Name: הדמיית הלבלב Neuroplasticity: במבחנה Dual-נוירון פלסטיות Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: חקור נוירופלסטיות בדרכי העיכול באמצעות מודל מבחנה עם נוירוני DRG ו-MP מעכברים. השיטה מאפשרת הערכה מורפולוגית ואלקטרופיזיולוגית של תגובות נוירוניות וגליאליות לתמציות רקמת הלבלב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל המחברים תרמו להקמת והאימות של assay הציג ולטיוטה של ​​כתב היד.

כל הליכי הניסוי בבעלי החיים בפרוטוקול לעקוב אחר הנחיות הטיפול בבעלי החיים של Technische Universität München, גרמניה. 1. מדיה / חלץ ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המגון רקמה האיכות של הומוגניזציה הרקמה היא קריטית לאיתור הבא של שינויי neuroplastic בנוירונים בתרבית. הנה, homogenizer מומלץ המאפשר ניתוק רקמות ללא עלייה משמעותית בטמפרטורת הרקמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ קוביות של רקמת לבלב ישירות מ-80 מעלות צלזיוס לחנקן נוזלי ומקום בשלב מוצק בhomogenator הרקמות. Homogenator האידיאלי יהיה לנתק את הרקמה מספיק מהר, מבלי שמאפשרים לו defreeze. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר ניתוק, resuspend homogenate המוצק, כמו האבקה ב300-500 μl של פוספט שנאגרו מלוח 0.1x (PBS). הנה, לא להשתמש בכל מאגר תמוגה (כגון ריפה) שכן דבר עלול lyse הנוירונים.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenates לפחות 15 דקות במהירות מקסימלית של צנטריפוגות הספסל (למשל 21,130 XG). לאסוף את supernatant ברור המייצג את תמצית הרקמות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants שורת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים של עניין להגיע לפחות 70-80 מפגש% במדיום גידול רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, תקשורת אלה מכיל מרכיבי סרום ויכולה להפעיל את השפעה בלתי נשלטת על צמיחה עצבית. לכן, לאחר שהגיע לצפיפות התאים הרצוי, לשטוף התאים שלך לפחות 3x עם הכיתה תרבית תאי PBS ולמקם אותם במדיום סרום ללא (SFM) עד 48 שעה. הערה: הנה, קח בחשבון שחלק מתאים (כמו תאי stellate לבלב) ייתכן שיהיו צורך בסרום בתקשורת הצמיחה שלהם על מנת לשמור על המצב הרגיל שלהם ומבנה. במקרים כאלה, לבצע דילולים סידוריים סרום במדיום של התא של עניין כדי למצוא התוכן הנמוך ביותר אפשרי הסרום הדרוש לfunctio תא ללא פגעn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון של homogenate הרקמה או supernatants תא באמצעות assay החלבון ברדפורד. בעוד ערכים אלה משתנים בהתאם לסוג הרקמות ותאים, לתמציות רקמת לבלב, הייתי מצפה טווח ריכוז בין 5-12 מיקרוגרם / μl, ולsupernatants שורת תאים בין 3-8 מיקרוגרם / μl. </li></ol></li></ol> 2. תמציות Aliquot וSupernatants הסלולרי בהתאם לריכוז לשימוש בassay, הריכוז הסופי של התמצית או supernatant במדיום העצבי צריך להיות 100 מיקרוגרם / מיליליטר 5,8. הערה: לקבלת assay עם הנוירונים גדל ב500 בינוני μl בבאר כל צלחת 24 גם, צריך 50 מיקרוגרם של חלבון מתמצית או supernatant לכל טוב. בריכוז תמצית אופייני של כ 10 מיקרוגרם / μl, אחד היה צריך 5 μl של התמצית / supernatant לכל אחד. בכל settinגרם שבוצע כשלושה עותקים, זה היה מתאימות ל15 μl של התמצית / supernatant. לסוגים שונים של רקמות או תאים, לבצע דילולים סדרתי של התמצית הסופית או ריכוז supernatant ולהשוות את השפעות נוירוטרופי שנצפו בין ריכוזי התמצית / supernatant השונים. 3. בידוד של נוירונים ברגע שאוסף התמצית / supernatant הוא סיים, להמשיך עם בידוד של נוירונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים DRG, לאסוף את צוואר הרחם להמותני DRG של חולדות שזה עתה נולדו בין יום לידה (P) 2-12 לאחר (איור 1 א) עריפת הראש ונתיחת stereomicroscopic של DRG. על מנת לקבל נוירונים DRG מספיק לצלחת 24 גם, לאסוף את כל צוואר הרחם להמותני DRG של עכברוש יילוד אחד (שווה 52 DRG) לכל צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור מהפריפריה (עצבי) ותחזיות מרכזיות (שורשים) של DRG באמצעות microscissors. עוזב את התחזיות במקום פוגע בטחינה דקה ומגביר tהוא זיהום סיכון של תרבות על ידי fibroblasts. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים מגה פיקסל, לחתוך את לפדר מהמעי הדק וידני ולפשוט בזהירות את שכבת seromuscular של המעי דק (לפרוטוקול מפורט על בידוד MP, עיין שפר et al. 9, איור 1). לחבר פרלמנט, לאסוף מקלעת משתי חולדות ל24 גם צלחת. הערה: נסה להיות עדין ככל האפשר על מנת למנוע קרעים בשכבת seromuscular שכן הם פוגעים הפרדה המוצלחת שלה מהמעי הדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את DRG ושכבת seromuscular במדיום חיוני מינימאלי קר כקרח (MEM) מסופק עם גנטמיצין (20mg במדיום 500ml) וmetronidazol (2.5 מ&quot;ג ב500 בינוני מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אוסף של DRG, דגירתם בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) מסופקת עם סוג collagenase השני של 20-30 דקות. לבידוד MP, דגירה בסוג collagenase בין 1-3 HR, בהתאם לגילושל בעל החיים (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחבר פרלמנט, לאסוף את חלקי MP דמוי רשת תחת סטראו ולהעביר לממ קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז triturate DRG ו MP באמצעות מזרקים עם ירידה בקוטר. הערה: טחינה דקה מוגזמת יכולה להרוס את תאי העצב, אבל פחות תאי גליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם אחת הבינוני מכיל DRG או MP הפכה מעונן, צנטריפוגה את ההשעיה ב93.9 XG במשך 5 דקות, להשליך בינוני ו resuspend במדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, L-גלוטמין 0.5mm ו -2% ב-27). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של תאים (כלומר תאי עצב וגליה) באמצעות hemocytometer. שים לב: מספר התאים הדרושים תלוי בפרמטר המדידה. לכימות של צפיפות neurite, צריך תרבויות צפופות יותר ולכן מספר גדול יותר של תאים מאשר למדידת תולדת neurite, גודל perikaryonalוהסתעפות דפוס של נוירונים בודדים. עבור מדידות צפיפות neurite, השתמש למשל 10,000 תאים (תא עצב + גליה) / טוב או 1,500 תאי עצב / כן. לmorphometry על נוירונים בודדים, trypsination קצר (באורך דקה-1) של תאים וזריעה של 2,500 תאים / טוב או 400 נוירונים / גם מומלץ. התשואה האופיינית לתאים המתקבלים מעכברוש אחד לא בסביבה 300,000-500,000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים ביום 13 בcoverslips מ&quot;מ אשר היו מצופים בלילה שלפני ולמעלה בארות עם מדיום Neurobasal (בתוספת 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 0.5 מ&quot;מ L-גלוטמין ו -2% ב-27) (איור 1D). הערה: השימוש בפולי-D-ליזין (40 מ&quot;ג / מ 2) או ornithine-ומכסה מחליק (1 מ&quot;ג / מיליליטר כל אחד) מצופה מצופה laminin. תאים לצרף לפולי-D-ליזין מאוד מהר, ובכך הופכים אותו מתאים לניסויים שבהם יש צורך בתאים רבים (מדידות צפיפות neurite כלומר). קובץ מצורף לlaminin הוא בחלק כללימה חלש יותר, אבל laminin הוא אמרגן חזק של תולדת neurite. לכן, מדידות על הסתעפות עצבית ואורך neurite, מעדיף ornithine / laminin ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים לצרף לבארות לילה. ביום למחרת, להכין את מדיה בתוספת התמצית (בריכוז התמצית / supernatant סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום הזריעה, ולבצע שטיפה אופציונלית, מאוד עדינה עם PBS, ולאחר מכן פיפטה התמצית / מדיה בתוספת supernatant (איור 1E) באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים לגדול במשך 48 שעות. לשאוב את התקשורת ולתקן paraformaldehyde 4% לimmunostaining (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים כפול immunofluorescence באמצעות נוירון ספציפי (למשל בטא III-טובולין) וגליה ספציפית (לדוגמא: גליה fibriallary חלבון חומצי / GFAP) סמנים (איור 1G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לmorphometry, השתמש מיקרוסקופ אור הפוכה מצוידת במצלמת CCD בwi שילובה תוכנה אוטומטית המאפשרת מדידה של צפיפות neurite (ראה טבלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפיפות neurite של תרבויות עצביות נמדדת על 4-5 photomicrographs הנציג ב200x הגדלה מ4 אזורים שונים של הצמיחה הצפופה ביותר על כל coverslip ידי שכיסה 50 מיקרומטר x 50 רשת מיקרומטר וסופר את צפיפות סיבים לכל מ&quot;ר שנמדדה בסיבים מצטלבים. התוצאה neurite, אומר מספר סניפים לכל נוירון, אורך הסניף הממוצע וגודל perikaryonal ניתן למדוד מ30 נוירונים בודדים שנבחרו באקראי מכל coverslip על ידי סימון neurites וperikarya (איור 1H). </li></ol>

