Name: חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש במבחנה Assay דבקות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: חקור את יכולתו של Streptococcus salivarius לעכב את הידבקות Streptococcus pneumoniae לתאי אפיתל CCL 23 במבחנה. שיטה זו מסייעת לחוקרים להעריך שימוש בפרוביוטיקה למניעת זיהומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממרדוק הילדים מכון המחקר ותכנית התמיכה בתשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני.

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Jacoby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+co-occurrence+of+Streptococcus+pneumoniae+with+other+bacterial+and+viral+pathogens+in+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract.</a> Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).</li>
<li>Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acquisition+and+high+nasopharyngeal+co-colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+three+respiratory+pathogens+amongst+Gambian+new-borns+and+infants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants.</a> BMC Infect. Dis. 11, (2011).</li>
<li>Licciardi, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+against+pneumococcal+disease%3A+critical+interactions+between+probiotics+and+the+airway+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome.</a> PLoS Pathog. 8, (2012).</li>
<li>Popova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+probiotics+in+upper+respiratory+tract+infections+and+their+mechanical+actions+to+antagonize+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens.</a> J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).</li>
<li>Pracht, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavA+of+Streptococcus+pneumoniae+modulates+adherence%2C+invasion%2C+and+meningeal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation.</a> Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).</li>
<li>Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+human+bronchial+epithelial+cells+%28BEAS-2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B).</a> Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+pneumoniae+adherence+to+human+epithelial+cells+in+vitro+by+the+probiotic+Lactobacillus+rhamnosus+GG%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG.</a> BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).</li>
<li>Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+bacteriocins+and+the+case+for+Streptococcus+salivarius+as+model+oral+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics.</a> Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).</li>
<li>Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+oral+probiotic+Streptococcus+salivarius+K12+in+the+prevention+of+recurrent+pharyngitis+and%2For+tonsillitis+caused+by+Streptococcus+pyogenes+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).</li>
<li>Fiedler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+respiratory+tract+streptococci+against+Streptococcus+pyogenes+biofilm+formation+and+epithelial+cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).</li>
<li>Slotved, H. C., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+pneumococcal+isolates+representing+23+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes.</a> BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).</li>
<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
<li>Tonnaer, E. L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+glycosaminoglycans+in+the+attachment+of+pneumococci+to+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells.</a> Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).</li>
<li>Smith-Vaughan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nasal+bacterial+load+and+its+association+with+otitis+media%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ear+Nose+Throat+Disord%22%5BJournal%5D)">Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media.</a> BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).</li>
<li>Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+of+bacterial+adhesion+onto+mammalian+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

חלק קריטי של assay זה הוא הוספת הריכוזים המתאימים של ס salivarius וpneumococci בסעיפי 3.1.7 ו3.1.12. ריכוזים מחושבים באמצעות קריאות OD אבל inocula המדויק לא נקבעו עד צלחות נספרות ביום המחרת. מסיבה זו, אנו ממליצים על ביצוע עקומות גדילה למדידת OD וספירת קיימא (CFU / מיליליטר) לאורך זמן עבור כל זני החיידקים משמשים assay כדי לזהות את שלב אמצע היומן ולסייע בהערכת ריכוז על ידי OD. בנוסף, זני ריאות יכולים להיות שונים באופן משמעותי בדבקות המאפיינים שלהם. זנים עם דבקות טובה (&gt; ...

