תגובת פרוטוקול חוטם הרחבה לחקירת פלסטיות התנהגות בחרקים: בקשה ליסוד, ביו רפואית, ומחקר חקלאי
8 בספטמבר 2014
פרוטוקול ההתניה של Proboscis Extension Response (PER), שפותח עבור דבורת הדבש (Apis mellifera), מספק אמצעי רלוונטי מבחינה אקולוגית וניתן לכימות בקלות לחקר מספר מנגנוני למידה שונים במיני חרקים רבים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות כיצד ליישם התניה התנהגותית של תגובה רפלקסיבית פשוטה למזון אצל דבורי דבש. זה מושג תחילה על ידי לכידת דבורי דבש, ריסון שלהן ברתמות, האכלתן בכמות קטנה של תמיסה סודית, ולאחר מכן מתן אפשרות להן להתרגל לריסון. לאחר מכן נבחרים חרוזים להתניה המראים מוטיבציה מספקת כאשר נוגעים באנטנות שלהם בסוכרוז.
במהלך ההתנייה, הצגת הריח משולבת עם תגמול סוכרוז כדי לעורר את התגובה המותנית. לאחר מכן, ניסויים לא מחוזקים מודדים את הנוכחות או היעדר התגובה, את זמן ההשהיה של התגובה ואת משך התגובה. השלב האחרון הוא ניתוח נתונים והצגה גרפית של ניסויי ההתניה והבדיקה.
טכניקה זו יושמה בהצלחה במחקרים על ביולוגיה של דבורי דבש והתנהגות למידה בריאותית רגישה במיוחד לטיפולים משבשים כגון חומרי הדברה, מה שמאפשר להעריך את ההשפעה של טיפולים מסוג זה על התנהגות דבורי הדבש ברמות תת-קטלניות. הדגמה חזותית של שיטה זו מסייעת בהבנת תזמון הגירוי הנדרש להתניה יעילה והשגיאות הנפוצות המפחיתות את היעילות. אדם חדש בשיטה זו יתקשה עם תשומת הלב לפרטים הנדרשים הן בפרוטוקול והן בתנאי הסביבה.
כדי להתחיל לאסוף דבורים פועלות מהכניסה למושבה כשהן עוצרות לפני היציאה או כשהן חוזרות מחיפוש מזון. לכוד רק דבורה אחת בכל בקבוקון. החזק את פתח הבקבוקון אופקית או פונה כלפי מטה תוך הידוק המכסה כדי למנוע בריחה.
לאחר איסוף הדבורים, חזרו למעבדה והניחו כמה מהבקבוקונים בכל פעם בתרחיץ מי קרח. ברגע שדבורה אינה זזה, הסר את הבקבוקון מהקרח מיד כדי למנוע חשיפת יתר והנח את הדבורה ברתמת ריסון. רסנו את הדבורה כשבית החזה הגבי שלה פונה לחלק החתוך של המחזיק וראשה ממש מעל החלק העליון.
לחץ בעדינות על הדבורה כך שחלקי הפה שלה ישתרעו מעבר לקצה המחזיק. החלק רצועת סרט דביק בין הראש לבית החזה בצד הגב והצמד היטב את הקצה החופשי לצד המחזיק. ודא שהסרט על הרתמה חלק ומתוח.
לא אמורים להיות פערים ניכרים בין החלק הקדמי של מחזיק הדבורים לקלטת. אם יש פערים, ייתכן שהדבורה לא תוכל להאריך את הפרבואה שלה כראוי או שהיא תוכל לברוח. אפשר לדבורים כ-30 דקות להתאושש מהרתמה לפני ההאכלה.