<ol><li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract%3A+chronic+inflammation%2C+neurotrophic+signals%2C+and+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li>
<li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li>
<li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li>
<li>Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li>
<li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li>
<li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li>
<li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li>
<li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li>
<li>Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li>
<li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin%2FGFRalpha2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li>
<li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים מתחרים ואין גילויים פיננסיים.

הפרוטוקול הנוכחי נועד כדי להמחיש את המתודולוגיה מאחורי assay neuroplasticity הלבלב במבחנה אשר פותח לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו כדי ללמוד את המכניזם של neuroplasticity בPCA וCP 5. הפרוטוקול כרוך בהליך של שלושה ימים אשר יכול בקלות להיות מיושם ברגע שהשחקן צבר מספיק ניסיון בבידוד והתרבות של נוירונים DRG וחבר הפרלמנט. יתר על כן, הוא מייצג כלי רב ערך ללימוד התגובה הקשורה של enteric וגליה קשור-DRG לרכיבי microenvironmental לבלב. <p class="jove_content" style=";text...

שינויים במורפולוגיה במערכת העיכול (GI) עצב וצפיפות תפסו את תשומת הלב של גסטרואנטרולוגים ופתולוגים במשך זמן רב, אבל הרלוונטיות שלהם להפתופיזיולוגיה של מחלות במערכת העיכול אינן ידועות 1-3. ואכן, כמה הפרעות במערכת העיכול נפוצות מאוד כגון דלקת קיבה, ושט ריפלוקס, דלקת המעי הגס, דלקת, ודלקת תוספתן קשורות עם צפיפות עצבוב מוגברת באזורי רקמה דלקתיים 1. עם זאת, לא שמו לב אמיתי עד כה שילם למנגנונים והמשמעות של neuroplasticity במערכת העיכול. האם עצבים במערכת העיכול מורפולוגית שינו שונים מעצבים במערכת העיכול נורמלים, כלומר המצב הנורמלי של מערכת העצבים enteric, במונחים של תפקידם? מהן ההשלכות של תוכן נוירופפטידים / הנוירוטרנסמיטר שינו בעצבי enteric פלסטיק? האם neuroplasticity ההיקפי תמיד כרוך איתות שינתה למערכת העצבים המרכזית? ואיפה התחזיות של extri פלסטיק המרכזיותמסלולים עצביים במערכת העיכול NSIC? סדרה ארוכה של שאלות מפתח כגון בקלות יכולה להיות שנוצרה כשמסתכלת על המחסור בידע שלנו על ההיבטים הפונקציונליים של neuroplasticity במערכת העיכול. המחקר של neuroplasticity GI ברמה תפקודית דורש