Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים
February 9th, 2014
אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לאלח דם באמצעות קשירת רצף וניקוב בעכברים על מנת לחקור אוטופגיה של רקמות, תהליך הומאוסטטי המאפשר תחלופה של חלבונים ואברונים פגומים. זה מושג על ידי זיהוי תחילה של הסקום והוצאתו מחלל הצפק של העכבר המורדם. לאחר הבידוד, 60% מהסקום נקשר ולאחר מכן מחורר כדי לגרום לדלקת הצפק בדרגה בינונית.
הסאום הקשור והמנוקב מוחזר לחלל הצפק ומותר לבעל החיים להתאושש. השלב האחרון הוא לקצור את רקמות הריאה, הכבד והכליות מהחיה הספיגה 24 שעות לאחר מכן. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אלקטרונים משמש להצגת היווצרות אוטופאגוזום בתאים שלמים מהרקמות שנקטפו מהחיה הספיגה.
נציג קשירת מגל ופונקטו או CLP כאמצעי לגרימת אלח דם ולחקר אוטופגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קודמות כמו הזרקת אנדוטוקסין, הוא הרלוונטיות הקלינית שלה. CLP מוביל לדלקת הצפק, שהיא גורם ידוע לאלח דם פולימיקרוביאלי בבני אדם.
אוטופגיה מייצגת תגובת לחץ כללית ברקמות שעלולות להיות מופעלות על ידי רעב או זיהום חיידקי במהלך אוטופגיה, חומרים ציטופלזמיים, כולל חלבונים באברונים או מבודדים לפאגוזומים כפולים, אשר מועברים לאחר מכן לליזוזומים לפירוק. כדי להתחיל, הכינו את אזור העבודה וסדרו את מכשירי הניתוח הסטריליים הדרושים לניתוח. לאחר מתן הרדמה, השתמש ברפלקס צביטת הבוהן כדי לאשר טשטוש כשהוא מוכן, הניחו את החיה על משטח עבודה נקי ומרחו משחה על העיניים.
לאחר הסרת השיער יש לחטא את אזור הניתוח במריחות חוזרות ונשנות של בטדין ואתנול. השתמש באזמל כדי ליצור חתך עור אורכי קטן במקביל וכסנטימטר אחד שמאלה מקו האמצע. הקפידו לא לחדור לחלל הצפק, השתמשו במספריים קטנים כדי להאריך את החתך הראשוני.
לאחר מכן, זהה את שרירי הבטן ונתח אותם דרכם כדי לקבל גישה לחלל הצפק, השתמש במלקחיים כדי לזהות את הסקום ולהוציא אותו מהחלל. היזהר לא לפגוע בכלי דם מזנטרי שעלול להוביל לדימום קטלני. לאחר הבידוד, קשרו את הסאום בהתאם למידת אלח הדם הרצויה כאן, 60% נקשר לייצור אלח דם בדרגה בינונית.
באמצעות מחט 21 מחוררת דרך הסקום ליד הקשירה, יש לנקב את הסאום מהצד המזנטרי לצד האנטי מזנטרי. לאחר מכן, הסר את המחט וסחט בעדינות את החלק הקשור כדי לאשר את הסבלנות דרך שני החורים. יש להוציא דרכם רק כמות קטנה של צואה.
העבירו את הסאום הקשור והמנוקב לחלל הצפק. השתמש בתפרי משי כירורגיים כדי לסגור גם את שרירי הבטן וגם את העור. לאחר הזרקת מי מלח חמים, הנח את העכבר מתחת למנורת חום עד שהוא מתאושש.
בעלי חיים לאחר ניתוח מקבלים משכך כאבים לפני שהם חוזרים לכלובים הביתיים שלהם עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים. לאחר המתת חסד, יש לשתק את העכבר על משטח עבודה נקי ולחטא את עור הבטן ובית החזה בתמיסת אתנול 70%. השתמש באזמל ובמספריים קטנים כדי להסיר את עור הבטן ובית החזה.
לאחר מכן, בודד את קנה הנשימה על ידי הפרדתו מהשריר ומרקמת החיבור שמסביב. לאחר הבידוד, הניחו תפר סביב קנה הנשימה מבלי להדק אותו. השתמש בצנתר ורידי היקפי קטן כדי להחדיר בזהירות את קנה הנשימה.
הדק את התפר והסר את המחט והשאיר את הצינורית במקומה. לאחר בידוד הלב והריאות, השתמש בצינורית זו כדי להחדיר קיבוע דרך קנה הנשימה עד שהריאות מקובעות היטב. הסר את הלב והריאות והנח אותם ב-4% PFA להמשך עיבוד.
לאחר מכן, הסר את הכבד והכליות באותו אופן. דגימות מעובדות עבור אלקטרון. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה כדי לנתח היווצרות אוטופאגוזומים בתאים שלמים.
ספור פגוזומים אוטומטיים ליחידת שטח מ-15 עד 30 שדות לייצוג סטטיסטי מתאים. לפאגוזומים אוטומטיים יש מבנה ממברנה כפול שבו פגוזומים אוטומטיים בשלב מאוחר דומים ל-VAEs מלאים. עקומות הישרדות אלו מראות את חומרת אלח דם בעקבות קשירה בגדלים שונים.
