תגובת פרוטוקול חוטם הרחבה לחקירת פלסטיות התנהגות בחרקים: בקשה ליסוד, ביו רפואית, ומחקר חקלאי
8 בספטמבר 2014
פרוטוקול ההתניה של Proboscis Extension Response (PER), שפותח עבור דבורת הדבש (Apis mellifera), מספק אמצעי רלוונטי מבחינה אקולוגית וניתן לכימות בקלות לחקר מספר מנגנוני למידה שונים במיני חרקים רבים.
המטרה הכוללת של נוהל זה היא להדגים כיצד ליישם התנייה התנהגותית של תגובה רפלקסיבית פשוטה למזון בדבורי דבש. הדבר משיג תחילה על ידי לכידת דבורי דבש, קיבוען ברתמות, האכלתן בכמות קטנה של תמיסת סוכר, ולאחר מכן מתן אפשרות לדבורים להתרגל לקיבוע. לאחר מכן, נבחרות דבורים להתנייה המראות מוטיבציה מספקת כאשר נוגעים במחושיהן בסוכרוז.
במהלך ההתניה, הצגת הריח משולבת עם תגמול של סוכרוז כדי לעורר את התגובה המותנית. לאחר מכן, ניסיונות ללא חיזוק מודדים את נוכחותה או היעדרה של התגובה, את זמן התגובה (latency) ואת משך התגובה. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים והצגה גרפית של ניסיונות ההתניה והבדיקה.
טכניקה זו יושמה בהצלחה במחקרים על ביולוגיה ובריאות של דבורי דבש; התנהגות למידה רגישה במיוחד לטיפולים משבשים כגון חומרי הדברה, מה שמאפשר להעריך את ההשפעה של סוגי טיפולים אלו על התנהגות דבורי הדבש ברמות תת-קטלניות. הדגמה חזותית של שיטה זו מסייעת בהבנת תזמון הגירוי הנדרש להתנייה יעילה ואת הטעויות הנפוצות המפחיתות את היעילות. אדם שאינו מכיר את השיטה יתקשה בתשומת הלב לפרטים הנדרשת הן עבור הפרוטוקול והן עבור התנאים הסובבים.
כדי להתחיל, אספו דבורים פועלות מהכניסה למושבה בעת שהן עוצרות לפני היציאה או בעת חזרתן מהאיסוף. לכדו דבורה אחת בלבד לכל מבחנה. החזיקו את פתח המבחנה בצורה אופקית או הפונה כלפי מטה בזמן סגירת המכסה כדי למנוע בריחה.
לאחר איסוף הדבורים, חזרו למעבדה והניחו מספר מבחנות בכל פעם בתערובת של קרח ומים. ברגע שדבורה הופכת לבלתי ניידת, הוציאו את המבחנה מהקרח באופן מיידי כדי למנוע חשיפת יתר והניחו את הדבורה ברתמת קיבוע. קבעו את הדבורה כך שחלקו הגבי של הטורקס (thorax) פונה לחלק החתוך של המחזיק וראשה נמצא ממש מעל החלק העליון.
לחצו בעדינות על הדבורה כך שחלקי הפה שלה יבלטו מעבר לקצה המחזיק. החליקו רצועת סרט דביק (duct tape) בין הראש לבית החזה בצד הגבי, והדביקו בחוזקה את הקצה החופשי לדופן המחזיק. ודאו שהסרט ברצועת הקיבוע חלק ומתוח.
לא אמורים להיות מרווחים מורגשים בין החלק הקדמי של מחזיק הדבורה לבין הסרט. אם קיימים מרווחים, ייתכן שהדבורה לא תוכל לפרוש את רגליה כראוי או שתוכל לברוח. יש לאפשר לדבורים כ-30 דקות להתאושש מהרתמה לפני ההאכלה.
לאחר מכן, באזור הרחק מאזור האימון, האכילו כל דבורה בכ-3 עד 4 µL של סוכרוז 0.5 M במהלך המרווח שבין ההאכלה להתניה. הניחו את הדבורים באזור שקט במעבדה, בתוך מכל פלסטיק עם מגבונים נייר רטובים. במהלך זמן זה, מספר דקות לפני תחילת ההתניה, בדקו את המוטיבציה להאכלה על ידי נגיעה באנטנות שלהן עם טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז 0.5 M.