מודלים ניסיוניים בתוקף, לשחזור ועדיין ישימים בקלות. בעידן של הגדלת פופולריות וקבלה של מודלים מהונדסים גנטי מותנים עכבר (GECoMM), כגון בהגדרות vivo לשאת את הפוטנציאל להבהיר היבטים ידועים קודם לכן של neuroplasticity GI בצורה מציאותית 1. עם זאת, העיצוב והייצור של GECoMM נשאר יקרים, עתיר עבודה, ובמיוחד בזמן אכילה. יתר על כן, הם דורשים בחירה מראש של היעד להיות מווסת על תנאי בעכבר עבר שינוי הגנטי (ביטוי יתר למשל מהונדס של גורם גדילה העצבי / NGF בתאי האפיתל enteric). לפיכך, עבור desIGN של GECoMM מוצלח, חוקרים צריכים כמה אינדיקטורים (למשל נתוני ניסוי קודמים) של יעד כדאי, כלומר, שהמולקולה של עניין (כאן NGF) יכולה לפחות להיות צפויה להפעיל לכמה תופעות רלוונטיות מבחינה ביולוגית על עצבים במערכת העיכול. בקלות ניתן לגזור אינדיקטורים כגון מנאותים במודלים של מבחנה שבה תת תא מבודד מmicroenvironment המורכב של מערכת vivo בניתן cocultured סלקטיבי באופן heterotypic 4-7. האפנון של מטרות מולקולריות בהגדרת תרבות heterotypic כזה הוא בממוצע מבחינה טכנית מסורבל פחות, מהיר יותר, ולכן יכול לסייע בprefiltering מטרות כדאיות עבור אימות במחקרי vivo. לאחרונה, הצגנו במבחנה assay neuroplasticity שנועד לדמות את הצפיפות המוגברת עצבית והיפרטרופיה של ne intrapancreaticrves בסרטן לבלב אנושי (PCA) ודלקת לבלב כרוני רקמות (CP). הנה, הנוירונים הנגזרים מגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) או מקלעת myenteric (MP) נחשפו לתמציות רקמה מPCA כריתה בניתוח או CP דגימות רקמות והשוואה לאלה בתרבית בלבלב אנושי נורמלי (NP) תמציות רקמה 5. במקום תמציות רקמה, אפשר גם להשתמש supernatants שורת התאים לחקור את ההשפעה של סוגי תאים שנבחרו על neuroplasticity. בשילוב עם מדידת morphometric סטנדרטית, assay neuroplasticity הציג מאפשר הערכה תקפה ושחזור של פלסטיות עצבית בתגובה לmicroenvironments לבלב שונה. במיוחד, היא מאפשרת הסימולציה של 1) neuroplasticity מורפולוגי, כלומר השינויים בתולדת neurite, הסתעפות דפוס וגודל עצבי, ו2) neuroplasticity הפונקציונלי, כלומר שינויים ברגישות של תאי עצב היקפיים. יתר על כן, לא רק פריפריה (כלומר </em&gt; Enteric), אלא גם מרכזי (כגון: DRG או בעמוד השדרה צו שני) יכולים להיכלל הנוירונים בassay ההווה כדי לבחון את התגובה מורפולוגיים ופונקציונלית שלהם לתכני רקמות במערכת העיכול שונים. בוידאו של מורה בהווה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול הטכני לביצוע assay זה ולדון ביתרונות והחסרונות שלה. יתר על כן, אנו מפנים את תשומת לב לתחולתו של הרעיון הבסיסי של assay זה ללימוד neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.

