Name: גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-27T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: גלה פתוגנים תאיים חדשים באמצעות שיטת Amoebal Coculture ו-Amoebal Enrichment. שיטה זו מאפשרת בידוד חיידקים תוך-תאיים וניתוחם ברמה המולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ליחסי ציבור. ברנרד לה סקולה לעצות טכניות מועילות ודיון מעניין על coculture amoebal והעשרת amoebal. אנו מודים גם לד&quot;ר וינסנט תומאס על עזרתו ביישום הטכניקה במעבדה שלנו.

1. Amoebal Coculture 1.1 הכנה דגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם סביבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מים סנן את דגימת המים (500 מיליליטר לליטר 1) דרך קרום גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, לנער את הקרום בPAS הבינוני מלוח אמבה עמוד (120 מ&quot;ג של NaCl, 4 מ&quot;ג של 4 MgSO • 7H 2 O, 4 מ&quot;ג של CaCl 2 • 2H 2 O, 142 מ&quot;ג של Na 2 HPO 4, ו136 מ&quot;ג KH 2 PO 4 ב1 ליטר של מים מזוקקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מוצקות Resuspend דגימות מוצקות כמו דגימות קרקע או חול ודגימות מוצקות למחצה כגון בוצה משופעלת במים מזוקקים או PBS ולסנן אותם דרך קרום גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, לנער את הקרום בPAS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מזוהמות מאוד עם אמבות ופרוטוזואה אנדוגני משקעים ראשון דגימות על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (180 XG) עבורr 10 דקות או לסנן אותו דרך קרום גודל נקבובית 5 מיקרומטר. יתר על כן לעבד את supernatant (בהתאמה התסנין), כמו ב1.1.1. הערה: טכניקות טיהור אחרות עשויות לשמש כדי לטהר נוסף דגימות סביבתיות: מחממים את המדגם ב50 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות או לטפל עם פתרונות חומצי או בסיסיים 14. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם קליני לעבד דגימות קליניות בהתאם למאפיינים פיסיקלי כימי שלהם. נוזלי סינון או צנטריפוגה כדי להסיר זיהומים גדולים. Resuspend דגימות מוצקות. כדי להשתמש ברקמות, טוחן אותם, למשל באמצעות homogeneiser dounce או חרוזי זכוכית, וlyse התאים לשחרר את החיידקים תוך תאיים. </li></ol> 1.2 הכנת אמבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מרק הכן את אמצעי התקשורת הבאה: מדיה עשירה המכילה peptone, תמצית שמרים וגלוקוז (PYG; של peptone proteose 100 גרם, 10 גרם של תמצית שמרים, 4.9 גרם של 4 MgSO • 7H 2O, 5 גרם של נתרן ציטרט • 2H 2 O, 0.1 גרם של Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6 שעות 2 O, 1.7 גרם של KH 2 PO 4, 1.97 גרם של Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 גרם של גלוקוז, ו0.295 גרם של CaCl 2 ב 5 ליטר של מים מזוקקים) ובינוני שאינו תזונתי כגון PAS למיני Acanthamoeba. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Amoebal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפחו את האמבות (מעדיף Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 או polyphaga א לינק-AP1) ב ° C25 בצלוחיות תרבית תאים המכילות 30 מיליליטר של מדיום PYG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את האמבות ידי טלטול נמרץ של הבקבוק וצנטריפוגה ההשעיה התא 10 דקות ב 1,500 x גרם. שטוף את הכדור פעמיים עם מדיום PAS. ספירת התאים בשקופית טמבלית ולהתאים את עוצמת הקול כדי לקבל השעיה של 5 x 10 5 תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את ההשעיה amoebal לmicroplates. השתמש 1 מיליליטר לכל טוב ל12 - ו24 wצלחות ell, 500 μl לצלחות 48 היטב ו300 μl לצלחות 96 היטב. דגירה microplate לפחות שעה 2 ב 25 ° C. זה מאפשר שיקוע וחיבור של האמבות לתחתית היטב כל אחד. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסון לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את הצלחת מ2.3.3 עם דילולים סידוריים של המדגם מ1.1 או 1.2, בדרך כלל סדרת דילול פי 10 עם, החל מדגם חי 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה microplate ב1,800 XG עבור 10 דקות למשקעים על דשא amoebal מיקרואורגניזמים שעלולים להיות נוכח במדגם. זה מגביר את הקשר וphagocytosis של מיקרואורגניזמים על ידי אמבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות דקות 45 ב ° C25 ולשטוף שלוש פעמים עם PAS ידי החלפת מדיה עם PAS הטרי. הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של PAS עם או בלי תוספת של אנטיביוטיקה (סטרפטומיצין, פניצילין, גנטמיצין ו / או vancomycin), בהתאם לbacteriמיני אל שהם חיפשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microplate ב32 ° C באווירת humidified להימנע מיצירת ביצי קיימא של האמבות. שים לב היטב כל יום עם אובייקטיבי 20X כדי לזהות נוכחות של החיידקים הפולשים וlysing אמבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של התפרקות לבצע תת על אמבות טריות ידי inoculating של cocultures 100 μl לmonolayer של כ -10 5 אמבות / 2 סנטימטר. כדי לבודד במיוחד בהתחשב מיני חיידקים, לחסן גם תקשורת אגר ספציפית המיועדת לחיידקים אלה (אגר כלומר BCYE לspp הלגיונלה.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהעדר תמוגה, לקחת מcocultures 100 μl ארבעה עד שבעה ימים לאחר החיסון הראשון ולחסן תרבות amoebal טרי של 900 μl בצלחת 24 גם. אם תמוגה המהירה של אמבות הוא ציין בלי התפשטות של חיידקים, נגיף עשוי להיות נוכח. במקרה זה, לסנן את supernatant ב0.22 מיקרומטר ולהשתמש בהשעיה המסוננת להדביק אמבות טריות. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 בידוד ואפיון בקטריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת חיידקים בצע cocultures ישירות על coverslips זכוכית ב24 גם microplates. הסר את המדיום ולבצע צביעה או immunofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Romanowsky השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו יבש coverslip. לטבול את coverslip חמש פעמים בפתרון מקבע (2 מ&quot;ג / ליטר הירוק מהיר במתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול חמש הפעמים coverslip בפתרון מכתים אני (1.22 g / L Eosine G בpH חיץ פוספט 6.6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לטבול את coverslip 5 פעמים בפתרון מכתים השני (thiazine 1.1 g / L בpH חיץ פוספט 6.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המדגם עם מים מזוקקים. בואו יבש ולצפות על ידי מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Ziehl-Neelsen <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו יבש coverslip. כסה את המדגם עם fuchsin Ziehl. מחממים את הצבע עם להבה עד אדים מופיעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות לפחותולשטוף עם מים מזוקקים. כסה את המדגם עם 3% פתרון חומצה הידרוכלורית בisopropanol למשך 2 דקות ולשטוף עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה ל30 שניות עם מתילן כחול ולשטוף עם מים מזוקקים. בואו יבש ולצפות על ידי מיקרוסקופ 22. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים Gimenez <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות fuchsin בסיסי על ידי ערבוב של 10% fuchsin הבסיסי 100 מיליליטר (10 גרם של fuchsin הבסיסי ב100 אתנול מיליליטר 95%), 250 מיליליטר של 4% פנול מימיים ו650 מיליליטר של מים מזוקקים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו coverslip לייבש ולתקן על ידי העברתו דרך להבה. כסה את המדגם עם fuchsin טרי המסונן בסיסי (4 מיליליטר של פתרון מניות fuchsin בסיסי ב10 מיליליטר של M 0.1 חיץ פוספט נתרן, pH 7.45) למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המדגם עם מים ודגירה בירוק מלכיט (0.8% במים מזוקקים) ל10 שניות. יש לשטוף שוב עם מים וחזור מכתים ירוק מלכיט. יש לשטוף שוב עם מים. בואו coverslip יבש, מ &#39;ount אותו, ולבחון על ידי מיקרוסקופ 23. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את coverslip על ידי דוגרים במתנול למשך 5 דקות או עם paraformaldehyde 4% עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם PBS ו דגירה עבור שעה 2 בפתרון חסימה (BSA 5%, 0.1% Saponin PBS) בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslip עבור שעה 1 בחסימת תמיסה המכילה נוגדנים שהועלו נגד מיקרואורגניזם של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף שוב שלוש פעמים PBS ודגירה עבור שעה 1 עם שני נוגדנים מכוונים נגד הנוגדן הראשוני והצמודים לfluorophore. לשטוף שלוש פעמים עם PBS, הר coverslip ולבחון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוי ה-DNA על ידי PCR תמצית ה-DNA 100-200 μl של coculture amoebal. זיהוי מיקרואורגניזמים עם פריימרים אוניברסליים מיקוד גן 16S rRNA או פריימרים ספציפיים למין של עניין, כגון mycobacteria 24<html> , Legionella 25 או חברי 26 Chlamydiales. </li></ol> 2. העשרת Amoebal 2.1. הכנת מדגם Resuspend דגימות מוצקות או חצי מוצקה בPAS ידי vortexing. צנטריפוגה ההשעיה במהירות נמוכה (180 XG) במשך 10 דקות. זה מאפשר העשרה של אמבות חיים ללא בגלולה. Supernatant יכול לשמש לcoculture amoebal והגלול להעשרת amoebal 21. 2.2. הכנה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 גרם של אגר לשל PAS 100 מיליליטר וחיטוי דקות 15 בינוניות ב121 ° C. יוצקים את המדיום החם בצלחות פטרי ולתת לחזק בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Escherichia coli (ATCC 25922) בLB או thioglycolate מרק לילה בשעה 37 ° C. שטפו את החיידקים פעמיים עם PBS ו resuspend אותם במדיום PAS. לדלל 10x בPAS והתפשט 2-3 מיליליטר של דילול זה על צלחת אגר PAS ולתת להתייבש. </li></ol>ass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.3. חיסון לדוגמא הוסף ירידה של מדגם (או חתיכת המסנן) בצד אחד של הצלחת ולתת לו לזרום על צלחת פטרי כדי ליצור קו במרכז הצלחת. 2.4. צמיחת Amoebal ותת amoebal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לצלחת פטרי מדי יום. אם מול הגירת amoebal מזוהה, לגזור חתיכה קטנה של אגר בחזית ההגירה ולחסן צלחת פטרי NNA טרי מכוסות בדשא של א &#39; coli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על reinoculation מספר פעמים בהתאם לטוהר של המדגם, כדי שתהיה לי תרבות טהורה של זן amoebal נתון. </li></ol> 2.5. אפיון אמבות וחיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד את תאי resuspend אותם PAS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-DNA ולקבוע את זהותו של אמבות ו / או endosymbionts חיידקים על ידי PCR וסדר (ההגברה 16S rRNA לחיידקים, שו&quot;ת. 18S rRNA לאמבות ורצף, לדוגמא). </li> &lt;li&gt; השתמש בתאים מגורדים אלה בPAS לחסן אמבות טריות ולבצע coculture amoebal כדי לזהות חיידקים ואולי בהווה במדגם. </li></ol>

