הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות
3 באוקטובר 2014
ליצירת מבנים מאורגנים מאוד של רקמה מורכבת, יש להרכיב מספר חומרים וסוגי תאים לכדי קומפוזיט משולב. עיצוב קומבינטורי זה משלב יריעות תאים שכבתיות ספציפיות לאיבר עם שני חומרים נפרדים שמקורם ביולוגית המכילים בסיס מטריצה סיבי חזק, ותאי אנדותל לשיפור היווצרות כלי דם חדשים.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בגילי תאים לבניית טלאי הנדסת רקמות. דבר זה מושג תחילה על ידי טיפול במשטח תרבית התאים בפולימר הרגיש לטמפרטורה poly propyl acrylamide, המכונה גם p nipam. השלב השני הוא גידול התאים הרלוונטיים בצפיפות גבוהה על המשטח המצופה בפולימר כדי ליצור גילי תאים.
בשלב הבא, הדפים מורמים על ידי הורדת טמפרטורת הפלטה, דבר המאפשר לתאים להיפרד מהפלטה כדף תאים. השלב הסופי הוא העברת דפי התאים השלמים, ללא קרע, אל מבנה להשתּלה. לבסוף, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה של אור פשוטה כדי להראות כי דף התאים נוצר ונשמר במהלך המניפולציה, תוך כדי יצירת חומר להנדסת רקמה המיועד להשתּלה.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, אשר משככות תאים בתוך מטריצה כגון הידרוג'לים, הוא שבטכניקה זו ניתן ליצור ולשמר את הגבולות הצידיים של התאים כרקמה פונקציונלית. שיטות אלו עשויות לאפשר מחקרים נוספים בתחום הנדסת הרקמות. לדוגמה, עד כמה התאים שורדים לאחר השתלה כאשר הם נמצאים במצב מאורגן זה?
את הפרוצדורה הזו ידגים ד"ר William Turner, פוסט-דוקטורנט במעבדתי, וגב' Snapshot sand do. כדי להתחיל בפרוצדורה, המסו 2.6 grams של P nipam בשני milliliters של תמיסה הכוללת 60% toluene ו-40% hexane. לאחר מכן, חממו את התערובת ל-60 °C למשך 10 דקות וערבבו עד להמסה מלאה של ה-P nipam.
לאחר מכן, גזרו את נייר המסנן לעיגול בקוטר 60 millimeter והניחו אותו במשפך בוכנר. סננו את התמיסה דרך משפך הבוכנר לתוך כוס כימיאית מזכוכית שנשקלה מראש. השאירו את הכוס ותכולתה בתוך צנצנת ואקום למשך לילה.
לאחר מכן, שקלו את הכלי עם ה-p nipam. לאחר מכן, הוסיפו isopropyl alcohol ל-P nipam כדי ליצור תמיסה ביחס של 50 50 לפי משקל. לאחר מכן, הניחו שני מיליליטרים מהתמיסה על פני פלטת תרביות רקמה וחשפו אותה למשך חמש דקות תחת אור UV.
לאחר מכן, שטפו את הפיתח פעמיים עם 2 mL של PBS חמים לפני השימוש בו לתרבית תאים. בהליך זה, תחילה, בודדו את תאי השריר החלק של אבי העורקים של חולדה על ידי שטיפת התאים עם 2 mL של PBS חמים. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 3 mL של trypsin או תמיסת דיסוציאציה (פירוק) אחרת והדגרימו למשך חמש דקות.
לאחר מכן, הוסיפו לתאים שלושה מיליליטרים של מצע גידול או PBS המכיל 10% FBS. לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרת קונית וספרו אותם. לאחר מכן, סובבו את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות.
שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את התאים במצע גידול. לאחר מכן, העבירו את המצע המכיל את התאים לצלחת תרמו-סנסטיבית של 35 מילימטר בריכוז שיביא ל-100% Confluence, ולאחר מכן הדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה כדי לשמר את היצמדות התאים לצלחת. כעת, אספו את תאי האנדותל ופזרו אותם לתמיסה של תאים בודדים.
ניתן להשתמש גם ב-trypsin בריכוז 1x, ב-accutase או בבuffer לפירוק תאים לצורך פיזור של תאים בודדים. לאחר מכן, יש לבטל את פעילות אנזים ה-trypsin באמצעות כמות שווה של מעכב trypsin מפולי סויה או 10% FBS ב-PBS. לאחר מכן, אספו את התאים לשפופרת קונית של 15 milliliters.