<table><tbody><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>אורניתין/למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2533/L4544</td><td></td></tr><tr><td>13 מ"מ כיסויים</td><td>Merck</td><td></td><td>לשימוש בצלחות 24 בארות</td></tr><tr><td>Dismembranator S</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-III-tubulin נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB1637</td><td>1:200 ריכוז</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFAP</td><td>DAKO</td><td>M0761</td><td>ריכוז 1:400</td></tr><tr><td>מאגר RIPA + מעכב</td><td></td><td></td> פרוטאז <td>כל ספק</td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco / מדעי החיים</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>Gibco / מדעי החיים</td><td>17504044</td><td>ידוע כי האיכות של B-27 תלויה במספר האצווה</td></tr><tr><td>גנטמיצין/מטרונידזול</td><td></td><td></td><td>כל ספק</td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי</td><td>Gibco / מדעי החיים</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)</td><td>Gibco/Life Sciences</td><td>24020133</td><td>משפר את פעילות הקולגנאז כאשר הוא מכיל Ca/Mg</td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג II</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>CLS-2</td><td>השג מנות עם פעילות של לפחות 200 יחידות / מ"ג</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA 0.25%</td> <td>ג'יבקו/מדעי החיים</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td></td><td></td><td>כל ספק</td></tr><tr><td>אנליSIS docu תוכנה</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיית הלבלב neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; dual-נוירון פלסטיות assay

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity הוא תכונה טבועה בעצבוב המערכת ומערכת עיכול (GI) העצבים enteric תחת מצבים פתולוגיים. עם זאת, תפקיד pathophysiological של neuroplasticity בהפרעות במערכת העיכול נותר עלום. מודלים ניסיוניים חדשניים המאפשרים סימולציה ואפנון של neuroplasticity GI עשויים לאפשר הערכה משופרת של התרומה של neuroplasticity במחלות במערכת העיכול מסוימים, כגון סרטן לבלב (PCA) ודלקת לבלב כרוני (CP). כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימולציה של neuroplasticity לבלב תחת במבחנה תנאי שימוש בגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) ומקלעת myenteric הנוירונים (MP). גישה הכפולה נוירון זה מאפשר לא רק ניטור של שני neuroplasticity האיברים פנימיים וחיצוניים, אלא גם מהווה כלי רב ערך כדי להעריך עצבי ומורפולוגיה ואלקטרופיזיולוגיה גליה. יתר על כן, היא מאפשרת אפנון תפקודי של תוכן microenvironmental סיפק ללימוד Impacלא על neuroplasticity. ברגע שהוקם, assay neuroplasticity הנוכחי נושא את הפוטנציאל להיות ישים לחקר neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.

neuroplasticity מורפולוגיים בטווח הגילים שצוין של חולדות שזה עתה נולדו (P2-12) וצפיפות הזריעה, הנוירונים MP וDRG כבר לבנות רשתות עצביות צפופות לאחר 48 שעה (איור 2 א). השוואה של צפיפות neurite בין הנוירונים טיפחו בPCA, CP, ותמציות NP מגלה צפיפות גדולה יותר neurite של נוירונים DRG בPCA או תמציות CP מאשר בתמציות NP (איור 2 א) 5. אנחנו בעיקר מעדיפים נוירונים MP עב...

פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור את השינויים התגובתיים של נוירונים פריפריים לסביבות מיקרו-לבלב שונות. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת ליזאטים של רקמה שלמה מלבלב אנושי תקין וממרקמה לבלבית חולה. כשלב שני, מבודדים תאי DRG מחולדות רכים, אשר מטופלים לאחר מכן בליזאטים של הרקמה שבודדו.בהמשך, לאחר דגירה של 48 שעות, התאים מקובעים לצורך צביעה כפולה של אימונופלואורסצנציה. התוצאות מראות את ההבדלים בדפוסי ההסתעפות ובישימות הניוריטים של נוירונים ובדחיפות הגליאלית של נוירונים שגודלו בתמציות רקמות שונות. שיטה זו יכולה לסייע בקידום מחקרים בתחום הנוירו-גסטרואנטרולוגיה, כגון בחינת תפקידם של מתווכים מולקולריים בשינויים בנוירופלסטיות במחלות שונות של מערכת העיכול.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התכונות הנוירוטרופיות השונות של מחלות הלבלב, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון סרטנים או מצבים דלקתיים של כל מערכת העיכול. הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו בשיתופי פעולה עם חוקרים בתחום המחלות הנוירופתיות במערכת הפדיאטרית, כגון מחלת Ong, והחלינו אותה למטרותינו. להומוגניזציה של רקמת לבלב אנושית: העבירו קוביות של רקמת לבלב בגודל 5x5x5 מילימטר ישירות מ-80°C- לחנקן נוזלי.לאחר מכן, העבירו תחילה את הבלוקים הקפואים למבחנות הומוגניזציה שיכולות להכיל כדור דיסוציאציה ממתכת, ואז הכניסו אותם להומוגניזר רקמות ובצעו הומוגניזציה מבלי לאפשר לרקמה להפשיר מיד לאחר הדיסוציאציה. השעיקו מחדש את ההומוגנאט, שנראה כאבקה מוצקה, ב-300 עד 500 µL של 0.1 XPBS קר מאוד. אין להשתמש בבפר לזיס (lysis buffer), שכן הדבר עלול.בצעו ליזיס לנוירונים ולאחר מכן סובבו את התוצר ההומוגני ב-21,130 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. אספו את העלייה הצלולה, המכילה את תמצית הרקמה, כדי לאסוף עלייה של שורת תאים משורות תאים של לבלב אנושי. גדלו את התאים עד להגעה להסנפיגנציה (confluence) של 70% עד 80% לפחות במדיום גידול רגיל.כאשר התאים מוכנים, שטפו אותם לפחות שלוש פעמים ב-PBS בדרגת תרבית תאים, וגדלו אותם במצע ללא סרום למשך עד 48 שעות. לאחר מכן, מדדו את ריכוז החלבון של הומוגנאט הרקמה או של עלי-הנוזל (supernatants) של שורת התאים באמצעות בדיקת חלבון ברדפורד. לאחר מכן, חלקו את תמריתי הרקמה ואת עלי-הנוזל של שורת התאים למנות, כך שריכוז התמרית או עלי-הנוזל הסופי במצע הנוירונלי יהיה 100 µg/mL.ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. באמצעות חולדה רכה (newborn rat) בגיל P2 עד P12 שעברה דקפיטציה, חתכו את העור וחשפו את עמוד השדרה. לאחר מכן, בצעו למינקטומיה קדמית (anterior laminectomy) כדי לחשוף את חוט השדרה.בשלב הבא, חשפו והוציאו את גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglia) או ה-DRGs. הניחו את ה-DRG בתוספת MEM קר בקרח המכיל Gentamycin ו-metronidazole. המשיכו באיסוף ה-DRGs, החל מה-DRGs התחתונים ועד ל-DRGs הצוואריים העליונים.בסיום, אוספים 52 DRGs, כמות המספיקה לפלטה של 24 בארות. לאחר מכן, משתמשים במספרי מיקרו כדי להפריד את ה-DRGs מהשורשים והעצבים שלהם. לאחר מכן, גוזרים את כל ההשלכות הפריפריאליות והמרכזיות שנותרו.לאחר איסוף ה-DRGs, דגרו אותם ב-HBSS בתוספת collagenase type two בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, בצעו טריטורציה ל-DRGs באמצעות מזרקים בעלי קוטר קטן יותר ויותר.שימו לב כי ריכוז גבוה מדי של tri עלול להרוס נוירונים, אך הוא פחות הרסני לגליות. לאחר שהתווך המכיל את ה-DRGs הפך לעכור, סבב את התמיה בצנטריפוגה ב-93.9 times G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את התווך ובצעו resus.