<ol><li>Fraser, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+description+of+an+epidemic+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia.</a> New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).</li>
<li>McDade, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+isolation+of+a+bacterium+and+demonstration+of+its+role+in+other+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease.</a> New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).</li>
<li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+the+pathogenicity+of+Legionella+pneumophila+for+freshwater+and+soil+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae.</a> J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).</li>
<li>Rodriguez-Zaragoza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology of free-living amoebae.</a> Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).</li>
<li>Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+Acanthamoeba+species+genotypes+associated+with+nonkeratitis+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections.</a> J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).</li>
<li>Brussow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+between+protists+and+phages%3A+from+antipredation+strategies+to+the+evolution+of+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity.</a> Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).</li>
<li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+resistant+to+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microorganisms resistant to free-living amoebae.</a> Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).</li>
<li>Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-living+amoebae+and+their+intracellular+pathogenic+microorganisms%3A+risks+for+water+quality%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality.</a> FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).</li>
<li>Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia-like+obligate+parasite+of+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae.</a> Lancet. 349, 925-926 (1997).</li>
<li>Amann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+intracellular+bacterial+parasites+of+acanthamoebae+related+to+Chlamydia+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).</li>
<li>Birtles, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidatus+Odyssella+thessalonicensis%27+gen.+nov.%2C+sp.+nov.%2C+an+obligate+intracellular+parasite+of+Acanthamoeba+species%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).</li>
<li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criblamydia+sequanensis%2C+a+new+intracellular+Chlamydiales+isolated+from+Seine+river+water+using+amoebal+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture.</a> Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).</li>
<li>Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+amoeba-resisting+bacteria+from+water+in+human+environment+by+using+an+Acanthamoeba+polyphaga+co-culture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure.</a> Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).</li>
<li>Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).</li>
<li>Corsaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Chlamydiales+strains+isolated+from+a+water+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).</li>
<li>Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waddlia+chondrophila+enters+and+multiplies+within+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages.</a> Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).</li>
<li>Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissivity+of+Vero+cells%2C+human+pneumocytes+and+human+endometrial+cells+to+Waddlia+chondrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila.</a> Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).</li>
<li>Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissivity+of+fish+cell+lines+to+three+Chlamydia-related+bacteria%3A+Waddlia+chondrophila%2C+Estrella+lausannensis+and+Parachlamydia+acanthamoebae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).</li>
<li>Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+amplification+and+sequencing+of+the+16S+ribosomal+DNA+of+an+intracellular+Legionella+species+recovered+by+amoebal+enrichment+from+the+sputum+of+a+patient+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).</li>
<li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Legionella+pneumophila+serogroup+1+from+human+feces+with+use+of+amebic+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures.</a> Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).</li>
<li>Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae-resisting+bacteria+isolated+from+human+nasal+swabs+by+amoebal+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture.</a> Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).</li>
<li>Isenberg, H. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsenberg%2C+HD+%22Clinical+microbiology+procedures+handbook%22">Clinical microbiology procedures handbook</a>. , (1992).</li>
<li>Gimenez, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Rickettsiae+in+Yolk-Sac+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures.</a> Stain Technol. 39, 135-140 (1964).</li>
<li>Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-resisting+bacteria+in+a+hospital+water+network%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).</li>
<li>Miyamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+seminested+PCR+method+for+detection+of+Legionella+species+and+its+application+to+surveillance+of+legionellae+in+hospital+cooling+tower+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).</li>
<li>Lienard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+chlamydiales-specific+real-time+PCR+and+its+application+to+respiratory+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).</li>
<li>Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+mycobacteria+from+soils+at+an+illegal+dumping+site+and+landfills+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan.</a> Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).</li>
<li>Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-associated+bacteria+in+water+treatment+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hygiene+Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants.</a> Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+drancourtii+sp.+nov.%2C+a+strictly+intracellular+amoebal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).</li>
<li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Afipia+and+Bosea+strains+isolated+from+various+water+sources+by+amoebal+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture.</a> Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoeba-resisting+bacteria+and+ventilator-associated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia.</a> Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).</li>
<li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li>
<li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrella+lausannensis%2C+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+virus+in+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033(2003).</li>
<li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li>
<li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lausannevirus%2C+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li>
<li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Internal+Med%22%5BJournal%5D)">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li>
<li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parachlamydia+acanthamoebae%2C+an+emerging+agent+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li>
<li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li>
<li>Lienard, J. G. Ch. 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLienard%2C+JG+%22Environmental+microbiology%2C+current+technology+and+water+applications%22">Environmental microbiology, current technology and water applications</a>. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li>
<li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks%2C+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

