הדמיית הלבלב Neuroplasticity:
14 באפריל 2014
פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור את השינויים התגובתיים של נוירונים פריפריים לסביבות מיקרו-לבלב שונות. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת ליזאטים של רקמה שלמה מלבלב אנושי תקין וממרקמה לבלבית חולה. כשלב שני, מבודדים תאי DRG מחולדות רכים, אשר מטופלים לאחר מכן בליזאטים של הרקמה שבודדו.
בהמשך, לאחר דגירה של 48 שעות, התאים מקובעים לצורך צביעה כפולה של אימונופלואורסצנציה. התוצאות מראות את ההבדלים בדפוסי ההסתעפות ובישימות הניוריטים של נוירונים ובדחיפות הגליאלית של נוירונים שגודלו בתמציות רקמות שונות. שיטה זו יכולה לסייע בקידום מחקרים בתחום הנוירו-גסטרואנטרולוגיה, כגון בחינת תפקידם של מתווכים מולקולריים בשינויים בנוירופלסטיות במחלות שונות של מערכת העיכול.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התכונות הנוירוטרופיות השונות של מחלות הלבלב, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון סרטנים או מצבים דלקתיים של כל מערכת העיכול. הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו בשיתופי פעולה עם חוקרים בתחום המחלות הנוירופתיות במערכת הפדיאטרית, כגון מחלת Ong, והחלינו אותה למטרותינו. להומוגניזציה של רקמת לבלב אנושית: העבירו קוביות של רקמת לבלב בגודל 5x5x5 מילימטר ישירות מ-80°C- לחנקן נוזלי.
לאחר מכן, העבירו תחילה את הבלוקים הקפואים למבחנות הומוגניזציה שיכולות להכיל כדור דיסוציאציה ממתכת, ואז הכניסו אותם להומוגניזר רקמות ובצעו הומוגניזציה מבלי לאפשר לרקמה להפשיר מיד לאחר הדיסוציאציה. השעיקו מחדש את ההומוגנאט, שנראה כאבקה מוצקה, ב-300 עד 500 µL של 0.1 XPBS קר מאוד. אין להשתמש בבפר לזיס (lysis buffer), שכן הדבר עלול.
בצעו ליזיס לנוירונים ולאחר מכן סובבו את התוצר ההומוגני ב-21,130 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. אספו את העלייה הצלולה, המכילה את תמצית הרקמה, כדי לאסוף עלייה של שורת תאים משורות תאים של לבלב אנושי. גדלו את התאים עד להגעה להסנפיגנציה (confluence) של 70% עד 80% לפחות במדיום גידול רגיל.
כאשר התאים מוכנים, שטפו אותם לפחות שלוש פעמים ב-PBS בדרגת תרבית תאים, וגדלו אותם במצע ללא סרום למשך עד 48 שעות. לאחר מכן, מדדו את ריכוז החלבון של הומוגנאט הרקמה או של עלי-הנוזל (supernatants) של שורת התאים באמצעות בדיקת חלבון ברדפורד. לאחר מכן, חלקו את תמריתי הרקמה ואת עלי-הנוזל של שורת התאים למנות, כך שריכוז התמרית או עלי-הנוזל הסופי במצע הנוירונלי יהיה 100 µg/mL.
ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. באמצעות חולדה רכה (newborn rat) בגיל P2 עד P12 שעברה דקפיטציה, חתכו את העור וחשפו את עמוד השדרה. לאחר מכן, בצעו למינקטומיה קדמית (anterior laminectomy) כדי לחשוף את חוט השדרה.
בשלב הבא, חשפו והוציאו את גנגליון השורש האחורי (dorsal root ganglia) או ה-DRGs. הניחו את ה-DRG בתוספת MEM קר בקרח המכיל Gentamycin ו-metronidazole. המשיכו באיסוף ה-DRGs, החל מה-DRGs התחתונים ועד ל-DRGs הצוואריים העליונים.
בסיום, אוספים 52 DRGs, כמות המספיקה לפלטה של 24 בארות. לאחר מכן, משתמשים במספרי מיקרו כדי להפריד את ה-DRGs מהשורשים והעצבים שלהם. לאחר מכן, גוזרים את כל ההשלכות הפריפריאליות והמרכזיות שנותרו.