pneumoniae Streptococcus (pneumococcus) הוא חיידק גראם חיובי שיכול לגרום לזיהומים כוללים דלקת ריאות, דלקת אוזן תיכונה, ודלקת קרום מוח. זה גורם עיקרי למחלות אצל ילדים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ואחראים למותם משוער של 800,000 ילדים מתחת לגיל חמש בשנה 1. Pneumococci לעתים קרובות נשא בלוע אפם של ילדים צעירים. למרות התישבות זו נחשבת בדרך כלל ללא תסמינים, הוא מקדים את זיהום pneumococcal ומשמש כמאגר לחיידקים באוכלוסיות אנושיות 2. חיסון המצומד דלקת ריאות ביעילות מפחית את הכרכרה של קפסיד הכלולים בתוך החיסון. עם זאת, ישנם מעל 90 זנים אל ריאות, וחיסון יכול להוביל להחלפת סרוטיפ, לפיה החיסול של זנים אל חיסון ואחריו עלייה בכרכרה ומחלה הנגרמת על ידי זנים אל nonvaccine 3. כמו כן, בחלק מאוכלוסיות בסיכון גבוה, דלקת ריאותהתישבות מתרחשת לעתים קרובות בשלב מוקדם מאוד בחיים, לפני מתן מנת החיסון הראשונה 4,5. לאחרונה, השימוש בפרוביוטיקה הוצע כאסטרטגיה נוספת כדי לעכב 6,7 קולוניזציה pneumococcal. במבחני חוץ גופית דבקות שנוצלו כדי לבחון דבקות pneumococcal 8,9. מבחני אלה הותאמו כדי לחקור את ההשפעה של לקטובצילוס GG rhamnosus פרוביוטיים (LGG) על דבקות pneumococcal 10. בנוסף לLGG וחיידקים חומצה לקטית אחרים, סטרפטוקוקוס salivarius, תושב נפוץ של חלל הפה, נחקר כפרוביוטיים פוטנציאל לדרכי הנשימה עקב קולוניזציה את הפוטנציאל שלה והיכולת לעכב pneumococci ופתוגנים אחרים בדרכי הנשימה במבחנה 11 - 13. הפרוטוקול המובא כאן מתאר assay דבקות בשימוש כדי לחקור את השפעותיו של ס &#39; salivarius K12 על דבקות pneumococcalלשורת תאי אפיתל האנושית CCL-23. לפני השימוש בassay, מבודד pneumococcal הוערכו על יכולות דבקות, כמו צמיחה ודבקות מאפיינים יכולים להשתנות באופן משמעותי בין מבודד 10,14. עקומות גדילה של pneumococci וס salivarius בוצע כדי לקבוע שלב אמצע יומן וריכוז אומדן (יחידות מושבה להרכיב או CFU / מיליליטר) על ידי צפיפות אופטית (OD, איור 1). מומלץ לבחון את הצמיחה על ידי ספירה וOD קיימא עבור כל בודד לפני השימוש בassay. assay זה יכול להתבצע בכל מעבדה עם מתקני תרבות תקן רקמות וציוד. בפרוטוקול זה, את ההשפעות של שלוש מנות של ס salivarius מנוהל 1 שעות לפני התוספת של pneumococci על דבקותו של ס &#39; pneumoniae PMP843, 19F בודד מרכבת סרוטיפ נגזר מספוגית האף והלוע, נבחנים. שתי דרכים שונות כדי לכמת pneumococci חסיד מוצגות: ציפוי על אגר דם כדי להרתיעשלי ספירות קיימא, ומיצוי DNA וזיהוי של גן lytA pneumococcal ידי 15 qPCR. פרוטוקול assay הדבקות הבסיסי ניתן לשנות בקלות כדי לבדוק מינונים או זמן של ממשל של פרוביוטיקה שונים ויכול לשמש גם עם זני חיידקים אחרים או מין.

<table><tbody><tr><td>מדיה חיונית מינימלית (MEM)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 בקבוק</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תאי CCL-23</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות אגר דם סוסים (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>צלחות אגר דם כבשים מקובלות גם</td></tr> מרק <tr><td>טוד-יואיט</td><td>אוקסואיד</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>דיגיטונין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קובטות חד פעמיות</td><td>קרטל</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>פייזר</td><td>2112105</td><td>מגיע באמפולות סטריליות ב-5,000 IU/5m/&nbsp;</td></tr><tr><td>מפזר סטרילי</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>לחלופין, ניתן לטבול מפזר זכוכית ב-96% אתנול ולעקר להבה לפני כל שימוש</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>קיגן</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פתרון SDS 20%</td><td>אמביון</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת מיני DNA QIAamp (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F פריימר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>בהתאמה אישית 5</td><td>' -> רצף 3' ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R פריימר</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>בהתאמה אישית 5</td><td>' -> 3' רצף&nbsp; TCGTGCGTTTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>LytA בדיקה</td><td>Eurogentec</td><td>בהתאמה אישית 5</td><td>' -> 3' רצף Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, ניתן להשתמש בפלואורופורים חלופיים ללא</td></tr><tr><td>נוקלאז מים</td><td>אמביון</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>לוחית זיהוי תרמו-מהירה 96&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>רצועות כובע qPCR אולטרה-קליר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mx3005 QPCR System</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*מקורות חלופיים זמינים עבור רוב/כל המוצרים המפורטים</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; assay דבקות

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

היצמדות של Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) לאפיתל רירית לוע האף יכולה לגרום לקולוניזציה, והוא נחשב תנאי לדלקות ריאות כגון דלקת ריאות ודלקת אוזן תיכונה. ניתן להשתמש במבחני חוץ גופית דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של pneumococci לאפיתל תא monolayers ולחקור התערבויות פוטנציאליות, כגון השימוש בפרוביוטיקה, לעכב קולוניזציה ריאות. הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לחקור את ההשפעות של salivarius סטרפטוקוקוס פרוביוטיים על הדבקות של pneumococci לשורת תאי אפיתל האנושי CCL-23 (המכונה לעתים הפ-2 תאים). Assay כרוך בשלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה של תאי האפיתל וחיידקים, 2) תוספת של חיידקים לאפיתל monolayers תא, ו3) זיהוי של pneumococci חסיד ידי ספירת קיימא (דילול סדרתי וציפוי) או כמוני בזמן אמת PCR (qPCR ). טק זוhnique הוא פשוט יחסית ולא דורש ציוד מיוחד מלבד התקנה בתרבית רקמה. Assay יכול לשמש כדי לבדוק את המינים פרוביוטיים אחרים ו / או מעכבים פוטנציאליים של קולוניזציה דלקת ריאות וניתן לשנות בקלות כדי לענות על שאלות מדעיות אחרות בנוגע לדבקות ופלישת ריאות.

תוצאות מניסוי נציג שבי pneumococci (ס דלקת ריאות PMP843, בודד מיישבים 19F) נוספו לCCL-23 תאים 1 שעות לאחר התוספת של ס &#39; salivarius, ודבקות pneumococcal הייתה לכמת ידי שתי ספירת קיימא וlytA qPCR מוצגים בטבלה 2. תוצאות היו עקביות בין שתי השיטות הן למספר המוחלט של חיידקים (שהוצג כCFU / מיליליטר) ואת דבקות%, מנורמל למספר pneumococci של חסיד בבארות המכילות pneumococci לבד. הפארין משמש כביקורת כפי שהוא ידוע לעכב היצמדות לדלקת ריאות ולכן הע...