לאחר מכן, באזור הרחק מאזור האימון, האכילו כל דבורה כשלושה עד ארבעה מיקרוליטרים של סוכרוז מולארי 0.5 במהלך המרווח בין האכלה להתנייה. הניחו את הדבורים באזור שקט במעבדה ובכלי פלסטיק עם מגבות נייר רטובות. במהלך תקופה זו, כמה דקות לפני תחילת ההתנייה, טסטה מקבלת מוטיבציה להאכיל על ידי נגיעה באנטנות שלהם עם טיפה קטנה של תמיסת סוכרוז מולרית 0.5
.אל תאפשר להם להאכיל במהלך בדיקה זו. אם הם מגיבים על ידי הרחבת הפסיס שלהם, כנראה שיש להם מספיק מוטיבציה ללמוד וניתן להשתמש בהם לפרוטוקול. כשהוא מוכן, הנח את מזרק ריח הזכוכית במחזיק חימר דוגמנות והתאם אותו כך שהפתח בקצה הרחב יופנה ישירות אל הדבורים ו -10 E.קצה המזרק צריך להיות סנטימטר עד שני סנטימטרים מהדבורה הניח היטב את האביזר המחבר את המחסנית למערכת צינורות ושסתומי Airstream מעל הקצה הצר של המזרק.
בתחילת כל ניסוי, הנח את הדבורה הרתומה על היתד בזירת המיזוג כשהאנטנות שלה מכוונות ישירות לכיוון מחסנית הריח. תנו לדבורה לנוח בזירה במשך 15 עד 25 שניות לפני שתתחילו בגירוי הריח כדי לאפשר לה להתרגל לסביבתה החדשה. לחץ על כפתור ההתחלה כדי להפעיל את מנגנון התזמון לאספקת ריחות.
עקוב אחר תגובת הדבורה לריח לאחר הופעת הגירוי ולפני הצגת הגירוי הבלתי מותנה. לאחר כל ניסוי, אפשר לדבורה לנוח באזור המיזוג למשך 15 עד 25 שניות נוספות כדי לאפשר יצירת זיכרון ראשוני. הזזת הדבורה מוקדם מדי לאחר הניסוי תפחית משמעותית את היעילות של כל ניסוי התניה.
כדי לספק את הסוכרוז, החזק את קצה המחט במרחק של שניים עד שלושה סנטימטרים מהדבורה בזמן הצגת הריח. השתמש בקצה זירת האימונים כדי למנוע טלטול המזרק מכיוון שתנועה זו עלולה להסיח את דעתה של הדבורה. אות האכלה יישמע במהלך הצגת גירוי הריח.
ברגע שאות ההזנה נשמע גע קלות באנטנות עד שהדבורה מתרחבת כחוטם, ואז האכילו את הדבורה. התזמון בין הצגת הריח להצגת הסוכרוז הוא קריטי. באופן אידיאלי, שני הגירויים הללו צריכים לחפוף לזמן קצר.
אם חולפות יותר מכמה שניות בין הצגת הריח להצגת הסוכרוז, הביצועים במיזוג יפחתו. לאחר ההתנייה, השתמש בניסויי בדיקה לא מחוזקים כדי להעריך עד כמה הדבורים זוכרות את האסוציאציה המותנית. ראשית, הציבו מצלמת וידאו על חצובה מעל אזור האימון ומקדו את המצלמה בקדמת ראש הדבורה כך שהאנטנות והפרובוס יהיו בפוקוס חד.
ודא שנורת LED קטנה, המציינת הצגת גירוי ריח, נמצאת באזור מאחורי הדבורה והיכן שהיא נראית בסרטון, אך לא לדבורה. זה מאפשר זיהוי של זמן הופעת הריח והיסט במהלך הניתוח. לקבלת התוצאות העקביות ביותר, השתמש במחסניות ריח טריות שהוכנו לבדיקה לאחר שהכל מוגדר.
התחל את הבדיקה על ידי הצגת הריח כפי שהוצג קודם לכן. התחל להקליט 20 שניות לפני הצגת הריח והמשך להקליט לפחות 20 שניות לאחר מכן. לאחר הבדיקה, השתמש בתוכנת עריכת וידאו כדי לדרג את התגובה של כל דבורה למצב לגירוי.