לאחר איסוף ה-DRGs, דגרו אותם ב-HBSS בתוספת collagenase type two בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, בצעו טריטורציה ל-DRGs באמצעות מזרקים בעלי קוטר קטן יותר ויותר.
שימו לב כי ריכוז גבוה מדי של tri עלול להרוס נוירונים, אך הוא פחות הרסני לגליות. לאחר שהתווך המכיל את ה-DRGs הפך לעכור, סבב את התמיה בצנטריפוגה ב-93.9 times G למשך חמש דקות. לאחר מכן, השליכו את התווך ובצעו resus.
סספנדו את התאים במדיום neuro basal כדי להכין אותם לתרבית. השתמשו ב-hemo cytometer כדי להעריך את המספר הכולל של נוירונים וגליא. לאחר מכן, זרעו את התאים על לבישות (cover slips) מצופות מראש בקוטר 13 מילימטר.
בפלטה של 24 בארות, סוג הציפוי שבו משתמשים תלוי במטרות הניסוי. לאחר מכן, מלאו את הבארות במצע נוירובזאלי (neuro basal medium) והמתינו להיצמדות התאים לבארות במהלך הלילה. למחרת, הפשיקו את המצע המועשר בתמצית רקמה או את המצע המועשר על-על (supernatant) של קו התאים.
בשלב הבא, שאבו את מצע הזריעה מה-DRGs ובצעו שטיפה אופציונלית ועדינה מאוד עם PBS. לאחר מכן, טפטפו באיטיות באמצעות פיפט את המצע המועשר בתמצית רקמה או המצע המועשר בעל-נוזל (supernatant) של שורת התאים על התאים, כדי להגיע לריכוז של 100 micrograms per milliliter. כעת, הניחו לתאים לגדול במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במצע המועשר בתמצית הרקמה או בעל-נוזל של שורת התאים.
שאבו את המצע וקבעו את הדגימה ב-4%paraform aldehyde לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית. לצביעה אימונופלואורסצנטית כפולה, השתמשו בסמנים ספציפיים לנוירונים וסמנים ספציפיים לגליות לצורך ניתוח גיאומטרי מורפולוגי. השתמשו במיקרוסקופ אור הפוך המצויד במצלמת CCD ובשילוב עם תוכנה אוטומטית למדידת צפיפות נויריטים בהגדלה של 200x.
מדדו את צפיפות הנוריטים בתרביות עצביות על ידי הנחת רשת של 50 על 50 מיקרון וספירת צפיפות הסיבים לריבוע שנמדד בסיבים המצטלבים. חזרו על ניתוח זה עבור ארבעה אזורים שונים של הצמיחה הצפופה ביותר בארבעה עד חמישה מיקרוגרפים מייצגים בכל לביבת זכוכית (cover slip). מדדו את ממוצע מספר הענפים לנוירון בצמיחת הנוריטים, את אורך הענף הממוצע ואת הגודל הפריאנלי (perianal) מ-30 נוירונים בודדים שנבחרו אקראית מכל לביבת זכוכית, על ידי סימון הנוריטים והפריקה (perica); כאן מוצגים נוירוני DRG שגודלו עם תמצית רקמה מלבלב תקין.
בניגוד לכך, נוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRG) שגודלו עם תמריות רקמה של פנקריאטיטיס כרונית או סרטן הלבלב, מראים צפיפות נוריטים גבוהה יותר. כאן מוצגים נוירונים של הפלקסוס המינטרי שגודלו עם תמריות שונות של רקמת לבלב אנושית.
נוירונים של הפלקסוס המינטרי (Myenteric plexus) שגודלו בתמציות של דלקת לבלב כרונית או סרטן הלבלב בונים נוירונים ארוכים יותר ומראים דפוס הסתעפות מורכב יותר מאלו שגודלו בתמציות של לבלב תקין. כאשר נוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRG) תורגבו עם עליית הנוזל (supernatant) מתאי סרטן הלבלב, נצפתה גם עלייה בצפיפות העצבית, בדומה למה שנצפה בתמציות רקמה. עם זאת, עלייה זו הייתה הפיכה כאשר גורמים נוירוטרופיים נבחרים, כגון our tein או גורם גדילה עצבי (nerve growth factor), הוזלו או נחסמו.
תאי Ggl מגיבים באופן שונה לתמריות שונות של רקמת הלבלב; תמריות של לבלב עם פנקריאטיטיס כרונית או סרטן הלבלב הגבירו את הצמיחה הגליאלית ואת מספר התאים הגליאליים בתרביות גליאליות שהופקו מ-DRG. עם זאת, ההשפעה הייתה בולטת יותר בתמריות של סרטן הלבלב מאשר בתמריות של פנקריאטיטיס כרונית. לאחר שליטתו, ניתן לבצע את הטכניקה הזו תוך ארבעה עד חמישה שעות, אם היא מבוצעת כהלכה לאחר פיתוחה.
שיטה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירו-גסטרואנטרולוגיה לבחון מנגנונים של נוירופלסטיות במחלות שונות של מערכת העיכול, כולל הפרעות דלקתיות וממאירות של מערכת העיכול. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבודד נוירונים פריפריים כדי לחקור נוירופלסטיות בלבלב, וכיצד להטמיע מערכת זו ובדיקות אחרות לנוירופלסטיות ולשינויים עצביים אחרים בהפרעות של מערכת העיכול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר נוירופלסטיות במערכת העיכול (GI), תוך התמקדות בהשפעות של מיקרו-סביבות לבלביות שונות על נוירונים פריפריאליים. באמצעות שימוש בנוירונים של גנגליון השורש הדורסלי (DRG) ושל הפלקסוס המיאנטרי (MP) מחולדות רכוש, מאפשרת השיטה סימולציה ומודולציה של שינויים נוירופלסטיים הרלוונטיים למחלות כגון סרטן הלבלב ופנקראטיטיס כרונית. גישה זו מאפשרת הערכה מורפולוגית ואלקטרופיזיולוגית מפורטת של תגובות נוירונליות וגליאליות לתמקיות רקמה.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-גסטרואנטרולוגיה
- נוירוביולוגיה
- פתופיזיולוגיה של מחלות מערכת העיכול
רקע
- נוירופלסטיות היא מאפיין מרכזי של מערכת העצבים האנטרית, במיוחד בתנאים פתולוגיים.
- תפקידה של הנוירופלסטיות בהפרעות של מערכת העיכול, כגון סרטן הלבלב ופנקריאטיטיס כרונית, אינו מובן במלואו.
- דרושים מודלים ניסיוניים כדי לדמות ולחקור נוירופלסטיות במחלות של מערכת העיכול.
- הבנת הנוירופלסטיות עשויה לחשוף מנגנונים העומדים בבסיס התקדמות המחלה והתסמינים.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקת in vitro לסימולציה של נוירופלסטיות בלבלב באמצעות נוירונים של DRG ו-MP.
- הערכה של האופן שבו סביבות רקמות לבלב שונות משפיעות על המורפולוגיה והתפקוד של נוירונים וגליות.
- אספקת פלטפורמה למחקר השפעתם של מתווכים מולקולריים על נוירופלסטיות במחלות של מערכת ה-GI.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ליזאטים של רקמה שלמה מרקמת לבלב אנושית תקינה וחולה.
- בידוד נוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRG) מחולדות רך born newborns.
- אינקובציה של נוירוני DRG עם תמצי רקמת לבלב או עם על-נוזל (supernatant) של שורת תאים.
- צביעת אימונופלואורסצנציה כפולה להערכת מורפולוגיה נוירונלית וגליאלית.
- ניתוח כמותי של צפיפות נוריטים, דפוסי התבננות וספירת תאי גליה באמצעות מיקרוסקופיה ותוכנה אוטומטית.
תוצאות עיקריות
- נוירונים של DRG שנחשפו לתמריות של פנקראטיטיס כרונית או לסרטן הלבלב הראו דחיסות נוריטים מוגברת ופיצול מורכב יותר בהשוואה לאלו שנחשפו לתמריות של לבלב תקין.
- נוירונים של הפלקסוס המינטרי (Myenteric plexus) הראו אף הם נוריטים ארוכים יותר ופיצול מורכב יותר בתמריות של רקמות חולות.
- על-נוזלים (Supernatants) משורות תאים של סרטן הלבלב השראו שינויים נוירופלסטיים דומים, אשר היו הפיכים על ידי דילול של גורמים נוירוטרופיים.