קשירה של 60% גורמת לאלח דם בדרגה בינונית, מה שמוביל לתמותה של כ-60% לאחר שבעה ימים. קשירה של 75% או יותר מהצקום גורמת לאלח דם בדרגה גבוהה ולאחר מכן S לתמותה של 100% תוך יומיים-שלושה. בעוד שקשירה של 25% או פחות גורמת לאלח דם בדרגה נמוכה ובכך כמעט אפס תמותה.
חיות כירורגיות מזויפות לא אמורות לחוות תמותה. מיקרוגרף מייצג זה של היווצרות אוטופאגוזומים בשלב מוקדם ומאוחר ברקמת הריאה נלקח משישה עכברים שחורים C 57 שעברו קשירה בדרגה בינונית. לפגוזומים אוטומטיים בשלב מוקדם יש מבנה ממברנה כפול.
בעוד שפגוזומים אוטומטיים בשלב מאוחר דומים ל-va מלא. מוצגת תמונת בקרה מייצגת של רקמת ריאה משישה עכברים שחורים C 57 שעברו ניתוח דמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור לקבל מחקר אחר טוב כיצד לבצע קשירת מגל בפונקטו על מנת לגרום לאלח דם בחומרה משתנה כדי לאסוף רקמות ולזהות היווצרות אוטופאגוזומים בתאים של בעלי חיים ספטיים.
חקר התגובות האוטומטיות לאלח דם עשוי להיות שימושי להבנת האופן שבו רקמות מגיבות לזיהום.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקולים לגרימת ספסיס בעכברים באמצעות שיטת קשירת ופירסוט הצפק (CLP) לחקר אוטופגיה. הוא מפרט את תהליך קשירת ופירסוט הצפק, ולאחר מכן איסוף רקמות לניתוח.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה
- פתופיזיולוגיה
רקע
- ספסיס היא מצב חמור שעלול להוביל לכשל איבר.
- אוטופגיה היא תהליך תאי קריטי לשמירת הומאוסטזיס.
- שיטת CLP היא מודל נפוץ לחקר ספסיס in vivo.
- הבנת האוטופגיה בספסיס יכולה לספק תובנות לגבי מטרות טיפוליות.
מטרת המחקר
- לגרום לספסיס בעכברים לחקר אוטופגיה.
- להעריך את היווצרות האאוטופגוזומים ברקמות המושפעות מספסיס.
- לספק פרוטוקולים לחוקרים החוקרים תהליכים אלו.
שיטות בשימוש
- גרימת ספסיס באמצעות קשירת ופירסוט הצפק בעכברים.
- החלמה של החיה לאחר הניתוח.
- איסוף רקמות ריאות, כבד וכליות.
- ניתוח האוטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית.
תוצאות עיקריות
- גרימה מוצלחת של דלקת צפק ברמה בינונית בעכברים.
- הוכחת היווצרות אאוטופגוזומים ברקמות שנאספו.
- קביעת פרוטוקולים למדידת אוטופגיה in vivo.
- תובנות שהושגו לגבי תפקיד האוטופגיה במהלך ספסיס.
מסקנות
- שיטת CLP יעילה לחקר אוטופגיה הקשורה לספסיס.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית היא כלי חשוב לויזואליזציה של אוטופגיה.
- מחקר נוסף יכול לחקור את ההשלכות הטיפוליות של אוטופגיה בספסיס.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The cecal ligation and puncture (CLP) model enables controlled induction of polymicrobial sepsis in mice, providing a clinically relevant system for interrogating autophagy as a tissue stress response. Quantitative assessment of autophagosome formation in harvested tissues supports mechanistic de-risking and target validation for pathways implicated in infection and organ dysfunction. This model underpins translational research continuity from early discovery through preclinical evaluation of host response modifiers.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of autophagy pathway activation in response to polymicrobial sepsis.
- Supports functional target validation by quantifying autophagosome formation in disease-relevant tissues.
- Facilitates mechanistic de-risking for host-directed therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated in vivo system for benchmarking autophagy-modulating compounds.
- Enables reproducible quantification of autophagic vacuoles using electron microscopy or GFP-LC3 readouts.
- Supports assay standardization for downstream compound screening and comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of sepsis for translational biomarker development.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of autophagy-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative tissue response metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The CLP-induced sepsis model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative readouts of autophagy in vivo.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for autophagy activation in infection-driven tissue stress.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for autophagosome formation across tissues.
- Analytics: Enables statistical comparison of autophagic response under varying sepsis severity and interventions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant preclinical models of sepsis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating host response pathways in infection models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in autophagy pathway modulation and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable protocols for in vivo autophagy assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative, disease-relevant tissue readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of host-directed therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical induction of sepsis and tissue harvesting in mice.
- Demands access to electron microscopy or confocal imaging infrastructure for autophagy quantification.
- Necessitates cross-team standardization of severity grading and tissue processing protocols.
- Adaptation across mouse strains or genetic backgrounds may require protocol optimization.
- Practical limitations include animal welfare considerations and technical variability in surgical procedures.