סספנדו את התאים במדיום neuro basal כדי להכין אותם לתרבית. השתמשו ב-hemo cytometer כדי להעריך את המספר הכולל של נוירונים וגליא. לאחר מכן, זרעו את התאים על לבישות (cover slips) מצופות מראש בקוטר 13 מילימטר.בפלטה של 24 בארות, סוג הציפוי שבו משתמשים תלוי במטרות הניסוי. לאחר מכן, מלאו את הבארות במצע נוירובזאלי (neuro basal medium) והמתינו להיצמדות התאים לבארות במהלך הלילה. למחרת, הפשיקו את המצע המועשר בתמצית רקמה או את המצע המועשר על-על (supernatant) של קו התאים.בשלב הבא, שאבו את מצע הזריעה מה-DRGs ובצעו שטיפה אופציונלית ועדינה מאוד עם PBS. לאחר מכן, טפטפו באיטיות באמצעות פיפט את המצע המועשר בתמצית רקמה או המצע המועשר בעל-נוזל (supernatant) של שורת התאים על התאים, כדי להגיע לריכוז של 100 micrograms per milliliter. כעת, הניחו לתאים לגדול במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במצע המועשר בתמצית הרקמה או בעל-נוזל של שורת התאים.שאבו את המצע וקבעו את הדגימה ב-4%paraform aldehyde לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית. לצביעה אימונופלואורסצנטית כפולה, השתמשו בסמנים ספציפיים לנוירונים וסמנים ספציפיים לגליות לצורך ניתוח גיאומטרי מורפולוגי. השתמשו במיקרוסקופ אור הפוך המצויד במצלמת CCD ובשילוב עם תוכנה אוטומטית למדידת צפיפות נויריטים בהגדלה של 200x.מדדו את צפיפות הנוריטים בתרביות עצביות על ידי הנחת רשת של 50 על 50 מיקרון וספירת צפיפות הסיבים לריבוע שנמדד בסיבים המצטלבים. חזרו על ניתוח זה עבור ארבעה אזורים שונים של הצמיחה הצפופה ביותר בארבעה עד חמישה מיקרוגרפים מייצגים בכל לביבת זכוכית (cover slip). מדדו את ממוצע מספר הענפים לנוירון בצמיחת הנוריטים, את אורך הענף הממוצע ואת הגודל הפריאנלי (perianal) מ-30 נוירונים בודדים שנבחרו אקראית מכל לביבת זכוכית, על ידי סימון הנוריטים והפריקה (perica); כאן מוצגים נוירוני DRG שגודלו עם תמצית רקמה מלבלב תקין.בניגוד לכך, נוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRG) שגודלו עם תמריות רקמה של פנקריאטיטיס כרונית או סרטן הלבלב, מראים צפיפות נוריטים גבוהה יותר. כאן מוצגים נוירונים של הפלקסוס המינטרי שגודלו עם תמריות שונות של רקמת לבלב אנושית.נוירונים של הפלקסוס המינטרי (Myenteric plexus) שגודלו בתמציות של דלקת לבלב כרונית או סרטן הלבלב בונים נוירונים ארוכים יותר ומראים דפוס הסתעפות מורכב יותר מאלו שגודלו בתמציות של לבלב תקין. כאשר נוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRG) תורגבו עם עליית הנוזל (supernatant) מתאי סרטן הלבלב, נצפתה גם עלייה בצפיפות העצבית, בדומה למה שנצפה בתמציות רקמה. עם זאת, עלייה זו הייתה הפיכה כאשר גורמים נוירוטרופיים נבחרים, כגון our tein או גורם גדילה עצבי (nerve growth factor), הוזלו או נחסמו.תאי Ggl מגיבים באופן שונה לתמריות שונות של רקמת הלבלב; תמריות של לבלב עם פנקריאטיטיס כרונית או סרטן הלבלב הגבירו את הצמיחה הגליאלית ואת מספר התאים הגליאליים בתרביות גליאליות שהופקו מ-DRG. עם זאת, ההשפעה הייתה בולטת יותר בתמריות של סרטן הלבלב מאשר בתמריות של פנקריאטיטיס כרונית. לאחר שליטתו, ניתן לבצע את הטכניקה הזו תוך ארבעה עד חמישה שעות, אם היא מבוצעת כהלכה לאחר פיתוחה.שיטה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירו-גסטרואנטרולוגיה לבחון מנגנונים של נוירופלסטיות במחלות שונות של מערכת העיכול, כולל הפרעות דלקתיות וממאירות של מערכת העיכול. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד נוירונים פריפריים כדי לחקור נוירופלסטיות בלבלב, וכיצד להטמיע מערכת זו ובדיקות אחרות לנוירופלסטיות ולשינויים עצביים אחרים בהפרעות של מערכת העיכול.

