חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש במבחנה Assay דבקות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את יכולתו של תא סטרפטוקוקוס פרוביוטי לעכב היצמדות פנאומוקוק לקו תאי אפיתל. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של חד-שכבות תאי אפיתל CCL 23. בצלחת של 24 בארות מוסיפים סלובאר ופנאומוקוקים לשכבה החד-שכבתית ברצף והתאים מודגרים.

בשלב האחרון, הבארות נשטפות כדי להסיר את החיידקים שאינם נדבקים. תאי האפיתל CCL 23 עוברים ליזה ותכולת הבאר נקצרת. בסופו של דבר, ניתן להעריך את ההשפעה של סליבריוס על היצמדות לפנאומוקוק על ידי כימות מספר הפנאומוקוק הקשורים לתאים.

שיטה זו מסייעת לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הזיהומיות, כגון האם פרוביוטיקה יכולה לעכב את היצמדות הפתוגנים החיידקיים כגון פנאומוקוק. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהתחלנו לחקור את השימוש הפוטנציאלי של לקטובצילוס היפנוזה, GG ופרוביוטיקה אחרת בדרכי הנשימה. ביום שלפני הניסוי פיצול לתרבית מפגש, CCL 23 תאי אפיתל ואז לדלל אותם במדיה טרום חמה לריכוז של 150,000 תאים למיליליטר בשפופרת סטרילית של 50 מיליליטר.

הזרע הבא, מיליליטר אחד של התאים לבאר בצלחת תרבית רקמות מטופלת של 24 בארות ודגירה על התאים למשך הלילה. לאחר מכן באמצעות חיסון לולאה של 10 מיקרוליטר, 10 עד 12 מושבות מופרדות היטב של כל תרבית חיידקים לתוך 10 מיליליטר של מרק טוד יואיט בתוספת 0.5% תמצית שמרים. מערבולת קצרה ודגירה על התרביות למשך 14 עד 16 שעות ביום הניסוי.

מערבולת כל אחת מתרביות החיידקים למשך שלוש עד חמש שניות, ואז הוסף 100 מיקרוליטר פנאומוקוק ו -100 מיקרוליטר סליבריוס לצינורות טרום חמים מסומנים, המכילים 10 מיליליטר מרק. מערבל את הצינורות המחוסנים למשך שלוש עד חמש שניות ודוגר ב-37 מעלות צלזיוס כדי לגדל את התרביות עד אמצע שלב העץ. לאחר אישור שטף של לפחות 80% של תרבית התאים CCL 23, השתמש בפיפטת ההעברה כדי להסיר את המדיה מכל באר של צלחת 24 הבארות ולהטות מעט את הצלחת כדי למנוע הפרעה לשכבת התא החד-שכבתית ולאחר מכן לשטוף בארות פעמיים על ידי הוספת כ-500 מיקרוליטר של PBS מחומם מראש והסרה עדינה של הנוזל בעזרת פיפטת העברה.

הטה את הצלחת במהלך הכביסה כדי לסייע בשימור השכבה המונו-שכבתית לאחר הכביסה השנייה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה חמה מראש לכל באר והחזיר את הצלחת לחממה תוך כדי הכנת תרביות החיידקים. ראשית, מדוד את הצפיפות האופטית של מיליליטר אחד של תרבית הלוואריוס בסופג 600.

לאחר מכן העבירו חמישה מיליליטר מתרבית Sal Levarius לצינור של 10 מיליליטר וצנטריפוגה לצינור למשך ארבע דקות ב-1,870 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת ה-snat Resus, השעו את הגלולה ב-200 עד 1000 מיקרוליטר של נקודה 85% נתרן כלורי בהתאם לקריאת ה-OD לריכוז סופי של כ-1.5 כפול 10 ליחידות היוצרות מושבה תשיעית למיליליטר. הוספת המספר הנכון של חיידקים היא החלק המסובך ביותר בניסוי מכיוון שמספר החיידקים האמיתי שנוספו אינו נקבע עד שמתבצעת ספירת המושבות למחרת.

כעת העבירו את חיסון הרוק המושעה לצינור מיקרו פוגה המסומן גבוה. לדלל את הריכוז הגבוה באחד עד 10 ואחד עד 100 בנקודה נוספת של 85% נתרן כלורי כדי ליצור ריכוזים בינוניים ונמוכים של אלבר עבור צינורות מערבולת הבדיקה בין הדילולים ליצירת בארות הבקרה של הפרין. הסר 40 מיקרוליטר מדיה מכל באר בקרה והוסף 50 מיקרוליטר הפרין לריכוז סופי של 100 יחידות למיליליטר לבאר.