השתמש במערכת ניקוד בינארית כדי לנקד את תגובת הרחבת ה-psis, תוך ציון התגובות כחיוביות או שליליות. התגובה של ציון B חיובית. כאשר ה-B מאריך את ה-psis מעבר לקו שנוצר על ידי חיבור קצות הלסת התחתונה הפתוחה משיג תגובה חיובית רק כאשר ה-B מאריך את ה-prob bois שלו לאחר הופעת הריח, אך לפני ציון קיזוז הריח התגובה של B כשלילית כאשר אין הרחבה של ה-prob Bois במהלך הניסוי, או אם ה-Pro Bois מורחב לאחר היסט הריח, ניתן לאסוף פרמטרים אחרים כגון ההשהיה להרחבה והמספר ומשך הזמן הכולל של תגובות תגובת ההרחבה למצב.
הגירוי גדל במהלך ניסויי ההתניה הבאים. התגובות לריחות בדיקה חדשים, שהיו שונים מהגירוי באורך שרשרת הפחמן ו/או במיקום של פחמן הפחמן הופחתו באופן פרופורציונלי למידת ההבדל בין גירוי המצב לריח הבדיקה החדש. נתונים אלה ממחישים את השונות וההתניה המוצלחת בין חוקרים חדשים.
התגובות לאוקטלי היו שונות בהתאם לקבוצה שביצעה את הבדיקה. במהלך ניסויי הבדיקה, הריח ששימש כגירוי המצב עורר את התגובה החזקה ביותר. כאשר אוקטלי שימש כגירוי המצב, התגובה הייתה חזקה יותר במהלך הבדיקה בהשוואה למתיל ציקלון, ריח חדש.
באופן דומה, מתיל ציקלון ייצר תגובות חזקות יותר כאשר הוא שימש כגירוי מותנה. כאשר נעשה שימוש בזיווג לאחור, התגובה המותנית הופחתה לרמת הריח החדש, מה שממחיש את החשיבות של תזמון מדויק להתניה מוצלחת לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את הבסיסים העצביים של למידה וזיכרון ואורגניזמים מודלים של חרקים כמו דבורת הדבש.
אל תשכח שעבודה עם חרקים, במיוחד דבורי דבש עלולה להיות מסוכנת. הקפד ללבוש ציוד מגן מתאים בעת עבודה עם בעלי חיים אלה.
סקירה כללית
פרוטוקול ההתנייה של תגובת מתיחת השפיר (PER) מאפשר לחוקרים ללמוד מנגנווני למידה בדבורי דבש ובחרקים אחרים. שיטה זו היא רלוונטית מבחינה אקולוגית וניתנת למדידה כמותית, מה שהופך אותה לכלי בעל ערך במחקרי התנהגות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- אנטומולוגיה
רקע
- פרוטוקול ההתניה של PER מיועד לדבורי דבש (Apis mellifera).
- שיטה זו מעריכה התנהגות למידה בתגובה לגירויי מזון.
- היא רגישה לגורמים סביבתיים כגון חומרי הדברה.
- הבנת התנהגות זו יכולה לספק מידע למחקרים על בריאות דבורים ואקולוגיה.
מטרת המחקר
- להדגמת התנייה התנהגותית של דבורי דבש.
- להערכת ההשפעות של גירויים שונים על תגובות למידה.
- לסבסוד מדריך חזותי ליישום של פרוטוקול ה-PER.
שיטות שהשמשו
- לכידה וקיבוע של דבורי דבש ברתמות.
- האכלת הדבורים בתמיסת סוכרוז כדי להניע למידה.
- הצמדה של הצגת ריח עם תגמול סוכרוז במהלך ההתנייה.
- ביצוע ניסיונות ללא חיזוק למדידת התגובה וזמן השיהוי.
תוצאות עיקריות
- הושגה התנייה מוצלחת של תגובת פריסת החרטום.
- זמן השהייה ומשך התגובה נמדדו ביעילות.
- ניתוח הנתונים הראה את השפעת התזמון על הצלחת ההתנייה.
- שגיאות נפוצות בפרוטוקול זוהו וטופלו.
מסקנות
- פרוטוקול ה-PER הוא שיטה מהימנה לחקר למידה בדבורי דבש.
- תשומת לב לפרטים היא קריטית לביצוע מוצלח של הפרוטוקול.
