הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות
October 3rd, 2014
ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב. עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש ביריעות תאים לבניית מדבקה מהונדסת רקמות. זה מושג על ידי טיפול ראשון במשטח תרבית התאים עם הפולימר הרגיש לתרמו פולי פרופיל אקרילאמיד, המכונה גם p nipam. השלב השני הוא תרבית התאים המעניינים בצפיפות גבוהה על המשטח המצופה בפולימר ליצירת יריעות תאים.
לאחר מכן, הסדינים מורמים על ידי הורדת טמפרטורת הצלחת, מה שמאפשר לתאים להתנתק מהצלחת כיריעת תאים. השלב האחרון הוא להזיז את יריעות התאים השלמות מבלי לקרוע אותן על מבנה להשתלה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופ אור פשוט כדי להראות כי יריעת התא נוצרה ונשמרה במהלך המניפולציה שלה תוך יצירת חומר מהונדס רקמות מושתל.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, אשר יטמיעו תאים במטריקס כמו הידרוג'לים, הוא שבטכניקה זו ניתן ליצור ולתחזק את גבולות התאים הרוחביים כרקמה פונקציונלית. שיטות אלו יכולות לאפשר גם מחקרים נוספים בתחום הנדסת רקמות. לדוגמה, עד כמה התאים שורדים לאחר ההשתלה כשהם במצב מאורגן זה?
מישידגים את ההליך הזה יהיה ד"ר וויליאם טרנר, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי וגב' Snapshot sand do. כדי להתחיל בהליך זה, יש להמיס 2.6 גרם P nipam בשני מיליליטר של תמיסת טולואן 60%, 40% הקסאן. לאחר מכן, מחממים את התערובת ל-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומערבבים עד להמסת ה-P nipam.
לאחר מכן חותכים את נייר הסינון לעיגול בקוטר 60 מילימטר ומניחים אותו במשפך בוכנר. מסננים את התמיסה דרך משפך בוכנר לכוס זכוכית שקולה מראש. שמור את הכוס והתכולה בוואקום פעמון למשך הלילה.
לאחר מכן, שקלו את הכוס עם p nipam. לאחר מכן הוסף אלכוהול איזופרופיל ל- P nipam ליצירת תמיסה במשקל 50 50. לאחר מכן, הניחו שני מיליליטר מהתמיסה על פני צלחת תרבית הרקמות וצפו אותה במשך חמש דקות באור UV.
לאחר מכן שטפו את הצלחת בשני מיליליטר PBS חם פעמיים לפני השימוש בה לתרבית תאים. בהליך זה, ראשית, בודד את תאי השריר החלק של אבי העורקים של החולדה על ידי שטיפת התאים בשני מיליליטר PBS חם. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שלושה מיליליטר טריפסין או תמיסה מפרקת אחרת ודגרו למשך חמש דקות.
לאחר מכן הוסף לתאים שלושה מיליליטר של אמצעי התרבות או PBS המכיל 10% FBS. לאחר מכן, אספו את התאים בצינור חרוטי וספרו אותם. לאחר מכן, סובב את התאים ב -1000 סל"ד למשך חמש דקות.
שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במצע הגידול. לאחר מכן הניחו את המדיה המכילה את התאים על צלחת רגישה לחום של 35 מילימטר בריכוז שישיג 100% מפגש, ואז דגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לשמור על הידבקות התא לצלחת. כעת אספו את תאי האנדותל ופזרו אותם לתמיסת תא בודד.
שימוש בטריפסין אחד, מאגר אקואט או דיסוציאציה של תאים יכול לשמש גם לפיזור תאים בודדים. לאחר מכן, השבת את אנזים הטריפסין עם כמות שווה של מעכב טריפסין פולי סויה או 10% FBS ב-PBS. לאחר מכן אוספים את התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
ספרו את התאים בעזרת ציטומטר המו וחשבו את הנפח הדרוש למידות התיקון עבור טלאי של ארבעה מילימטרים, משתמשים ב-2 מיליון תאי אנדותל לאחר מכן, חלצו 2 מיליון תאים והניחו אותם בצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות, שאפו את הסופרנטנט, והשאירו את התאים ככדור בצינור החרוטי. כעת הכינו את ההידרוג'ל הגבוה של אורין בהתאם לפרוטוקול החברה.