coculture Amoebal והעשרת amoebal שיטות יעילים שאפשרו את בידודם של מינים רבים של חיידקים וamoebal חדשים. תוצאות שהושגו עם שיטות אלה לאשר את הקיום בכל מקום של שני אמבות וחיידקים עמידים לאמבה בסביבה, ודבר המעניין ביותר ברשתות מים מעשה ידי אדם שנחשבים להיות נשלטו על ידי טיפולים כימיים כגון הכלרה וozonation. coculture Amoebal והעשרת amoebal הן כלים חיוניים לבודד ולטפח מיקרואורגניזמים פוטנציאליים פתוגניים אלה ולהשיג זנים בתרבות טהורה על מנת אז ללמוד הביולוגיה ופתוגניות שלהם עוד יותר. לא...

לפני הופעתו של אבחון מולקולרי, מיקרואורגניזמים הנמצאים בנישות סביבתיות או בדגימות קליניות לעתים קרובות זוהו על ידי טיפוחם בתקשורת סלקטיבית שונה, בעיקר על אגר בצלחות פטרי. הפנוטיפ של מושבות חיידקים והפעילות המטבולית שלהם ולאחר מכן אפשר סיווג חיידקים ברמת מין. גם מרק יכול לשמש כדי להגדיל את הרגישות של זיהוי. עם זאת, שתי הטכניקות לא מאפשרות ההתאוששות של חיידקים שגדלים לאט או בכלל לא בתקשורת אלה. זו הסיבה מדוע גישות מולקולריות משמשות כל כך נרחבת בימינו. עם זאת, זיהוי של ה-DNA מספק אין מושג על יכולת הקיום של החיידקים. יתר על כן, לעומת זאת לתרבות, גישות מולקולריות לא לגרום למתח שיכול להיות מאופיין נוסף. לומדים פתוגנים שגדלים בצורה גרועה על תקשורת מוצקה או שתאי הצורך לגדול הוא מסובך. רוב אלה &quot;קשים לגדול&quot; חיידקים הם סופית אניניםחיידקי acellular, לעתים קרובות גילו ואפיין הבא התפרצויות גדולות כפי שהיה במקרה של pneumophila הלגיונלה. חיידק זה התאפיין בעקבות התפרצות שהתרחשה במהלך כינוס של לגיון האמריקאי. רבים ככל 182 אנשים נדבקו ו29 מתו עקב 1,2 דלקת ריאות חמור. מאוחר יותר הראה כי אמבות היו המארחים הטבעיים של חיידק זה, וכי נוכחותם ברשתות מערכת מיזוג אוויר במלון ומים הייתה במקורו של פרוץ מחלת הלגיונרים שנקרא 3. האמבות נמצאות ברחבי העולם והיו מבודדות מהקרקע, אוויר, מים ורירית האף של מתנדבים אנושיים (הנסקרת ב 4). אמבות &quot;חיים ללא&quot; אלה הן בדרך כלל החלוקה באופן עצמאי בסביבה, אך ייתכן שמדי פעם לפלוש מארחים מתירנית 5. הזנת אמבות במיקרואורגניזמים שונים באמצעות phagocytosis ועיכול lysosomal לאחר מכן על ידי הי&quot;דdrolases 6. חיידקים תאיים פקולטטיביים או לחייב רבים מסוגלים להתנגד לעיכול ובכך להדביק ולחלק באמבות כמו למשל חיידקים או mycobacteria קשורות כלמידיה הלגיונלה, (הנסקרת ב 7 ו -8). אמבות חיים נטולי סיכוי לייצג את המאגר פוטנציאלי חשוב עבור חיידקים תאיים שעדיין לא התגלו. זה הוביל את הקבוצה שלנו ליישם בלוזאן שתי טכניקות עיקריות, הנקראות coculture amoebal והעשרת amoebal, שאפשרו לקבוצות שונות כדי לבודד כמה מיקרואורגניזמים תאיים לחייב חדשים מדגימות סביבתיות שונות 9-15. מאז אמבות הן phagocytes המקצועי מרעה על חיידקים, חיידק מסוגל להתנגד phagocytosis ולגדול בתוך הפרוטיסטים אלה עשויים גם ליישב phagocytes אדם ולהיות פתוגניים כלפי בני אדם. זה הודגם באופן חלקי עבור חלק מחיידקים הקשורים לכלמידיה, כגון Waddlia צndrophila. וו chondrophila יכול לגדול לא רק באמבות, אלא גם בכמה סוגי תאים, כגון תאי יונקים אפיתל, מקרופאגים, ושורות תאי דגי 16-18. Coculture amoebal מופיע גם רלוונטי לאיתור חיידקים תאיים בדגימות קליניות 19,20, כוללים צואה שהם מזוהמים בכבדות עם מיני חיידקים שונים 21. כאן אנו מתארים את השלבים העיקריים של coculture amoebal והעשרת amoebal, כוללים (א) טיפול בדגימות קליניות או סביבתיות, (ב) הגידול של אמבות בתקשורת axenic ועל דשא חיידקים של Escherichia coli ו (ג) הבחירה ואפיון של חיידקים תוך תאיים.