אין לאפשר להם להאכיל במהלך בדיקה זו. אם הם מגיבים על ידי פריסת ה-psis שלהם, הם ככל הנראה בעלי מוטיבציה מספקת ללמידה וניתן להשתמש בהם עבור הפרוטוקול. כאשר הם מוכנים, מקמו את מזרק הריח מזכוכית במחזיק מחימר פיסולי וכווננו אותו כך שהפתח בקצה הרחב יפנה ישירות אל הדבורים ובמרחק של 10 E. קצה המזרק צריך להיות במרחק של סנטימטר אחד עד שניים מהדבורה; הצמידו היטב את החיבור המקשר בין המחסנית למערכת צינורות זרימת האוויר והשסתומים מעל הקצה הצר של המזרק.
בתחילת כל ניסוי, מקמו את הדבורה הרתומה על הפינוני בזירת ההתנייה, כאשר המחושים שלה פונים ישירות לעבר מחסנית הריח. אפשרו לדבורה לנוח בזירה במשך 15 עד 25 שניות לפני תחילת גירוי הריח, כדי לאפשר לה להתרגל לסביבתה החדשה. לחצו על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את מנגנון התזמון להגשת הריח.
נטרו את תגובת הדבורה לריח לאחר תחילת הגירוי ולפני הצגת הגירוי הבלתי מותנה. לאחר כל ניסוי, אפשרו לדבורה לנוח באזור ההתניה למשך 15 עד 25 שניות נוספות כדי לאפשר את תהליך גיבוש הזיכרון הראשוני. העברת הדבורה מוקדם מדי לאחר הניסוי תפחית באופן משמעותי את יעילותו של כל ניסוי התניה.
כדי להגיש את הסוכרוז, החזיקו את קצה המחט במרחק של שני עד שלושה סנטימטרים מהדבורה בזמן הצגת הריח. השתמשו בקצה של זירת האימון כדי למנוע רעידה של המזרק, שכן תנועה זו עלולה להסיח את דעת הדבורה. אות הזנה יישמע במהלך הצגת גירוי הריח.
ברגע שנשמע אות ההאכלה, גע בעדינות במחושים עד שהדבורה תשליך את הproboscis, ולאחר מכן האכל את הדבורה. התזמון בין הצגת הריח להגשת הסוכרוז הוא קריטי. באופן אידיאלי, שני גירויים אלו צריכים לחפוף לזמן קצר.
אם חולפים יותר מכמה שניות בין הצגת הריח להצגת הסוכרוז, ביצועי ההתניה יפחתו. לאחר ההתניה, השתמשו בניסיונות מבחן ללא חיזוק כדי להעריך עד כמה הדבורים זוכרות את ההקשר המותנה. ראשית, הציבו מצלמת וידאו על חצובה מעל אזור האימון ומקדו את המצלמה לחלקו הקדמי של ראש הדבורה, כך שהמחושים והחרטום (proboscis) יהיו בפוקוס חד.
וודאו שנורית LED קטנה, המציינת את הגשת גירוי הריח, נמצאת באזור מאחורי הדבורה ובמיקום שבו היא נראית בווידאו, אך לא לדבורה. הדבר מאפשר זיהוי של זמן תחילת וסיום חשיפת הריח במהלך הניתוח. לקבלת התוצאות העקביות ביותר, השתמשו במחסניות ריח שהוכנו לאחרונה לצורך הבדיקה לאחר שכל הדברים הוגדרו.
התחילו את הבדיקה על ידי הצגת הריח כפי שהודגם קודם לכן. התחילו להקליט 20 שניות לפני הצגת הריח והמשיכו בהקלטה למשך 20 שניות לפחות לאחר מכן. לאחר הבדיקה, השתמשו בתוכנה לעריכת וידאו כדי לדרג את תגובתו של כל דבורה לתנאי הגירוי.