ספרו את התאים באמצעות המוסימטר (hemo cytometer) וחשבו את הנפח הדרוש עבור ממדי התחבולה; עבור תחבולה של ארבעה מילימטרים, נעשה שימוש ב-2 מיליון תאי אנדותל. לאחר מכן, הוציאו 2 מיליון תאים והעבירו אותם לפחית קונית חדשה של 15 מיליליטר. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות, שאבו את העליון (supernatant), והשאירו את התאים כמשקע (pellet) בפחית הקונית. כעת, הכינו את ההידרוג'ל מסוג high aurin בהתאם לפרוטוקול של החברה.
ערבב aurin בריכוז גבוה וג'לטין נוזלי ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן, העבר 80% מהנפח הסופי הכולל אל המבחנה הקונית המכילה את המשקע, וסספנד (resuspend) את התאים האנדותלליים בתערובת ה-aurin והג'לטין. לאחר מכן, העבר את התאים הסספנדים אל המטריצה הסיבית.
הוסיפו 20% מהנפח הסופי הכולל של חומר הקישור (crosslinker) והדגירו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. בשלב זה, הוציאו מהאינקובטור את פלטת ה-35 millimeter P nypa שעובדה עם התאים והניחו אותה במנדף לתרביות תאים. בטמפרטורת החדר, שאבו במהירות את המצע מהתאים.
לאחר מכן, הוסיפו לצלחת שני מיליליטרים של ג'לטין רגיל בריכוז 6% בטמפרטורה של 37 °C בעוד הג'לטין עדיין חם, והניחו את סבכת המתכת בתוך הג'לטין, כך שתהיה שקועה מתחת לפני השטח של הג'לטין הרגיל. לאחר מכן, הניחו את הצלחת כולה על קרח למשך חמש עד שבע דקות, כדי לאפשר לג'לטין להתקשח. לאחר שבע דקות, השתמשו בשפכטול כדי להפריד בזהירות את קצוות הג'לטין מדפנות הצלחת.
לאחר מכן, הרם את סריג המתכת מהפלטה באמצעות פינצטה. העבר את גיליון התאים לכלי המעבדה והנח אותו מעל השילוב של המטריצה הסיבית וההידרוג'ל. הוסף 2 mL של מצע גידול בטמפרטורה של 37 °C לפלטת תרבית הרקמות והדגר למשך לילה כדי לאפשר לגיליון התאים להיצמד לפני השטח של ההידרוג'ל.
בינתיים, יש להסיר את סבב המתכת לאחר שהתמיסה התחממה. במקרה זה, תאים תורבדו על משטח מצופה ב-Pippa ולאחר מכן הועברו כגיליון למשטח של המטריצה הסיבית. ניסיונות ראשוניים שבהם לא בוצע העברה באמצעות סבב המתכת עם הג'לטין הסתיימו בכתמים קטנים וקרועים.
תמונה זו מייצגת תמונה מרוכבת של עיצוב ראשוני של טלאי, המשלבת את ה-mito tracker, תאי שריר חלקים של אבי העורקים של חולדה שנצבעו באדום, תאי אנדותל של וריד טביליות אנושיים עם פלואורסצנציה של calcium am green, ואת תמונת האור המועבר. וזוהי התמונה המרוכבת של גיליון תאים בשילוב עם שילוב של הידרוג'ל מטריצה סיבית בסיסית חזקה יותר. תמונה מרוכבת זו צולמה מהחלק התחתון של הטלאי דרך מטריצה סיבית בסיסית חזקה יותר, ותמונה מרוכבת זו של גיליונות התאים צולמה מעל המטריצה הסיבית הבסיסית.
שילוב תאי ההידרוג'ל בגיליון מכסה את שילוב ההידרוג'ל של המטריצה הסיבית הבסיסית, אשר מראה פלואורסצנציה מוגברת בקצוות עקב התקבצות של התאים. זוהי תמונת תמסורת של המבנה, והמטריצה הסיבית הטבעית בעלת האוטופלואורסצנציה מוצגת כאן ב-DPI. בעקבות הליך זה, ניסויי הנדסת רקמות אחרים יכולים לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד יישור תאים ותקשורת ביניהם משפיעים על הצלחת ההשתלה.
טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור דרכים מורכבות להשתלה של סוגי תאים מרובים. זכרו כי עבודה עם ממסים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת מסכות מתאימות ועבודה תחת מנדף כימי, בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבנייה של טלאי הנדסת רקמות באמצעות שכבות תאים. התהליך כולל טיפול של פני השטח של תרבית תאים בפולימר רגיש לחום וגידול תאים ליצירת שכבות שלמות להשתרה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- טכניקות לתרבית תאים
- ביומטריאלים
רקע
- יצירת מבנים מאורגנים של רקמות מורכבות דורשת מספר סוגי תאים וחומרים.
- שימוש בדפי תאים שכבתיים הספציפיים לאיבר משפר את השילוב של הרקמה.
- חומרים ממקור ביולוגי יכולים לתמוך ביצירת כלי דם חדשים.