- שיטה זו יכולה לסייע בהערכת ההשפעות של גורמי עקה סביבתיים על התנהגות הדבורים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול תגובת מתיחת החרטום (PER) מספק בדיקה התנהגותית כמותית לחקר מנגנוני למידה וזיכרון במודלים של חרקים, מה שמאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות במחקר נוירו-התנהגותי. הרגישות שלו להשפעות תת-לתיאליות של גורמי עקה סביבתיים תומכת בביטחון תחזיתי בהערכת בטיחות של תרכובות ובהשפעה אקולוגית. יכולת ההסתגלות של השיטה למינים שונים והשילוב שלה עם כלי ניטור עצביים משפרים את הרציפות התרגומית ממגלה בסיסית למחקר חקלאי וביו-רפואי יישומי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות ללמידה, זיכרון ועיבוד חושי במודלים של חרקים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מדידת תגובות רפלקסיביות מותנות לגירויים המצומדים לחיזוק.
- ערך ניבוי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדדים כמותיים של פלסטיות התנהגותית תחת תנאים מבוקרים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק פלטי התנהגות סטנדרטיים וניתנים לשחזור, הכוללים מדדי תגובה בינארית, זמן תגובה (latency) ומשך זמן.
- ערך תפעולי: מאפשר מוכנות של הבדיקה לסריקה בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput screening) של תרכובות המשפיעות על התפקוד העצבי או על ההתנהגות.
- יכולת הרחבה (Scalability): תואם לדירוג מבוסס וידאו ובקרת סביבה ליישום עקבי בין מעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות הרלוונטי למחלות על ידי קישור אסוציאציות בין ריח לסוכרוז לנתיבים עצביים המודולטורים על ידי חומרי הדברה או רעלים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הרלוונטית למחלות להערכת השפעות התנהגותיות תת-קטלניות של כימיקלים חקלאיים או חומרים נוירו-אקטיביים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תובנות מכניסטיות משלב הגילוי להערכת סיכונים פרה-קלינית בטוקסיקולוגיה סביבתית ואנטומולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול ה-PER משתלב ברצף הגילוי על ידי כך שהוא מאפשר בדיקת השערות במחקרים מוקדמים במדעי העצבים, תומך בפיתוח בדיקות לסריקה נוירו-התנהגותית, ומספק נתונים לקבלת החלטות תרגומיות בהערכות של בריאות סביבתית ובטיחות של כימיקלים חקלאיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני למידה וזיכרון באמצעות פרדיגמות מבוקרות של התנייה אסוציאטיבית.
- סריקה: מספקת מדדים התנהגותיים כמותיים (נוכחות תגובה, השהיה, משך זמן) המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות בניתוח רעילות עצבית.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים כגון הסתברות לתגובה, השהיה עד להארכה ומשך זמן הארכת השוף (proboscis extension) לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול האופן שבו גורמי סטרס סביבתיים משנים התנהגות במערכות חרקים רלוונטיות מבחינה אקולוגית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה התנהגותית ניתנת לשימוש חוזר על פני מיני חרקים והקשרי מחקר שונים, ובכך מפחיתה פיתוח כפיל של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזויי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי למידה וזיכרון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה בין מעבדות באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של רתימה, תזמון גירויים ודירוג.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go בשלבי סינון ראשוניים על ידי זיהוי ליביליות נוירו-התנהגותית לפני פיתוח הדורש משאבים רבים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות בהתבסס על השפעות התנהגותיות במינים שאינם מטרה, ובכך תומך בקווי מו"פ בני-קיימא.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחרקים, התנייה התנהגותית ודירוג תגובות מבוסס וידאו.
- תלוי במכשור ייעודי הכולל רתמות, מערכות להעברת ריחות, מכשירים להאכלת סוכרוז וציוד להקלטת וידאו.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמון הגירויים, בקרות סביבתיות וקריטריוני דירוג כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בין מיני חרקים שונים עקב הבדלים בגודל, במוטיבציה ובספי תגובה רפלקסיביים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בבקרה פרוצדורלית קפדנית, שכן סטיות בתזמון הריח-סוכרוז מפחיתות משמעותית את יעילות ההתנייה.