<table><tbody><tr><td>גלוקוז מונוהידראט</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m ממברנה בגודל נקבוביות</td><td>Merck Millipore, דרמשטדט, גרמניה</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>פפטון פרוטאוז</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים</td><td>בקטון-דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות קובה</td><td>Hycor, אינדיאנפוליס, אינדיאנה</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-לוחות תרבית תאים</td><td>קורנינג בע"מ, קורנינג, ניו יורק</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעה Diff-Quik</td><td>אבחון Siemens Healthcare., מינכן, גרמניה</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsin</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>פוקסין בסיסי</td><td>סיגמה, סנט לואיס, מישיגן</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma, סנט לואיס, MI</td><td>P1037</td><td>מלכיט ירוק אוקסלט מאכל ומוטגני</td></tr><tr><td></td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% תמיסה</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי amoebal coculture וגישות amoebal העשרה

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

פתוגנים תאיים כגון legionella, mycobacteria ואורגניזמים כמו כלמידיה קשים לבודד מפני שהם לעתים קרובות לגדול בצורה גרועה או בכלל לא בתקשורת סלקטיבית המשמשים בדרך כלל כדי לטפח חיידקים. מסיבה זו, רבים של פתוגנים אלה התגלו רק לאחרונה או בעקבות התפרצויות חשובות. פתוגנים אלה קשורים לעתים קרובות עם אמבות, המשמשים כמארח תאים ומאפשרות את ההישרדות וצמיחה של החיידקים. בכוונתנו כאן כדי לספק הדגמה של שתי טכניקות המאפשרות בידוד ואפיון של פתוגנים תאיים הנמצאים בדגימות קליניות או סביבתיות: coculture amoebal והעשרת amoebal. coculture Amoebal מאפשר התאוששות של חיידקים תאיים על ידי inoculating המדגם נחקר על דשא amoebal שיכול להיות נגוע וlysed ידי החיידקים תאיים בהווה במדגם. העשרת Amoebal מאפשרת התאוששות של אמבות הווה במדגם קליני או סביבתי. ההוא יכול להוביל לגילוי של מיני amoebal חדשים, אלא גם של חיידקים תוך תאי חדשים צומחים במיוחד באמבות אלה. יחד, שתי טכניקות אלה לעזור לגלות חיידקים תאיים חדשים מסוגלים לגדול באמבות. בגלל היכולת שלהם להדביק אמבות ולהתנגד phagocytosis, חיידקים תאיים אלה עשויים גם לברוח phagocytosis ידי מקרופאגים וכך, להיות פתוגניים לאאוקריוטים גבוהים יותר.

<html> שימוש coculture amoebal והעשרת amoebal, מגוון רחב של חיידקים פתוגניים ו / או סביבתיים כולה התגלה (טבלת 1). coculture Amoebal היה בשימוש על ידי הקבוצה ואחרים שלנו לנתח דגימות סביבתיות, מתקני טיהור מים ומערכות הפצת מים. מגוון רחב של מיקרואורגניזמים יכול להיות מבודד עם טכניקה זו. החיידקים הנפוצים ביותר שבודדו על ידי coculture amoebal חברים בסוג Mycobacterium שיכול להיות התאוששו ממתקני...

coculture Amoebal היא מערכת תרבית תאים באמצעות אמבות חסיד לגדול באופן סלקטיבי פתוגנים תאיים מסוגלים להתנגד תאי phagocytic כגון אמבות ומקרופאגים. בכך הוא מהווה כלי מפתח כדי לגלות חומרים מזהמים חדשים. העשרת Amoebal מאפשרת גילוי של מיני amoebal החדשים ושל החיידקים תאיים הספציפיים שלהם.

