Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Ilias I. Siempos; Hilaire C. Lam; Yan Ding; Mary E. Choi; Augustine M. K. Choi; Stefan W. Ryter

doi:10.3791/51066

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Immunology and Infection

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

Full Text

29,142 Views

06:40 min

February 9, 2014

DOI: 10.3791/51066-v

Ilias I. Siempos^1,3, Hilaire C. Lam¹, Yan Ding², Mary E. Choi², Augustine M. K. Choi¹, Stefan W. Ryter¹

¹Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine,Brigham and Women's Hospital, ²Department of Medicine, Renal Division,Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, ³First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services,University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לאלח דם באמצעות קשירת רצף וניקוב בעכברים על מנת לחקור אוטופגיה של רקמות, תהליך הומאוסטטי המאפשר תחלופה של חלבונים ואברונים פגומים. זה מושג על ידי זיהוי תחילה של הסקום והוצאתו מחלל הצפק של העכבר המורדם. לאחר הבידוד, 60% מהסקום נקשר ולאחר מכן מחורר כדי לגרום לדלקת הצפק בדרגה בינונית.

הסאום הקשור והמנוקב מוחזר לחלל הצפק ומותר לבעל החיים להתאושש. השלב האחרון הוא לקצור את רקמות הריאה, הכבד והכליות מהחיה הספיגה 24 שעות לאחר מכן. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אלקטרונים משמש להצגת היווצרות אוטופאגוזום בתאים שלמים מהרקמות שנקטפו מהחיה הספיגה.

נציג קשירת מגל ופונקטו או CLP כאמצעי לגרימת אלח דם ולחקר אוטופגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קודמות כמו הזרקת אנדוטוקסין, הוא הרלוונטיות הקלינית שלה. CLP מוביל לדלקת הצפק, שהיא גורם ידוע לאלח דם פולימיקרוביאלי בבני אדם.

אוטופגיה מייצגת תגובת לחץ כללית ברקמות שעלולות להיות מופעלות על ידי רעב או זיהום חיידקי במהלך אוטופגיה, חומרים ציטופלזמיים, כולל חלבונים באברונים או מבודדים לפאגוזומים כפולים, אשר מועברים לאחר מכן לליזוזומים לפירוק. כדי להתחיל, הכינו את אזור העבודה וסדרו את מכשירי הניתוח הסטריליים הדרושים לניתוח. לאחר מתן הרדמה, השתמש ברפלקס צביטת הבוהן כדי לאשר טשטוש כשהוא מוכן, הניחו את החיה על משטח עבודה נקי ומרחו משחה על העיניים.

לאחר הסרת השיער יש לחטא את אזור הניתוח במריחות חוזרות ונשנות של בטדין ואתנול. השתמש באזמל כדי ליצור חתך עור אורכי קטן במקביל וכסנטימטר אחד שמאלה מקו האמצע. הקפידו לא לחדור לחלל הצפק, השתמשו במספריים קטנים כדי להאריך את החתך הראשוני.

לאחר מכן, זהה את שרירי הבטן ונתח אותם דרכם כדי לקבל גישה לחלל הצפק, השתמש במלקחיים כדי לזהות את הסקום ולהוציא אותו מהחלל. היזהר לא לפגוע בכלי דם מזנטרי שעלול להוביל לדימום קטלני. לאחר הבידוד, קשרו את הסאום בהתאם למידת אלח הדם הרצויה כאן, 60% נקשר לייצור אלח דם בדרגה בינונית.

באמצעות מחט 21 מחוררת דרך הסקום ליד הקשירה, יש לנקב את הסאום מהצד המזנטרי לצד האנטי מזנטרי. לאחר מכן, הסר את המחט וסחט בעדינות את החלק הקשור כדי לאשר את הסבלנות דרך שני החורים. יש להוציא דרכם רק כמות קטנה של צואה.

העבירו את הסאום הקשור והמנוקב לחלל הצפק. השתמש בתפרי משי כירורגיים כדי לסגור גם את שרירי הבטן וגם את העור. לאחר הזרקת מי מלח חמים, הנח את העכבר מתחת למנורת חום עד שהוא מתאושש.

בעלי חיים לאחר ניתוח מקבלים משכך כאבים לפני שהם חוזרים לכלובים הביתיים שלהם עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים. לאחר המתת חסד, יש לשתק את העכבר על משטח עבודה נקי ולחטא את עור הבטן ובית החזה בתמיסת אתנול 70%. השתמש באזמל ובמספריים קטנים כדי להסיר את עור הבטן ובית החזה.

לאחר מכן, בודד את קנה הנשימה על ידי הפרדתו מהשריר ומרקמת החיבור שמסביב. לאחר הבידוד, הניחו תפר סביב קנה הנשימה מבלי להדק אותו. השתמש בצנתר ורידי היקפי קטן כדי להחדיר בזהירות את קנה הנשימה.

הדק את התפר והסר את המחט והשאיר את הצינורית במקומה. לאחר בידוד הלב והריאות, השתמש בצינורית זו כדי להחדיר קיבוע דרך קנה הנשימה עד שהריאות מקובעות היטב. הסר את הלב והריאות והנח אותם ב-4% PFA להמשך עיבוד.

לאחר מכן, הסר את הכבד והכליות באותו אופן. דגימות מעובדות עבור אלקטרון. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה כדי לנתח היווצרות אוטופאגוזומים בתאים שלמים.

ספור פגוזומים אוטומטיים ליחידת שטח מ-15 עד 30 שדות לייצוג סטטיסטי מתאים. לפאגוזומים אוטומטיים יש מבנה ממברנה כפול שבו פגוזומים אוטומטיים בשלב מאוחר דומים ל-VAEs מלאים. עקומות הישרדות אלו מראות את חומרת אלח דם בעקבות קשירה בגדלים שונים.

קשירה של 60% גורמת לאלח דם בדרגה בינונית, מה שמוביל לתמותה של כ-60% לאחר שבעה ימים. קשירה של 75% או יותר מהצקום גורמת לאלח דם בדרגה גבוהה ולאחר מכן S לתמותה של 100% תוך יומיים-שלושה. בעוד שקשירה של 25% או פחות גורמת לאלח דם בדרגה נמוכה ובכך כמעט אפס תמותה.

חיות כירורגיות מזויפות לא אמורות לחוות תמותה. מיקרוגרף מייצג זה של היווצרות אוטופאגוזומים בשלב מוקדם ומאוחר ברקמת הריאה נלקח משישה עכברים שחורים C 57 שעברו קשירה בדרגה בינונית. לפגוזומים אוטומטיים בשלב מוקדם יש מבנה ממברנה כפול.

בעוד שפגוזומים אוטומטיים בשלב מאוחר דומים ל-va מלא. מוצגת תמונת בקרה מייצגת של רקמת ריאה משישה עכברים שחורים C 57 שעברו ניתוח דמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור לקבל מחקר אחר טוב כיצד לבצע קשירת מגל בפונקטו על מנת לגרום לאלח דם בחומרה משתנה כדי לאסוף רקמות ולזהות היווצרות אוטופאגוזומים בתאים של בעלי חיים ספטיים.

חקר התגובות האוטומטיות לאלח דם עשוי להיות שימושי להבנת האופן שבו רקמות מגיבות לזיהום.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos