JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה

Full Text

10,522 Views

09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

מעגל ההאכלה בזחלי melanogaster דרוזופילה משמש מודל פשוט אך רב עוצמה המאפשר שינויים בשער האכלה להיות מתואמים עם שינויים במעגלים העצביים stomatogastric. מעגל זה מורכב מתאי עצב סרוטונין המרכזיים ששולחים תחזיות לפי הווים כמו גם המעי הקדמי.

Transcript

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש במערכת מודל הדרוזופילה כדי לתאם תפוקות התנהגותיות עם שינויים בארכיטקטורה העצבית. זה מושג על ידי הקמת כלובי אוכלוסייה של דרוזופילה בוגרת לאיסוף זחלים. השלב הבא בהליך הוא הערכת יכולת התנועה של זחלי כוכב שני עד שלישי מאוחר.

השלב השלישי הוא להעריך את התנהגות האכילה של הזחלים על ידי התבוננות בהארכה ונסיגה של ווי הפה שלהם. השלב האחרון הוא לנתח ולהכין דגימות חדריות מוכחות מזחלי כוכב שלישי מאוחר באמצעות טכניקות אימונוהיסטוכימיות. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות כיצד סטיות בארכיטקטורה העצבית במהלך ההתפתחות קשורות לשינויים התנהגותיים באמצעות שימוש משולב במבחנים התנהגותיים ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת הבנה טובה יותר של התפתחות הארכיטקטורה העצבית, המאפשרת להבין טוב יותר את התקדמותן של מחלות נוירולוגיות. מי שמדגים את ההליך יהיה פרג בוט, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי. שמור על כלובי אוכלוסיית דרוזופילה ב-25 מעלות צלזיוס במחזור חושך בהיר של 12 שעות.

כל עוד קבוצות הביקורת והניסוי חשופות לאותם תנאי תאורה, ניתן לבצע טכניקה זו בסביבת מעבדה סטנדרטית. באמצעות אוכלוסיות מבוססות אוספים זחלים על ידי מתן אפשרות לנקבות להטיל ביצים למשך הלילה על מיץ תפוחים. צלחות אגר מחליפות את הצלחת בבוקר ומניחות כף קטנה של שמרים במרכז הצלחת שנאספה.

השמרים ימשכו את הזחלים שבקעו, יאפשרו לביצים להתפתח במשך 24 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, ולמחרת יאספו את זחלי הכוכב הראשונים מהעיסה. בעזרת מרית מתכת מעבירים את הזחלים למיץ תפוחים טרי או לצלחת מיץ ענבים. ניתן להוסיף משחת שמרים נוספת כדי להזין את הזחלים עד לביצוע הבדיקות לאיסוף זחלי הכוכב השני והשלישי מאפשרים לכוכב הראשון להזדקן במשך 40 עד 48 שעות.

במהלך פרק זמן זה, קצב ההזנה קבוע לאיסוף. זחלי כוכב שלישי מאוחר מגדלים את הזחלים בבקבוקים. גידול זחלי כוכב שלישי מאוחר על צלחות מיץ עלול להזיק עקב הצטברות חקלאית במערכת הקיבה הסומטית.

ניתן לאשר את גיל הזחל על ידי מורפולוגיה של קרס הפה מכיוון שיש שינויים ברורים במבנה זה. עם כל תבנית זחל, אספו את זחלי הכוכב השני המאוחר ותחילת השלישי על ידי שטיפה עדינה ונרחבת של צלחת המיץ במים ושפכו את הזחלים למסנן רשת, ולאחר מכן המשיכו בניתוח התנהגותי. הניחו זחל יחיד בסוף השני עד תחילת השלישי על מצע של 2% בצלחת תרבית רקמה של 100 מילימטר, ואפשרו לזחלים להתאקלם למשך 30 שניות למשך דקה אחת בדיוק.

באמצעות ספירה נגדית, כל תנועה אחורית לקדמית על פני המצע מבקיעים כל התכווצות המתרחשת על פני שלושה רבעים מגוף החיה. כאשר הזחלים מתנדנדים מצד לצד, אך אינם משנים את מיקומם, התנועות האלה אינן מנוקדות. לפעמים התכווצות מלאה מקדימה לאחור יוצרת תנועה לאחור כמו תנועה קדימה.

תנועה לאחור נרשמת גם היא. החלף את לוחית הבדיקה לאחר ש-10 בעלי חיים לכל היותר נבדקו בסך הכל. בצע לפחות 20 הקלטות לכל תנאי ניסוי.

ציין כל זחל המשמש בבדיקת התנועה במבחן ההזנה באמצעות אינוקס קהה. מספר חמש, פינצטה. העבירו בזהירות זחל מצלחת החקלאות המוטורית למרכז צלחת מלאה בחקלאות המכוסה בחמישה מיליליטר של תמיסת שמרים הומוגנית.

בתמיסת השמרים, הזחלים יישארו ברובם במקומם והאכלת ההזנה תואמת ישירות לקצב התכווצויות קרס הפה, הנתפסות כהארכה ונסיגה של זכויות הלוע של הצפלון אפשר לזחלים להתאקלם למשך 30 שניות, ולאחר מכן למשך דקה אחת, רשום את מספר התכווצויות קרס הפה באמצעות מונה. התחל בהעמסת פורמלדהיד טרי בדרגת 4% EM ב-PBS לתוך נקודתית של שלוש בארות. לאחר מכן העבירו זחל כוכב שלישי נודד לצלחת נתיחה עם PBS.

בעזרת מלקחיים אחד החזיקו את הקצה האחורי ועם השני החזיקו את ווי הפה תוך החזקת הקצה האחורי ללא תנועה. משוך בעדינות את ווי הפה כדי לקבל גישה למעיים. הסר את כל הרקמות הקשורות כמו בלוטות הרוק, המוח, גוף השומן וכן הלאה.

לאחר מכן מעבירים כל מעיים לצלחת שלוש הבארות המכילה את תיקון הפורמלדהיד. דגרו על המעיים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה בקופסת תרבית רקמה אטומה. למחרת לפני הסרת תמיסת הקיבוע, הסר את סקת הקיבה והצמד את המעי האמצעי ליד הגחון המוכח כך שניתן יהיה לראות בבירור את ההקרנות ללא הפרעה.

כעת, החליפו את הקיבוע ב-XPBT אחד ואפשרו לרקמות לדגור במשך 10 דקות עם נדנוד עדין. בצע שטיפת PBT זו שש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו סרוטונין, שישפר את איתות הסרוטונין מבלי להשפיע על הארכיטקטורה העצבית.

לאחר מכן דגרו על המעיים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס מבלי להתנדנד. לאחר שעה, שטפו היטב את המעיים עם PBT שש פעמים כפי שנעשה כדי להסיר את הנוגדן הראשוני. לאחר מכן דגרו על המעיים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני נגד סרוטונין.

למחרת, חזור על שש שטיפות ה-PPT והמשיך עם הדגירה המשנית של הנוגדנים בארבע מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. השתמש באחד עד 400 אלקסה קומה 5 68 עזים אנטי ארה"ב, או אחד עד 400 אנטי ארנב IgG. הסר את הנוגדן המשני באמצעות משטר השטיפה PBT ולאחר מכן דגר את המעיים בנתרן פחמתי של ארבעה מילי-מולרי עם נדנוד עדין למשך 10 דקות.

לאחר מכן ניתן להרכיב את המעיים בפרופיל גלאט 4%N עם נתרן פחמתי של 20 מילי-מולרי כחיץ ולצפות תחת פלואורסצנטיות בהגדלה של פי 400 לניתוח. הימנע מצילום תמונות בקצה האחורי של הגחון המוכח מכיוון שהסיבים הללו ארוזים היטב. יותר סיבים אחוריים במעי האמצעי מסועפים יותר מכיוון שהם מרתקים ברגע שהם נכנסים לרקמה.

ניתן לכמת סיבי נויריט על ידי שימוש בתוכנות מסחריות כמו נוירו-לוסיטה ונוירו-אקספלורר על ידי עיבודם באופן ידני או על ידי שימוש בתוכנה הזמינה בחינם. תמונות עוקב נריט פשוטות שאינן ברורות יקשו על ההבחנה בין הסיב לדליות ואין להשתמש בהן אם ניתן להבחין בבירור בין ארכיטקטורת הסיבים לבין הרקע. ואם ניתן לזהות דליות בודדות לאורך הנריט, התכשיר מתאים לניתוח.

כמו כן, אם ניתן לזהות דליות בודדות משאר הסיב, זהו אינדיקטור נוסף לתמונה איכותית לניתוח. הסיבים האקסונליים הבולטים מהמוח ארוזים לעצב ההישנות ואינם מתאימים לניתוח עד שהם מגיעים לחדר המוכח שבו הם נפרדים ומתעצבים. מערכת הקיבה הקיטור נתח את כל הסיבים למעט אלה שנמצאים מחוץ לטווח המיקוד.

במקרים מסוימים, הסיבים יתעקמו בין מישורי מיקוד מרובים, יעקבו אחר הקרנות הסיבים הבודדים מהמוח אל הגחון המוכח ויספרו את הדליות והענפים, ואז יחשבו את תדירות הדליות הגדולות ליחידת אורך. חקר מעגל ההזנה הסרוטונרגי יעיל לניתוח ההשפעה של גורמים מסוימים על התפתחות מערכת העצבים. על ידי כימות קצב ההזנה, ניתן לקשר את הארכיטקטורה האקסונלית של מעגל ההזנה עם הפלט הפונקציונלי שלו.

הבדיקה התנועתית לא מראה הבדל בתגובות התנועה בין גנוטיפים של ביקורת ומוטנטיות. אם המוטציות משפיעות רק על מעגל ההזנה, הגוף האליפסואיד המוטנטי נפתח. ל-EBO 3 יש פגם מבני בגוף האליפסואיד של הקומפלקס המרכזי.

זן הורי מהסוג הפראי. CSWU גילה כי EO 3 מביא להזנה מדוכאת בעוד שהתנועה אינה מושפעת. הפגמים ההתפתחותיים במוטציות EO שלוש השפיעו על ארכיטקטורת השתן של המעי.

זחלים אלה הראו יותר הסתעפות כמו גם יותר דליות, קטנות וגדולות, לאורך השתן. שימו לב, צמתי הענפים בחצים, הדליות בראשי החצים והדליות הגדולות בכוכבית. שינויים אלה בהסתעפות עצבית כומתו לניתוח סטטיסטי.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לא לפגוע בזחלים או בדגימות הרקמה המנותחות.

Explore More Videos

Neuroscience גיליון 81 מסלולים עצביים דרוזופילה מיקרוסקופית הדמייה התנהגות מנגנוני התנהגות דופמין אימונוהיסטוכימיה neurite proventriculus סרוטונין ורידים מודל חיה