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay תלת מימדי המאפשר clonogenic הלבלב כמו אבות להתמיין אינסולין להביע המושבות מתואר. שיטה זו מנצלת חצי מוצק מדיה המכילה גורמים, methylcellulose Matrigel וצמיחה, שבו אבות יחיד להתרבות...

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג...

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

סרטון זה מדגים בדיקת נוירופלסטיות חוץ גופית כדי לחקור את השינויים המורפולוגיים בגרעיני השורש הגבי ובתאי עצב מקלעת מיאנטריים שנחשפו לתמציות רקמת לבלב אנושיות בריאות וסרטניות. בדיקה זו מאפשרת לנו לחקור את צמיחת העצבים, דפוס ההסתעפות והגודל העצבי.

בדיקת גמישות מוחית חוץ גופית של הלבלב: חקר שינויים בנוירונים במערכת העיכול שנחשפו לתמציות רקמת לבלב אנושיות בריאות וסרטניות

סרטון זה מדגים את מבחן ההגירה של תאי נוירוספירה עצביים מקדימים – בדיקה במבחנה לחקר התגובה הנודדת של תאים מקדימים עצביים מהנוירוספרה – באמצעות אנליזה מיקרוסקופית.

NPC Neurosphere Assay: בדיקה חוץ גופית כדי להעריך את התגובה הנודדת של תאים מבשרי עצבים מן הנוירוספרה

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

אנו מתארים פרוטוקול לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים שמקורם בעור לתאי אב עצביים המושרים (iNPCs), ואת הבידול הבא שלהם לאסטרוציטים המושרים (iAs). שיטה זו מובילה לייצור מהיר וניתן לשחזור של iNPCs ו- iAs בכמויות גדולות.

אין ויטרו מידול למחלות נוירולוגיות באמצעות המרה ישירה מפיברובלסטים לתאי אב עצביים ובידול לאסטרוציטים

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה משופרת להגברת הביטוי המשותף של פקטורי שעתוק PDX1 ו-NKX6.1 באבות לבלב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בחד-שכבתיים מישוריים. זה מושג על ידי חידוש המטריצה הטרייה, מניפולציה של צפיפות התא, וניתוק התאים האנדודרמליים.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית

כאן, אנו משתמשים ב- HD-MEA כדי להתעמק בדינמיקה חישובית של הרכבים עצביים בקנה מידה גדול, במיוחד בהיפוקמפוס, מעגלי פקעות ריח ורשתות נוירונים אנושיות. לכידת פעילות מרחבית-זמנית, בשילוב עם כלים חישוביים, מספקת תובנות לגבי מורכבות ההרכב העצבי. השיטה משפרת את ההבנה של תפקודי המוח, ועשויה לזהות סמנים ביולוגיים וטיפולים להפרעות נוירולוגיות.

הקלטה וניתוח של דינמיקה של אנסמבל עצבי רב-מודאלי בקנה מידה גדול במערך מיקרואלקטרודות בצפיפות גבוהה משולב CMOS

פרוטוקול זה נועד להרכיב ביציבות מכלולים מאוחים גביים-גחונים על מערכים מרובי אלקטרודות לצורך מידול אפילפסיה במבחנה.

פלטפורמה מרובת אלקטרודות למידול אפילפסיה באמצעות מכלולי מוח פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי גזע

חקור נוירופלסטיות בדרכי העיכול באמצעות מודל מבחנה עם נוירוני DRG ו-MP מעכברים. השיטה מאפשרת הערכה מורפולוגית ואלקטרופיזיולוגית של תגובות נוירוניות וגליאליות לתמציות רקמת הלבלב.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:

גלה סרטונים נוספים