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבודד פתוגנים תו-תאיים פוטנציאליים חדשים הנמצאים בדגימות סביבתיות או קליניות. מטרה זו מושגת על ידי הזרקת הדגימה הרלוונטית לתרבית של AME, במטרה לבחור חיידקים המסוגלים לחדור ולהתרבות באמבות. לאחר מכן, האמבות שעברו ליסיס, או אלו שבהן נצפתה צמיחה תו-תאית ברורה, מנותחות באופן מעמיק יותר כדי לזהות את המיקרואורגניזם ברמת המין.במידה ולא התקבלו גדילה בקטריאלית בשימוש בשיטת תרבית משותפת עם אמבה, מבוצע העשרה של אמבות כדי לזהות אמבות אנדוגניות שעשויות להכיל בקטריות תו-תאיות ספציפיות. התוצאות שהתקבלו הן בידוד של מיני בקטריות חדשים ווירוסים חדשים באמצעות שיטה חדשנית זו, אשר ניתן לאפיין אותם בהמשך באמצעות גישות הכוללות מיקרוסקופיה וריצוף גנומי. היתרונות המרכזיים של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון תרבית סינתטית או תרבית תאי יונקים, הם שניתן ליישמן כדי לבודד בקטריות תו-תאיות מחייבות, או שניתן ליישם טכניקה זו אפילו על דגימות מזוהמות בקלות המכילות קהילות מיקרוביאליות מורכבות.הרשו לי להציג את סבסטיאן, טכנאי BA מהמעבדה שלי, שידגים את הפרוצדורה. כדי לבדוק דגימת מים, סננו דגימה של 500 עד 1000 מיליליטר דרך ממברנה בעלת גודל נקבים של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, הניחו את הממברנה ב-pages, amoeba, saline או pass ונערבבו. עבור דגימות מוצקים כגון קרקע, חול או בוצה פעילה, ה

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אאוקריוטים חיידקים הם גם מקור של פחמן photosynthetically הנגזרות ואת הדף מינים טורפים ב לצמיתות מכוסי קרח אגמים אנטארקטיקה. דו"ח זה מתאר תרבות והעשרה הגישה לבודד מטבולית אאוקריוטים חיידקים צדדי מן האגם אנטארקטיקה, אגם בוני, ומעריך את הפוטנציאל אורגניים קיבוע פחמן באמצעות assay radioisotope עבור Ribulose-1 ,5-bisphophate פעילות oxygenase (RuBisCO) carboxylase.

הקמת מיקרוביאלית תרבויות העשרה האיקריוטים מ שכבתית כימית אנטארקטיקה אגם והערכת פוטנציאל קיבוע פחמן

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

טכניקה זו מספקת שיטה לקצור, לנרמל ולכמת צמיחה תאית של חיידקים פתוגנים כי הם מראש מעובדים בתאי פונדקאי protozoan טבעיים לפני הזיהומים של תאי יונקים. שיטה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של תאי מארח לבמה יחול כמו גם סוגי תאי היעד.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

אנו מתארים כאן את ההתקדמות האחרונה בבידוד ויראלי לאפיון גנוטיפים חדשים של Faustovirus, שושלת חדשה הקשורה לאספרווירוס של נגיפי ענק. ניתן ליישם פרוטוקול זה על בידוד תפוקה גבוהה של וירוסים, במיוחד נגיפי ענק המדביקים אמבה.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

להלן מוצגים שני פרוטוקולים ללמוד אינטראקציות פגוציט -Mycobacterium abscessus : הקרנת transposon מוטציה ספריה עבור לקוי תאיים חיידקי וגם הקביעה של חיידקי תאיים transcriptome מ- RNA . רצף. שתי הגישות לספק תובנות יתרונות גנומית ועיבודים transcriptomic שיפור כושר חיידקים תאיים.

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התקפה אלימה של חיידקים פלנקטוניים או צמוד-השטח באמצעות discoideum ד (אמבה) כמחשב מארח. התקפה אלימה נמדד על פני תקופה של 1 h, המארח הורג הוא לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח התמונה. נדגים את פרוטוקול זה באמצעות החיידק aeruginosa פ.

וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

שיטת הכנת דגימות חדשנית מודגמת לניתוח של מקרוקולוניות חיידקים מבוססות אגר באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספיחה / יינון בלייזר בסיוע מטריצה.

חקירת שיתוף פעולה מיקרוביאלי באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של מושבות חיידקים הגדלות על אגר וברקמות במהלך זיהום

גלה פתוגנים תאיים חדשים באמצעות שיטת Amoebal Coculture ו-Amoebal Enrichment. שיטה זו מאפשרת בידוד חיידקים תוך-תאיים וניתוחם ברמה המולקולרית.

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

גלה סרטונים נוספים