- פולימרים תרמו-סנסטיביים מקלים על ניתוק דפי התאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לבניית טלאי בהנדסת רקמות.
- שימוש בגילי תאים לשיפור טכניקות ההשתלה.
- הדגמת ההיתכנות של שמירה על שלמות התאים במהלך המניפולציה.
שיטות ששימשו במחקר
- טיפול במשטחי תרביות תאים באמצעות פולי פרופיל אקרילאמיד (pNIPAM).
- גידול תאים בצפיפות גבוהה על המשטח המצופה בפולימר.
- הרמה של גילי תאים על ידי הורדת הטמפרטורה כדי להפריד אותם.
- העברה של גילי תאים שלמים למבנה להשתלה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של דפי תאים שניתן לתמרן מבלי שייקרעו.
- מיקרוסקופיה של אור אישרה את שלמות דפי התאים במהלך התהליך.
- השיטה מאפשרת בנייה של חומרים להנדסת רקמות הניתנים להשתלה.
- הוכח הפוטנציאל לשיפור הווסקולריזציה ברקמות מהונדסות.
מסקנות
- המחקר מציג שיטה ישימה ליצירת טלאים בהנדסת רקמות.
- שימוש בפולימרים רגישים לטמפרטורה יעיל למניפולציה של דפי תאים.
- גישה זו עשויה לקדם באופן משמעותי את התחום של הנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בנייה של פיגומים תלת-ממדיים רב-תאיים באמצעות שכבות של דפי תאים, ובכך היא נותנת מענה לאתגר מרכזי ברפואה רגנרטיבית: אספקת מבנים רב-תאיים מאורגנים עם אינטראקציות תא-תא שנשמרו ופוטנציאל כלי דם. על ידי שימור הגבולות הצדיים של התאים ואפשרות להעברת הדפים על גבי תרכובות ביו-מטריקס, הטכניקה תומכת בביטחון ניבוי במודלים פרה-קליניים של השתלבות תאיות ותפקוד רקמתי. היא מציעה גישה ניתנת להרחבה וזמינה (off-the-shelf) לעיצוב רקמות טיפוליות, שניתן להחילה על מערכות איברים מרובות מעבר לרקמה לבבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי שמירה על שלמות גילי התאים ועל ההיצמדות הלטראלית במהלך המניפולציה.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות הובלה מאורגנת של תאים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף להערכת תרכובות בשלבים הבאים, באמצעות יצירת מבני רקמה סטנדרטיים הניתנים להשתלה.
- ערך תפעולי: תמיכה במוכנות הבדיקה באמצעות ניתוק והעברה של דפי רקמה התלויים בטמפרטורה, המאפשרים זרימת עבודה ניתנת להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מגביר את הרלוונטיות למחלה על ידי שילוב של תאים ספציפיים לאיבר עם הידרוגלים המאפשרים נאווסקולריזציה ותאי אנדותל.
- ערך תפעולי: מקל על רציפות טרנסלציונלית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מדבקות מושתלות מוכנות לשימוש (off-the-shelf).
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרה מוקדם, דרך זיהוי מועמד תרופתי ועד למחקרים פרה-קליניים, ובכך היא תומכת בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים ביישומים של הנדסת רקמות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות להעברה מבוקרת של סוגי תאים בשכבות תוך שימור האינטראקציות ביניהם.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות (assays) באמצעות יצירה הדירה של גילי תאים והעברתם על פלטפורמות של ביו-מטריקס.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים כמותיים באמצעות מיקרוסקופיה של אור ומעקב פלואורסצנציה להערכת שלמות הגלי והשילוב הווסקולרי.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי בניית טלאים הניתנים להשתלה עם פוטנציאל וסקולרי לצורך הערכה תפקודית של הרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת ניתנת לשימוש חוזר ליצירת מבני רקמה מוכנים לשימוש (off-the-shelf) עבור מגוון יעדי איברים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באמצעות שמירה על אינטראקציות בין תאים וארכיטקטורת רקמה מאורגנת.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ציפוי פולימר רגיש לטמפרטורה והרמה של השכבה התאית.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של המשך או הפסקת ניסוי (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטגרציה והישרדות של רקמות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים באמצעות ערך ניבוי משופר במודלים פרה-קליניים של רקמות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, טיפול בחומרי ביו-מטריאל וטכניקות של פולימרים רגישים לטמפרטורה.
- תלוי בקשירה צולבת באמצעות UV, הכנת הידרוג'ל ובקרה מדויקת של הטמפרטורה לצורך ניתוק השכבה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להשגת איכות שכבה עקבית ויעילות העברה.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום על סוגי תאים שונים או מטריצות ספציפיות לאיברים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון סכנות ממסים במהלך הכנת pNIPAM והצורך בטיפול אספטי לאורך כל התהליך.