הוסף 10 מיקרוליטר של נקודה, 85% נתרן כלורי לתאי CCL 23 בלבד, ותאי CCL 23 בתוספת פנאומוקוק רק מערבולת לחלוטין את כל ריכוזי אזורי ה-SIV. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של אחד עד 10 וריכוזים שונים לא מדוללים לבארות המתאימות כדי לקדם מגע חיידקי עם התא. צנטריפוגה חד-שכבתית של הצלחת למשך שלוש דקות ב-114 Gs בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגירה על הצלחת למשך שעה בזמן שהתאים דוגרים באופן סדרתי, דלל את מלאי הרוק בנקודה 85% נתרן כלורי והשתמש במפזר סטרילי כדי לפזר 100 מיקרוליטר מתוך 10 למינוס חמש, 10 למינוס שש ו-10 למינוס שבע דילולים בשכפול על צלחות אגר דם סוסים.

תרבית את הלוחות במצב הפוך למשך הלילה לקראת סוף החד-שכבה כדגירה של מצילים. מדוד את הצפיפות האופטית של תרבית הפנאומוקוק ולאחר מכן סובב מטה מיליליטר אחד מהתאים. Resus השעו את הגלולה ב-300 עד 2000 מיקרוליטר של נקודה 85% נתרן כלורי בהתאם לקריאת ה-OD לריכוז סופי של כ-150 מיליון יחידות יוצרות מושבה למיליליטר.

לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של פנאומוקוק לא מדולל לכל הבארות למעט בארות הבקרה השליליות, צנטריפוגה שוב את צלחת 24 הבארות ולאחר מכן דגר על תרביות הקו למשך שלוש שעות במהלך שלב הדגירה. יש לדלל ולצלחת באופן סדרתי את ציר הפנאומוקוק באופן דומה לסליבריוס. לאחר שלוש שעות של דגירה, בדוק את התאים תחת המיקרוסקופ לאיתור השפעה ציטופתית.

כעת הסר את המדיה מכל באר ושטוף בעדינות את תרביות הקו שלוש פעמים עם XPBS אחד כדי להסיר את החיידקים שאינם נדבקים, תוך הקפדה לא להפריע לחד-שכבות. לאחר מכן מפעילים את התאים עם 200 מיקרוליטר של 0.1%חופרים במשך שבע דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, הוסף 800 מיקרוליטר THB לכל אחד.

ובכן פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים וקצרו את תרחיפי התאים מכל באר לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות מסומנים. לבסוף, יש לדלל באופן סדרתי את הפנאומוקוק הדבק ולאחר מכן לספור את המושבות למחרת על לוחות הדילול המתאימים. כדי לכמת את הפנאומוקוק והאלבר בטבלה זו, מוצגות התוצאות מניסוי מייצג שבו הפנאומוקוק נוספו לתאי CCL 23 שעה לאחר הוספת סלובר.

היצמדות לפנאומוקוק כומתה הן על ידי ספירה בת קיימא והן על ידי תוצאות A-Q-P-C-R היו עקביות בין שתי השיטות הן עבור המספר המוחלט של החיידקים והן עבור אחוז ההדבקה. מנורמל למספר הפנאומוקוק הדבק בבארות המכילות פנאומוקוק בלבד.

הפרין משמש כבקרה מכיוון שהוא ידוע כמעכב היצמדות לפנאומוקוק. לכן, הפחתת ההיענות בכ-40% או יותר בדגימות פנאומוקוק בתוספת הפרין בהשוואה לפנאומוקוק בלבד מעידה על בדיקה מוצלחת. מכיוון שהרוק מעכב היצמדות לפנאומוקוק באופן תלוי מינון שבו הריכוז הגבוה של סליבריוס של כ-10 סליבריוס לפנאומוקוק אחד הביא להיצמדות הנמוכה ביותר לפנאומוקוק.

השתלים הללו מדגימים את ההיצמדות של פנאומוקוק לתאי CCL 23 כאשר מוסיפים סליבריוס, שעה לפני הפנאומוקוק במקביל, או שעה לאחר הפנאומוקוק. Alvar יעיל יותר בעיכוב היצמדות לפנאומוקוק כאשר הוא מתווסף לפני הפנאומוקוק, מכיוון שגם המינונים הגבוהים וגם המינונים הבינוניים של Alvar הפחיתו משמעותית את ההיצמדות לפנאומוקוק בבדיקת טרום המהדורה בעוד שמהדורת Coit והמהדורה המאוחרת בודקים רק את המינונים הגבוהים של סלובאר מעכבים היצמדות לפנאומוקוק.

אז לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקה חוץ גופית כדי למדוד את עיכוב ההיצמדות לפנאומוקוק על ידי אזורי תאי הסטרפטוקוקוס הפרוביוטיים.