- צמיחת תאי גליאה ודחיסותם הוגברו על ידי תמריות מרקמות לבלב חולות, ובמיוחד מסרטן הלבלב.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר סימולציה וניתוח של נוירופלסטיות במחלות של מערכת העיכול תחת תנאים מבוקרים in vitro.
- הוא מספק כלי בעל ערך להבנת המנגנונים המולקולריים והתאיים של נוירופלסטיות בתגובה לסביבות מיקרו שונות.
- השיטה ניתנת להתאמה למחקר של נוירופלסטיות באיברים אחרים של מערכת העיכול ובהקשרים מחלתיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סימולציה של נוירופלסטיות בלבלב באמצעות בדיקות in vitro של נוירונים כפולים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תגובות נוירונליות למיקרו-סביבות הרלוונטיות למחלה. פלטפורמה זו תומכת בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות להפרעות במערכת העיכול, כולל סרטן הלבלב ודלקת לבלב כרונית. הפלטים הכמותיים של הבדיקה מנחים החלטות של גילוי מוקדם ומחקר תרגומי ב portfolios של נוירו-גסטרואנטרולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני נוירו-פלסטיות בתגובה לסביבות מיקרו פתולוגיות בלבלב.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות שינויים מורפולוגיים נוירונליים וגליאליים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים עבור תוכניות לגילוי תרופות בתחום הנוירו-גסטרו-אנטרולוגיה.
- מספק פלטפורמה להערכת ההשפעה של מתווכים מולקולריים על פלסטיות נוירונלית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות in vitro מתוכשבות וניתנות לשחזור להערכת נוירופלאסטיות תחת תנאים מבוקרים.
- מייצר מדדים כמותיים של צפיפות נוריטים, התבסעות וספירת תאי גליה לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר סריקה של מודולטורים מועמדים המשפיעים על נוירופלאסטיות בהקשרים רלוונטיים למחלה.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר במודלים של מחלות במערכת העיכול (GI).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאי נוירופלסטיות in vitro לבין פנוטיפים רלוונטיים למחלה הנצפים בהפרעות במערכת העיכול.
- מספק רצף מהגילוי המכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של יעדי נוירופלסטיות.
- מנחה קידום מותאם-סיכון של נכסים בתחום הנוירו-גסטרואנטרולוגיה.
- תומך בזיהוי של ביומרקרים תרגומיים הקשורים לעיצוב מחדש של נוירונים וגליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקה זו של שני נוירונים נטמעת ברצף שבין הגילוי למחקר הפרה-קליני בתחום הנוירוגסטרואנטרולוגיה, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת תגובות עצביות וגליאליות לתכ extracts ללבלב ספציפיים למחלה, ובכך תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים.
- סריקה (Screening): מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות ופיתוח בדיקות.
- אנליזה: מאפשר השוואה סטטיסטית של צפיפות נוריטים, הסתעפותם ופרוליפרציה של גליאה בין תנאים ניסויים שונים.
- מחקר טרנסלציוני: מקשר בין שינויים בנוירופלסטיות in vitro לבין פנוטיפים של מחלות בהפרעות של מערכת העיכול (GI).
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה ללימוד נוירופלסטיות באיברים שונים של מערכת העיכול ובמצבי מחלה מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף של יעדי נוירופלסטיות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות נוירופלסטיות לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את היעילות ההונית בצינורות פיתוח של נוירוגסטרואנטרולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של נכסים המשנים את מהלך המחלה במערכת העיכול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד נוירונים, תרביות תאים ואנליזה של אימונופלואורסצנציה.
- נדרשת גישה לתשתיות להומוגניזציה של רקמות, מיקרוסקופיה ואנליזה אוטומטית של תמונות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בדיקה ותוצאות כמותיות.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מחלות במערכת העיכול (GI) באמצעות מקור רקמה ותיקוף מתאימים.
- תלוי בניתוח סטטיסטי קפדני לצורך פרשנות חסונה של תוצרי נוירופלסטיות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:47
Collecting Tissue Extracts and Cell Line Supernatants
3:48
Isolation of the Dorsal Root Ganglia (DRG) Neurons
5:35
Culturing Neurons and Glia with Pancreatic Tissue Extracts and Cell-line Supernatants
8:01
Results: Neuronal and Glial Plasticity Due to Pancreatic Microenvironmental Cues
9:37
Conclusion