מערבבים אורין גבוה וג'לטין נוזלי ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן העבירו 80% מהנפח הסופי הכולל לצינור החרוטי המכיל את הגלולה, השעו מחדש את תאי האנדותל בתערובת הג'לטין הגבוהה של אורין. לאחר מכן, העבירו את התאים התלויים למטריצה הסיבית.
הוסף 20% מהנפח הסופי הכולל של הקישור המוצלב ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בשלב זה, הסר את הצלחת המטופלת ב-35 מילימטר P nypa המכילה את התאים מהאינקובטור והנח אותה במכסה תאים. בטמפרטורת החדר, שאפו במהירות את המדיה מהתאים.
לאחר מכן הוסיפו לצלחת שני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, 6% ג'לטין רגיל בזמן שהג'לטין עדיין חם, הניחו את סריג המתכת לתוך הג'לטין, ושקעו אותו מתחת לפני השטח של הג'לטין הרגיל. לאחר מכן, הניחו את כל הצלחת על קרח למשך חמש עד שבע דקות, ואפשרו לג'לטין להתקשות. לאחר שבע דקות, השתמש במרית כדי להפריד בזהירות את שולי הג'לטין מצד הצלחת.
לאחר מכן, הרם את סריג המתכת מהצלחת בעזרת מלקחיים. העבירו את דף התא לכלי והניחו אותו על גבי שילוב ההידרוג'ל של מטריצה סיבית. הוסף שני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס לצלחת תרבית הרקמה ודגירה למשך הלילה כדי לאפשר ליריעת התאים להיצמד למשטח ההידרוג'ל.
בינתיים, הסר את סריג המתכת לאחר שהתמיסה התחממה. כאן, תאים תורבבו על משטח מצופה פיפה ולאחר מכן הועברו כיריעה אל פני השטח של המטריצה הסיבית. ניסויים מוקדמים שלא הועברו עם סריג מתכת הג'לטין הובילו לכתמים קטנים ומרופטים.
תמונה זו מייצגת תמונה מורכבת מוקדמת בעיצוב טלאי המשלבת את גשש המיטו, תאי שריר חלק אבי העורקים של חולדה צבועה באדום, תאי אנדותל וריד טבורי אנושי פלואורסצנטי בסידן וירוק ותמונת האור המועבר. וזה השילוב של יריעת התאים בשילוב עם שילוב הידרוג'ל מטריצה סיבית בסיס חזק יותר. תמונה מרוכבת זו צולמה מתחתית המדבקה דרך מטריצה סיבית בסיסית חזקה יותר, ותמונה מורכבת זו של יריעות התאים צולמה מעל המטריצה הסיבית הבסיסית.
תאי שילוב הידרוג'ל בסדין מכסים את שילוב ההידרוג'ל של מטריצת הבסיס הסיבית, המראים פלואורסצנטיות מוגברת בקצוות עקב צרור התאים. זוהי תמונת שידור של המבנה ומטריצת הבסיס הסיבית הטבעית האוטו-פלואורסצנטית ב-DPI מוצגת כאן. בעקבות הליך זה, ניסויים אחרים בהנדסת רקמות יכולים לענות על שאלות אחרות כגון כיצד יישור תאים ותקשורת משפיעים על הצלחת ההשתלה.
טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בהנדסת רקמות לחקור דרכים מורכבות להשתלת סוגי תאים מרובים. אל תשכח שעבודה עם ממיסים עלולה להיות מסוכנת ביותר. תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת מסכות מתאימות ומנדפים כימיים בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבניית פאטץ' מהונדס רקמות באמצעות יריעות תאים. התהליך כולל טיפול במשטח תרבית תאים עם פולימר רגיש לטמפרטורה וטיפוח תאים ליצירת יריעות שלמות להשתלה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- טכניקות טיפוח תאים
- חומרים ביולוגיים
רקע
- יצירת מבנים מאורגנים של רקמות מורכבות דורשת סוגים רבים של חומרים ותאים.
- ניצול יריעות תאים מרובדות ספציפיות לאבר משפר את אינטגרציה הרקמות.
- חומרים שמקורם ביולוגי יכולים לתמוך בהיווצרות כלי דם חדשים.
- פולימרים רגישים לטמפרטורה מאפשרים את ניתוק יריעות התאים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לבניית פאטץ' מהונדס רקמות.
- להשתמש ביריעות תאים לטכניקות השתלה משופרות.
- להדגים את היתכנות שמירת שלמות התאים במהלך מניפולציה.
שיטות ששימשו
- טיפול במשטחי תרבית תאים עם פולי פרופיל אקרילאמיד (pNIPAM).
- טיפוח תאים בצפיפות גבוהה על המשטח המצופה בפולימר.
- הרמת יריעות התאים על ידי הורדת הטמפרטורה לניתוקן.
- העברת יריעות תאים שלמות אל מבנה להשתלה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של יריעות תאים שניתן לתמרן אותן ללא קריעה.
- מיקרוסקופיה קלה אישרה את שלמות יריעות התאים במהלך התהליך.
- השיטה מאפשרת בניית חומרים מהונדסים רקמות ניתנים להשתלה.
- הוכח הפוטנציאל לחיבור כלי דם משופר ברקמות מהונדסות.
מסקנות
- המחקר מציג שיטה מעשית ליצירת פאטצ'ים מהונדסים רקמות.
- שימוש בפולימרים רגישים לטמפרטורה הוא יעיל למניפולציה של יריעות תאים.
- גישה זו עשויה לקדם את תחום הנדסת הרקמות באופן משמעותי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables the construction of multicellular 3D scaffolds using layered cell sheets, addressing a key challenge in regenerative medicine: delivering organized, multi-cellular constructs with preserved cell-cell interactions and vascular potential. By preserving lateral cell borders and enabling sheet transfer onto biomatrix composites, the technique supports predictive confidence in preclinical models of tissue integration and function. It offers a scalable, off-the-shelf approach for therapeutic tissue design applicable across multiple organ systems beyond cardiac tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by maintaining cell sheet integrity and lateral adhesions during manipulation.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through organized cell delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized, implantable tissue constructs.
- Operational Value: Supports assay readiness through temperature-dependent sheet detachment and transfer, enabling scalable workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by combining organ-specific cells with neovascular-permissive hydrogels and endothelial cells.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation via off-the-shelf, implantable patches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in tissue engineering applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled delivery of layered cell types with preserved interactions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible cell sheet formation and transfer onto biomatrix platforms.
- Analytics: Generates quantitative outputs via light microscopy and fluorescence tracking to assess sheet integrity and vascular integration.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by constructing implantable patches with vascular potential for functional tissue assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for generating off-the-shelf tissue constructs across multiple organ targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell-cell interactions and organized tissue architecture.
- Operational Value: Standardization and scalability via temperature-sensitive polymer coating and sheet lifting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in tissue integration and survival.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through enhanced predictive value in preclinical tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, biomaterials handling, and temperature-sensitive polymer techniques.
- Depends on UV crosslinking, hydrogel preparation, and precise temperature control for sheet detachment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sheet quality and transfer efficiency.
- Involves adaptation considerations when applying to different cell types or organ-specific matrices.
- Includes practical limitations such as solvent hazards during pNIPAM preparation and the need for aseptic handling throughout.