השתמש במערכת ניקוד בינארית כדי לדרג את תגובת ה-psis extension, כאשר התגובות יסווגו כחיוביות או שליליות. דרג את תגובתו של B כחיובית כאשר ה-B מבצע extensus psis מעבר לקו הנוצר מחיבור קצות המנדיבולות הפתוחות, ורק כאשר B פושט את ה-prob bois לאחר תחילת הריח אך לפני סיומו. דרג את תגובתו של B כשלילית כאשר אין פריסה של ה-prob Bois במהלך הניסוי, או אם ה-Pro Bois נפרס לאחר סיום חשיפת חומר הריח. ניתן לאסוף פרמטרים נוספים, כגון השהייה עד לפריסה, ומספרם ומשכם הכולל של תגובות ה-extension response לתנאי הניסוי.
הגירוי הועלה במהלך ניסיונות ההתניה העוקבים. תגובות לריחות בדיקה חדשים, שהבדילו את עצמם מהגירוי באורך שרשרת הפחמן ו/או במיקום הפחמן-פחמן, פחתו באופן יחסי למידת ההבדל בין גירוי ההתניה לבין ריח הבדיקה החדש. נתונים אלו ממחישים את השונות ואת ההתניה המוצלחת בין חוקרים חדשים.
התגובות ל-octal השתנו בהתאם לקבוצה שביצעה את הבדיקה. במהלך ניסויי הבדיקה, הריח ששימש כגירוי המותנה עורר את התגובה החזקה ביותר. כאשר octal שימש כגירוי המותנה, התגובה הייתה חזקה יותר במהלך הבדיקה בהשוואה ל-methyl cyclone, ריח חדש.
באופן דומה, מתיל סיקלופנטן (methyl cyclone) עורר תגובות חזקות יותר כאשר שימש כגירוי המותנה. כאשר נעשה שימוש בצימוד הפוך, התגובה המותנית פחתה לרמה הקרובה לזו של ריח חדש, מה שממחיש את חשיבות התזמון המדויק להצלחת ההתנייה. לאחר פיתחו, סלל טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את הבסיסים העצביים של למידה וזיכרון באורגניזמי מודל של חרקים, כגון דבורת הדבש.
אל תשכחו שעבודה עם חרקים, ובמיוחד עם דבורי דבש, עלולה להיות מסוכנת. ודאו שאתם לובשים ציוד מגן מתאים בעת העבודה עם בעלי חיים אלו.
סקירה כללית
פרוטוקול ההתנייה של תגובת מתיחת השפיר (PER) מאפשר לחוקרים ללמוד מנגנווני למידה בדבורי דבש ובחרקים אחרים. שיטה זו היא רלוונטית מבחינה אקולוגית וניתנת למדידה כמותית, מה שהופך אותה לכלי בעל ערך במחקרי התנהגות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- אנטומולוגיה
רקע
- פרוטוקול ההתניה של PER מיועד לדבורי דבש (Apis mellifera).
- שיטה זו מעריכה התנהגות למידה בתגובה לגירויי מזון.
- היא רגישה לגורמים סביבתיים כגון חומרי הדברה.
- הבנת התנהגות זו יכולה לספק מידע למחקרים על בריאות דבורים ואקולוגיה.
מטרת המחקר
- להדגמת התנייה התנהגותית של דבורי דבש.
- להערכת ההשפעות של גירויים שונים על תגובות למידה.
- לסבסוד מדריך חזותי ליישום של פרוטוקול ה-PER.
שיטות שהשמשו
- לכידה וקיבוע של דבורי דבש ברתמות.
- האכלת הדבורים בתמיסת סוכרוז כדי להניע למידה.
- הצמדה של הצגת ריח עם תגמול סוכרוז במהלך ההתנייה.
- ביצוע ניסיונות ללא חיזוק למדידת התגובה וזמן השיהוי.
תוצאות עיקריות
- הושגה התנייה מוצלחת של תגובת פריסת החרטום.
- זמן השהייה ומשך התגובה נמדדו ביעילות.
- ניתוח הנתונים הראה את השפעת התזמון על הצלחת ההתנייה.
- שגיאות נפוצות בפרוטוקול זוהו וטופלו.
מסקנות
- פרוטוקול ה-PER הוא שיטה מהימנה לחקר למידה בדבורי דבש.
