרוכה באספקה ​​הנאותה של סוגי תאים מרובים עם רמזים סביבתיים העדפת אינטגרציה והישרדות של שתל תא / רקמה המושתלת. רקמות מהונדסות צריכים להתייחס פרמטרים רבים, כולל: אותות מסיסים, אינטראקציות תא אל התא, וחומרי מטריצה ​​הוערכו ככלי רכב משלוח, ההשפעות שלהם על הישרדות תא, חוזק חומרים, וסיוע של ארגון תא אל רקמות. מחקרי העסקת ההזרקה הישירה של תאי שתל רק להתעלם היסודות החיוניים האלה. 2,5,6עיצוב רקמת שילוב מרכיבים אלו טרם פיתח. כאן, אנו מציגים דוגמא לעיצובים משולבים באמצעות שכבות של יריעות תא בדוגמת עם שני סוגים שונים של חומרים המופקים ביולוגיים המכילים את סוג תא איבר המטרה ותאי האנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדש ב&quot; הרקמה &quot;. למרות שהמחקרים האלה מתמקדים בדור של כמו לב רקמות, עיצוב רקמה זו יכול להיות מיושם על איברים רבים אחרים מאשר לב עם שינויים בעיצוב וחומר מינימאליים, והוא אמור להיות מוצר מהמדף לטיפולי משובי. הפרוטוקול מכיל חמישה שלבים מפורטים. טמפרטורת פולי הרגישים (-isopropylacrylamide N) (pNIPAAM) משמשת למאכלי תרבית רקמת מעיל. לאחר מכן, תאי רקמה ספציפית בתרבית על פני השטח של לוחות מצופים / משטחי micropattern כדי ליצור גיליונות תא עם הידבקויות לרוחב חזקות. שלישית, מטריצת בסיס נוצרה לרקמה על ידי שילוב של מטריצה ​​נקבובית עם permissi neovascularve הידרוג ותאי האנדותל. לבסוף, גיליונות התא הם הרימו ממנות pNIPAAM המצופים והועברו למרכיב הבסיס, מה שהופך את המבנה השלם.

תרשים הזרימה (איור 1) מראה את השיטה הכוללת של מה שהופך את התיקון רב שכבתי. גיליונות תא מנותקים מהצלחת טופלה pNIPAAM על ידי הטלת הטמפרטורה מתחת 32 ° C. אז גיליון התא ממוקם בחלקו העליון של הידרוג&#39;ל הצולב המכיל את תאי האנדותל זורעים לתוך המטריצה ​​הבסיסית סיבית (איור 1). גם הצלחות תרמו רגיש pretreated יכולות לשמש ליצירת גיליונות התא. משטחי טופולוגי מיוחדים המשמשים לדפוס באופן ספציפי (כלומר, ליישר) התאים 30. <p class="jove_...

ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב. עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בגילי תאים לבניית טלאי הנדסת רקמות. דבר זה מושג תחילה על ידי טיפול במשטח תרבית התאים בפולימר הרגיש לטמפרטורה poly propyl acrylamide, המכונה גם p nipam. השלב השני הוא גידול התאים הרלוונטיים בצפיפות גבוהה על המשטח המצופה בפולימר כדי ליצור גילי תאים.בשלב הבא, הדפים מורמים על ידי הורדת טמפרטורת הפלטה, דבר המאפשר לתאים להיפרד מהפלטה כדף תאים. השלב הסופי הוא העברת דפי התאים השלמים, ללא קרע, אל מבנה להשתּלה. לבסוף, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה של אור פשוטה כדי להראות כי דף התאים נוצר ונשמר במהלך המניפולציה, תוך כדי יצירת חומר להנדסת רקמה המיועד להשתּלה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, אשר משככות תאים בתוך מטריצה כגון הידרוג'לים, הוא שבטכניקה זו ניתן ליצור ולשמר את הגבולות הצידיים של התאים כרקמה פונקציונלית. שיטות אלו עשויות לאפשר מחקרים נוספים בתחום הנדסת הרקמות. לדוגמה, עד כמה התאים שורדים לאחר השתלה כאשר הם נמצאים במצב מאורגן זה?את הפרוצדורה הזו ידגים ד"ר William Turner, פוסט-דוקטורנט במעבדתי, וגב' Snapshot sand do. כדי להתחיל בפרוצדורה, המסו 2.6 grams של P nipam בשני milliliters של תמיסה הכוללת 60% toluene ו-40% hexane. לאחר מכן, חממו את התערובת ל-60 °C למשך 10 דקות וערבבו עד להמסה מלאה של ה-P nipam.לאחר מכן, גזרו את נייר המסנן לעיגול בקוטר 60 millimeter והניחו אותו במשפך בוכנר. סננו את התמיסה דרך משפך הבוכנר לתוך כוס כימיאית מזכוכית שנשקלה מראש. השאירו את הכוס ותכולתה בתוך צנצנת ואקום למשך לילה.לאחר מכן, שקלו את הכלי עם ה-p nipam. לאחר מכן, הוסיפו isopropyl alcohol ל-P nipam כדי ליצור תמיסה ביחס של 50 50 לפי משקל. לאחר מכן, הניחו שני מיליליטרים מהתמיסה על פני פלטת תרביות רקמה וחשפו אותה למשך חמש דקות תחת אור UV.לאחר מכן, שטפו את הפיתח פעמיים עם 2 mL של PBS חמים לפני השימוש בו לתרבית תאים. בהליך זה, תחילה, בודדו את תאי השריר החלק של אבי העורקים של חולדה על ידי שטיפת התאים עם 2 mL של PBS חמים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 3 mL של trypsin או תמיסת דיסוציאציה (פירוק) אחרת והדגרימו למשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסיפו לתאים שלושה מיליליטרים של מצע גידול או PBS המכיל 10% FBS. לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרת קונית וספרו אותם. לאחר מכן, סובבו את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות.שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים במצע גידול. לאחר מכן, העבירו את המצע המכיל את התאים לצלחת תרמו-סנסטיבית של 35 מילימטר בריכוז שיביא ל-100% Confluence, ולאחר מכן הדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה כדי לשמר את היצמדות התאים לצלחת. כעת, אספו את תאי האנדותל ופזרו אותם לתמיסה של תאים בודדים.ניתן להשתמש גם ב-trypsin בריכוז 1x, ב-accutase או בבuffer לפירוק תאים לצורך פיזור של תאים בודדים. לאחר מכן, יש לבטל את פעילות אנזים ה-trypsin באמצעות כמות שווה של מעכב trypsin מפולי סויה או 10% FBS ב-PBS. לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרת קונית של 15 milliliters.ספרו את התאים באמצעות המוסימטר (hemo cytometer) וחשבו את הנפח הדרוש עבור ממדי התחבולה; עבור תחבולה של ארבעה מילימטרים, נעשה שימוש ב-2 מיליון תאי אנדותל. לאחר מכן, הוציאו 2 מיליון תאים והעבירו אותם לפחית קונית חדשה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות, שאבו את העליון (supernatant), והשאירו את התאים כמשקע (pellet) בפחית הקונית. כעת, הכינו את ההידרוג'ל מסוג high aurin בהתאם לפרוטוקול של החברה.ערבב aurin בריכוז גבוה וג'לטין נוזלי ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן, העבר 80% מהנפח הסופי הכולל אל המבחנה הקונית המכילה את המשקע, וסספנד (resuspend) את התאים האנדותלליים בתערובת ה-aurin והג'לטין. לאחר מכן, העבר את התאים הסספנדים אל המטריצה הסיבית.הוסיפו 20% מהנפח הסופי הכולל של חומר הקישור (crosslinker) והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. בשלב זה, הוציאו מהאינקובטור את פלטת ה-35 millimeter P nypa שעובדה עם התאים והניחו אותה במנדף לתרביות תאים. בטמפרטורת החדר, שאבו במהירות את המצע מהתאים.לאחר מכן, הוסיפו לצלחת שני מיליליטרים של ג'לטין רגיל בריכוז 6% בטמפרטורה של 37 °C בעוד הג'לטין עדיין חם, והניחו את סבכת המתכת בתוך הג'לטין, כך שתהיה שקועה מתחת לפני השטח של הג'לטין הרגיל. לאחר מכן, הניחו את הצלחת כולה על קרח למשך חמש עד שבע דקות, כדי לאפשר לג'לטין להתקשח. לאחר שבע דקות, השתמשו בשפכטול כדי להפריד בזהירות את קצוות הג'לטין מדפנות הצלחת.לאחר מכן, הרם את סריג המתכת מהפלטה באמצעות פינצטה. העבר את גיליון התאים לכלי המעבדה והנח אותו מעל השילוב של המטריצה הסיבית וההידרוג'ל. הוסף 2 mL של מצע גידול בטמפרטורה של 37 °C לפלטת תרבית הרקמות והדגר למשך לילה כדי לאפשר לגיליון התאים להיצמד לפני השטח של ההידרוג'ל.בינתיים, יש להסיר את סבב המתכת לאחר שהתמיסה התחממה. במקרה זה, תאים תורבדו על משטח מצופה ב-Pippa ולאחר מכן הועברו כגיליון למשטח של המטריצה הסיבית. ניסיונות ראשוניים שבהם לא בוצע העברה באמצעות סבב המתכת עם הג'לטין הסתיימו בכתמים קטנים וקרועים.תמונה זו מייצגת תמונה מרוכבת של עיצוב ראשוני של טלאי, המשלבת את ה-mito tracker, תאי שריר חלקים של אבי העורקים של חולדה שנצבעו באדום, תאי אנדותל של וריד טביליות אנושיים עם פלואורסצנציה של calcium am green, ואת תמונת האור המועבר. וזוהי התמונה המרוכבת של גיליון תאים בשילוב עם שילוב של הידרוג'ל מטריצה סיבית בסיסית חזקה יותר. תמונה מרוכבת זו צולמה מהחלק התחתון של הטלאי דרך מטריצה סיבית בסיסית חזקה יותר, ותמונה מרוכבת זו של גיליונות התאים צולמה מעל המטריצה הסיבית הבסיסית.שילוב תאי ההידרוג'ל בגיליון מכסה את שילוב ההידרוג'ל של המטריצה הסיבית הבסיסית, אשר מראה פלואורסצנציה מוגברת בקצוות עקב התקבצות של התאים. זוהי תמונת תמסורת של המבנה, והמטריצה הסיבית הטבעית בעלת האוטופלואורסצנציה מוצגת כאן ב-DPI. בעקבות הליך זה, ניסויי הנדסת רקמות אחרים יכולים לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד יישור תאים ותקשורת ביניהם משפיעים על הצלחת ההשתלה.טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור דרכים מורכבות להשתלה של סוגי תאים מרובים. זכרו כי עבודה עם ממסים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת מסכות מתאימות ועבודה תחת מנדף כימי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

tissue-engineering-construction-multicellular-3d-scaffold-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בעבודה זו אנו מציגים טכניקה לייצור מהיר של רקמות כלי דם חיות על ידי תרבית ישירה של קולגן, תאי שריר חלק ותאי אנדותל. בנוסף, מתואר פרוטוקול חדש לאפיון מכני של רקמות כלי דם מהונדסות.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

מדפסת ביולוגית קרטזית תוכננה ויוצרה כדי לאפשר שקיעה מרובת חומרים בגיאומטריות מדויקות הניתנות לשחזור, תוך מתן אפשרות לשליטה בגורמים סביבתיים. באמצעות המדפסת הביולוגית התלת מימדית, ניתן להדפיס מבנים מורכבים ובני קיימא ולשכפל אותם בקלות.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

בעבודה זו הוכנו פיגומי פולי (חומצה לקטית)/פוליאתילן גליקול (PLA/PEG) באמצעות שילוב של ערבוב נמס ושטיפה סלקטיבית. השיטה הנדונה כאן אפשרה לפתח פיגומים תלת שכבתיים על ידי שליטה רבה הן בנקבוביות והן בגודל הנקבוביות. התכונות המכניות הוערכו גם בסביבה פיזיולוגית.

קליל ידידותי לסביבת כביש לפברק פולי (החומצה לקטית) פיגומים עם גודל מדורג נקבובי

נדגים שיטה לבניית אסיפה מבוססת על תא בודד (3D) תלת-ממדי ללא לגרדום מלאכותי.

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

מאמר זה מספק שיטה ריאלי ויעיל עבור בניית מרובה שכבות תאי גזע סדינים עם מאפיינים חיוביים תאי גזע.

בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד

מוצג כאן הוא פשוט לשימוש, ליבה/פגז, תלת מימדי ביוריטינג הגדרת עבור הייצור צעד אחד של הפיגומים החלול, מתאים הנדסת רקמות של כלי דם ומבנים צינורי אחרים.

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

למד לבנות פיגום תאית תלת-ממדי להנדסת רקמות באמצעות גיליונות תאים ופולימרים תרמורגישים. השיטה מאפשרת יצירת רקמות שכבתיות לשתלים עם שמירה על שלמות התאים.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

גלה סרטונים נוספים