במבחנה יכולים לשמש מבחני דבקות ללמוד את הקובץ המצורף של Streptococcus pneumoniae לאפיתל monolayers תא ולחקור התערבויות פוטנציאליות כגון השימוש בפרוביוטיקה לעיכוב קולוניזציה ריאות.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון את היכולת של חיידק פרוביוטי מסוג streptococcus cell levarius לעכב היצמדות של פנומוקוקים לקו תאי אפיתל. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת שכבות מונולייר של תאי אפיתל CCL 23. בלוחית של 24 בארות, מוסיפים לרצף המונולייר תחילה את ה-slovar ולאחר מכן את הפנומוקוקים, ולאחר מכן מדגריים את התאים.בשלב הסופי, שוטפים את הבארות כדי להסיר את החיידקים שאינם נצמדים. תאי האפיתל CCL 23 עוברים ליזיס ותוכן הבארות נאסף. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעת ה-salivarius על היצמדות הפנאומוקוקים על ידי כימות מספר הפנאומוקוקים הקשורים לתאים.שיטה זו מסייעת במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המחלות הזיהומיות, כגון השאלה האם פרוביוטיקה יכולה לעכב את ההיצמדות של פתוגנים חיידקיים כגון pneumococcus. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר התחלנו לחקור את השימוש הפוטנציאלי ב-lactobacillus hypnosis, GG, ובפרוביוטיקה אחרת בדרכי הנשימה. את ההליך זה ידגימו Jane Manning ו-Zen, סטודנטים לדוקטורט מהמעבדה שלנו. ביום שלפני הניסוי, פצלו תרבית של תאי אפיתל CCL 23 שהגיעו למצב של confluence, ולאחר מכן דללו אותם במצע מראש שהוחם לריכוז של 150,000 תאים למילליטר בתוך מבחנה סטרילית של 50 milliliter.בשלב הבא, זרעו מיליליטר אחד של תאים לכל באר בתוך פלטת תרבית רקמות של 24 בארות שעברה טיפול, והדגירו את התאים למשך הלילה. לאחר מכן, באמצעות לולאת תבחין של 10 מיקרוליטר, זרעו 10 עד 12 מושבות נפרדות מכל תרבית חיידקים לתוך מנה של 10 מיליליטר של מצע Todd Hewitt בתוספת 0.5% yeast extract. ערבבו קצרות בעזרת וורטקס והדגירו את התרביות למשך 14 עד 16 שעות ביום הניסוי.יש לערבב כל אחד מהתרביות החיידקיות במיקסר (Vortex) למשך שלוש עד חמש שניות, ולאחר מכן להוסיף 100 µL של pneumococci ו-100 µL של salivarius למבחנות שחוממו מראש ומסומנות, המכילות 10 mL של מרק גידול. יש לערבב את המבחנות המהוצגות במיקסר למשך שלוש עד חמש שניות ולהדגיר בטמפרטורה של 37 °C כדי לגדל את התרביות עד לשלב הלוגריתמי האמצעי (mid log phase). לאחר אישור של לפחות 80% התרפעות (confluency) של תרבית תאי ה-CCL 23, יש להשתמש בפיפט העברה כדי להסיר את המצע מכל באער בלוח של 24 באערים, תוך הטיית קלה של הלוח כדי להימנע מהפרעה לשכבת התאים החד-שכבתית (monolayer), ולאחר מכן לשטוף את הבאערים פעמיים על ידי הוספת כ-500 µL של PBS שחומם מראש והסרה עדינה של הנוזל באמצעות פיפט העברה.הט את הפלטה במהלך השטיפות כדי לסייע בשימור השכבה החד-שכבתית (monolayer) לאחר השטיפה השנייה. הוסף 500 µL של מצע גידול שחומם מראש לכל באר והחזר את הפלטה לאינקובטור בזמן הכנת תרביות החיידקים. ראשית, מדוד את הצפיפות האופטית של 1 mL מתרבית ה-levarius בבליעה של 600 nm.לאחר מכן, העבירו חמישה מיליליטרים מתרבית ה-Sal Levarius למבחנה של 10 מיליליטרים וסבבו בצנטריפוגה במשך ארבע דקות ב-1,870 Gs בטמפרטורת החדר. לאחר השליפת של הנוזל העליון, השעו את המשקע ב-200 עד 1000 מיקרוליטרים של 0.85% sodium chloride, בהתאם לקריאת ה-OD, עד לריכוז סופי של כ-1.5 × 10⁹ colony forming units למילליליטר. הוספת המספר המדויק של חיידקים היא החלק המורכב ביותר בניסוי, שכן מספר החיידקים הממשי שהתווסף לא נקבע עד לביצוע ספירת המושבות למחרת.כעת העבירו את התרחיף של האינוקולום הרוקי למבחנת מיקרו-צנטריפוגה המסומנת כ-high. דללו את הריכוז הגבוה ביחס של 1:10 ו-1:100 ב-0.85% sodium chloride נוסף כדי להכין ריכוזים בינוניים ונמוכים של alvar עבור הבדיקה. בצעו vortex למבחנות בין הדילולים כדי ליצור את בארי הבקרת heparin. הסירו 40 µL מהמדיום מכל באר בקרה והוסיפו 50 µL של heparin לריכוז סופי של 100 units/mL לכל באר.הוסף 10 µL של sodium chloride בריכוז 0.85% רק לבארים המכילות תאי CCL 23 בלבד, ותאי CCL 23 בתוספת פנומוקוקים בלבד, וערבב את כל אזורי ה-SIV בריכוזים השונים באמצעות vortex. לאחר מכן, הוסף 10 µL של SIV בריכוזים שונים, ללא דילול, בדילול 1:10 ובדילול 1:100 לבארים המתאימות כדי לעודד מגע בקטריאלי עם השכבה החד-שכבתית (monolayer) של התאים. סבב את הפלטה בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-114 ×g בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הדגר את הפלטה למשך שעה בזמן שהתאים עוברים הדגרה. בצע דילול סדרתי של מלאי הרוק ב-sodium chloride בריכוז 0.85%, והשתמש במפזר סטרילי כדי לפרוס 100 µL של דילולים 10⁻⁵, 10⁻⁶ ו-10⁻⁷ בשכפול על פלטות אגר דם סוס.טרבקו את הצלחות במצב הפוך למשך לילה לקראת סוף השכבה המונושכבית בתנאי דגירה. מדדו את הצפיפות האופטית של תרבית הפנומוקוקים ולאחר מכן השקיעו במערבל צנטריפוגי מיליליטר אחד של התאים. השביו את המשקע ב-300 עד 2000 µL של sodium chloride בריכוז 0.85%, בהתאם לקריאת ה-OD, עד לריכוז סופי של כ-150 מיליון colony forming units למיליליטר.לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של פנומוקוקים (pneumococci) ללא דילול לכל הבארים למעט בארי הביקורת השלילית, סבבו שוב את פלטת 24 הבארים בצנטריפוגה ולאחר מכן הדגירו את התרביות המשולבות למשך שלוש שעות. במהלך שלב ההדגרה, בצעו דילול סדרתי וזריעה של מלאי הפנומוקוקים באופן דומה לזה שבוצע עבור ה-salivarius. לאחר שלוש שעות של הדגרה, בחנו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לזהות כל אפקט ציטופתי (cytopathic effect).כעת הסירו את המצע מכל באער ושטפו בעדינות את תרביות השיתוף (co cultures) שלוש פעמים עם 1X PBS כדי להסיר את החיידקים שאינם נצמדים, תוך הקפדה לא להפריע לשכבות התאים (monolayers). לאחר מכן, בצעו ליזיס לתאים באמצעות 200 µL של 0.1% Digitonin למשך שבע דקות ב-37 °C ו-5% CO2. לאחר מכן, הוסיפו 800 µL של THB לכל באער.בצעו פיפוט מעלה ומטה מספר פעמים ואספו את תרחיפי התאים מכל באר למבחנות מיקרו-צנטריפוגה מסומנות. לבסוף, בצעו דילול סדרתי של הפנומוקוקים הדבקים ולאחר מכן ספרו את המושבות למחרת בצלחות הדילול המתאימות. כדי לכמת את הפנומוקוקים ואת ה-slovar בטבלה זו, מוצגות תוצאות מניסוי מייצג שבו הפנומוקוקים התווספו לתאי CCL 23 שעה אחת לאחר הוספת ה-slovar.ההיצמדות של פנומוקוקים כומתה הן באמצעות ספירת חייים והן על ידי תוצאות A-Q-P-C-R, שהיו עקביות בין שתי השיטות הן עבור המספר המוחלט של החיידקים והן עבור אחוז ההיצמדות. הנתונים נורמלו למספר הפנומוקוקים הנצמדים בבארים שהכילו פנומוקוקים בלבד.הפרין משמש כביקורת כיוון שהוא ידוע כמעכב היצמדות של פנומוקוקים. לכן, הפחתה של ההיצמדות בכ-40% או יותר בדגימות של פנומוקוקים בתוספת הפרין בהשוואה לפנומוקוקים לבדם מעידה על בדיקה מוצלחת. כיוון שרוק מעכב היצמדות של פנומוקוקים באופן תלוי מינון, ריכוז גבוה של salivarius של כ-10 salivarius לכל פנומוקוק אחד הוביל להיצמדות הנמוכה ביותר של פנומוקוקים.גרפים אלו מדגימים את היצמדות הפנומוקוקים לתאי CCL 23 כאשר סלבאריוס מתווסף שעה לפני הפנומוקוקים, במקביל להם, או שעה לאחר הפנומוקוקים. אלבאר יעיל יותר בעיכוב היצמדות הפנומוקוקים כאשר הוא מתווסף לפני הפנומוקוקים, שכן הן המינונים הגבוהים והנמוכים של אלבאר הפחיתו משמעותית את היצמדות הפנומוקוקים במערך ה-pre edition. לעומת זאת, במערכי ה-Coit edition וה-post edition, רק המינונים הגבוהים של סלובר עיכבו את היצמדות הפנומוקוקים.לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקה in vitro למדידת עיכוב ההיצמדות של פנומוקוקים על ידי הפרוביוטיקה streptococcus cell areas.