- תשומת לב לפרטים היא קריטית לביצוע מוצלח של הפרוטוקול.
- שיטה זו יכולה לסייע בהערכת ההשפעות של גורמי עקה סביבתיים על התנהגות הדבורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול תגובת מתיחת החרטום (PER) מספק בדיקה התנהגותית כמותית לחקר מנגנוני למידה וזיכרון במודלים של חרקים, מה שמאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות במחקר נוירו-התנהגותי. הרגישות שלו להשפעות תת-לתיאליות של גורמי עקה סביבתיים תומכת בביטחון תחזיתי בהערכת בטיחות של תרכובות ובהשפעה אקולוגית. יכולת ההסתגלות של השיטה למינים שונים והשילוב שלה עם כלי ניטור עצביים משפרים את הרציפות התרגומית ממגלה בסיסית למחקר חקלאי וביו-רפואי יישומי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות ללמידה, זיכרון ועיבוד חושי במודלים של חרקים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מדידת תגובות רפלקסיביות מותנות לגירויים המצומדים לחיזוק.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדדים כמותיים של פלסטיות התנהגותית תחת תנאים מבוקרים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק פלטי התנהגות סטנדרטיים וניתנים לשחזור, הכוללים מדדי תגובה בינארית, זמן תגובה (latency) ומשך זמן.
- ערך תפעולי: מאפשר מוכנות של הבדיקה לסריקה בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput screening) של תרכובות המשפיעות על התפקוד העצבי או על ההתנהגות.
- יכולת הרחבה (Scalability): תואם לדירוג מבוסס וידאו ובקרת סביבה ליישום עקבי בין מעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות הרלוונטי למחלות על ידי קישור אסוציאציות בין ריח לסוכרוז לנתיבים עצביים המודולטורים על ידי חומרי הדברה או רעלים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הרלוונטית למחלות להערכת השפעות התנהגותיות תת-קטלניות של כימיקלים חקלאיים או חומרים נוירו-אקטיביים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי להערכת סיכונים פרה-קלינית בטוקסיקולוגיה סביבתית ואנטומולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול ה-PER משתלב ברצף הגילוי על ידי כך שהוא מאפשר בדיקת השערות במחקרים מוקדמים במדעי העצבים, תומך בפיתוח בדיקות לסריקה נוירו-התנהגותית, ומספק נתונים לקבלת החלטות תרגומיות בהערכות של בריאות סביבתית ובטיחות של כימיקלים חקלאיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני למידה וזיכרון באמצעות פרדיגמות מבוקרות של התנייה אסוציאטיבית.
- סריקה: מספקת מדדים התנהגותיים כמותיים (נוכחות תגובה, השהיה, משך זמן) המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות בניתוח רעילות עצבית.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים כגון הסתברות לתגובה, השהיה עד להארכה ומשך זמן הארכת השוף (proboscis extension) לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול האופן שבו גורמי סטרס סביבתיים משנים התנהגות במערכות חרקים רלוונטיות מבחינה אקולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה התנהגותית ניתנת לשימוש חוזר על פני מיני חרקים והקשרי מחקר שונים, ובכך מפחיתה פיתוח כפיל של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזויי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי למידה וזיכרון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של רתימה, תזמון גירויים ודירוג.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go בשלבי סינון ראשוניים על ידי זיהוי ליביליות נוירו-התנהגותית לפני פיתוח הדורש משאבים רבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות בהתבסס על השפעות התנהגותיות במינים שאינם מטרה, ובכך תומך בקווי מו"פ בני-קיימא.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחרקים, התנייה התנהגותית ודירוג תגובות מבוסס וידאו.
- תלוי במכשור ייעודי הכולל רתמות, מערכות להעברת ריחות, מכשירים להאכלת סוכרוז וציוד להקלטת וידאו.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמון הגירויים, בקרות סביבתיות וקריטריוני דירוג כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בין מיני חרקים שונים עקב הבדלים בגודל, במוטיבציה ובספי תגובה רפלקסיביים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בבקרה פרוצדורלית קפדנית, שכן סטיות בתזמון הריח-סוכרוז מפחיתות משמעותית את יעילות ההתנייה.