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה הוא פשוט assay הידבקות חיידקים המורכב לספור את המספרים של המושבה חיידקי הקמת יחידות כי הם דבקו על תאים בתרבית. Assay היא חזקה, עצמאית של adhesin למד, וכן וריאציות רבות משמשים ברוב המעבדות עובדים על הפתוגנזה חיידקי.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

מקור: Jagau, H. et al. זיהום פנאומוקוק של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים בזרימה מתמדת. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההדמיה בזמן אמת של התקשרות פנאומוקוקית למיתרי Von Willebrand Factor (VWF) על תאי אנדותל בתנאי זרימת מדיה קבועים. הוא מתאר את השלבים לגירוי שחרור VWF, תיוג המיתרים וכימות קשירת חיידקים.

הערכת התקשרות פנאומוקוקית לתאי אנדותל אנושיים ראשוניים תחת זרימת מדיה קבועה

מקור: קלטאיוד ארויו, מ., ואחרים. הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקים סינתטי בממשק המארח-מיקרוב המעי במבחנה. J. Vis. Exp. (2018).סרטון זה מדגים מודל של מארח-מיקרוב במעי במבחנה לחקר חיוניות חיידקים. קו-קולטורה של תאי Caco-2 ו-HT29-MTX מדוגרת עם חיידקים שעברו טיפול מוקדם בתנאי עיכול מדומים. שלמות מחסום האפיתל מוערכת באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית, וחלקים מהתווך, הריר הממס, הליזאט התא ושאריות התא נאספים לניתוח במורד הזרם.

מודל המעי במבחנה להערכת הידבקות ואינטרנליזציה של חיידקים

הסרטון מדגים בדיקת היצמדות בשלב מוצק להערכת היווצרות ביופילם. בצלחת מרובת בארות, חיידקים במדיה בתוספת מלח מרה נצמדים למשטחים מוצקים, ויוצרים ביופילמים, אשר אושרו על ידי קולורימטריה באמצעות צביעה סגולה קריסטלית וטיפול באתנול.

בדיקת היצמדות לשלב מוצק להערכת היווצרות ביופילם

קולוניזציה של nasopharynx מורין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת החילוץ הבא של תאים חסידיים או מגויסים מתואר. טכניקה זו כרוכה בשטיפת nasopharynx ואיסוף של הנוזל דרך nares והוא מסתגל לקריאות שונות, כולל כימות תאים דיפרנציאלי וניתוח של ביטוי mRNA באתרו.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעות חיידקי bioluminescent.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

התחרות בסטרפטוקוקוס פנאומוניה מתווכת על ידי בקטריוצין, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים קטנים עם פעילות מעכבת כלפי פנאומוקוק ומינים קשורים אחרים. כאן אנו מתארים בדיקת שכבת-על חיידקית אופטימלית המאפשרת אפיון של פעילות בקטריוצין וספקטרום מעכב, חסינות ספציפית לבקטריוצין וזיהוי פפטידים לחישת מניין מופרשים.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

מחקר זה מפרט את תהליך gavaging כמויות מדויקות של פרוביוטיקה לעכברים neonatal. הסידור ניסיוני אופטימלי כדי לכלול, אך אינה מוגבלת פרוביוטיקה מינון, שיטות ניהול, כימות של חיידקים במעיים.

פרוביוטיקה מחקרים בעכברים Neonatal באמצעות Gavage

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להתיישבות בעכברים עם pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים, וכן שיטות לא פולשניות לאימות קולוניזציה והערכת התרחבות pks+ E. coli בצואה.

התיישבות עם עכברים pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים

חקור את יכולתו של Streptococcus salivarius לעכב את הידבקות Streptococcus pneumoniae לתאי אפיתל CCL 23 במבחנה. שיטה זו מסייעת לחוקרים להעריך שימוש בפרוביוטיקה למניעת זיהומים.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש

גלה סרטונים נוספים