Shock Wave אפליקציות לסלולריים תרבויות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למנוע השפעות פיזיקליות מסיחות דעת במהלך טיפול בגלי הלם in vitro, וזאת כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. דבר זה מושג תחילה על ידי מילוי מלא של בקבוק תרבית תאים במצע גידול, ולאחר מכן הצבת הבקבוק באמבט מים מחומם. השלב השני הוא שימוש בכמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד בעת הצמדת האפליקטור לאמבט המים.

בשלב הבא, יש להניח את האפליקטור בצורה אופקית כנגד ממברנת אמבט המים. השלב הסופי הוא לוודא שמקור גלי ההלם נמצא בקו אחד עם מרכז בקבוק תרבית התאים, כדי שהתאים ימוקמו במוקד הגל. לבסוף, ניתן לבצע ניתוח של התאים, כפי שמוצג כעת בדוגמה של real-time PCR ומערך ציטוקינים, כדי להראות שינוי בגנים ובציטוקינים הרלוונטיים.

הרעיון למודל זה עלה תחילה כאשר ראינו ששיטות קיימות להחלת גלים קצרים ישירות על תרביות תאים אינן לוקחות בחשבון את השפעת השתקפות הגלים במעבר מתווך התרבית לאוויר הסביבתי. את הפרוצדורה תדגים ד"ר Chante, סטודנטית לדוקטורט מקבוצת המחקר שלי. לתחילת התהליך, חממו 3.5 liters של מי ברז ל-37 °C.

לאחר מכן, העבירו את המים המחוממים למקלחת המים. מפלס המים צריך להיות שלושה סנטימטרים מתחת לקצה העליון של מקלחת המים ולכסות את הממברנה באופן מלא. לאחר מכן, חברו את חיישן הטמפרטורה לספק כוח והניחו את חיישן הטמפרטורה בתושבת שבדופן האחורית של מקלחת המים.

לאחר מכן, תוך כדי ערבוב המים, חברו באופן רציף את המחמם למקור מתח וחממו את המים עד להגעה לטמפרטורה יציבה של 37 °C. בתנאים סטריליים, זרעו את התאים בבקבוקי תרבית T 25.

כך הם יגיעו ל-90% התרפפות (confluency) לאחר דגירה לילה. לאחר מכן, העמידו את הבקבוקים בצורה אנכית ומלאו אותם במצע גידול עד לתחתית צוואר הבקבוק כדי למנוע זיהום. אין לאפשר למצע לבוא במגע עם צוואר הבקבוק או עם פקק הסגירה.

בשלב הבא, סגרו את הבקבוקים באמצעות פקק אטום ללא מסנן כדי למנוע זיהום מהמים שבמקלחת. לאחר מכן, אטמו את הפקקים באמצעות פאראפילם. לאחר איטום הבקבוקים, הצמידו אותם למעמד באמצעות תפסים.

לאחר מכן, הכניסו את הבקבוקים המקובעים לאמבט המים ויישרו את מרכז בקבוק תרבית התאים. מרכז ממברנת אפליקטור גלי ההלם, מרחו כמות נדיבה של ג'ל להעברת אולטרסאונד על האפליקטור של גלי ההלם ועל ממברנת אמבט המים. לאחר מכן, חברו את האפליקטור לממברנה וודאו שאין בועות אוויר ביניהם.

בשלב הבא, החזיקו את אפליקטור גלי ההלם במרכז הממברנה וודאו כי הוא מיושר באופן אופקי ואנכי ביחס לבקבוק תרבית התאים, כדי להבטיח טיפול של כל שטח גידול התאים. לאחר מכן, בצעו ניסוי חלוץ כדי לקבוע את המרחק האידיאלי בין אפליקטור גלי ההלם לבקבוק התרבית, וכן להגדרת פרמטרי הטיפול הנכונים. הקפידו לשמור על בקבוק התרבית ועל האפליקטור בעמדה יציבה במהלך הפעלת מכשיר גלי ההלם.

לאחר קביעת המרחק האידיאלי, בצע את הניסוי תחת פרמטרי טיפול בגלי הלם הרצויים. עם סיום הטיפול בגלי ההלם, הוצא את בקבוק תרבית התאים מאמבט המים, ייבש אותו בעזרת נייר סופג וחטא את פניו החיצוניים של הבקבוק. לאחר מכן, העבר את המצע מהבקבוק אל מבחנה לצנטריפוגה.

שקעו את התאים באמצעות צנטריפוגה לפי פרמטרים רגילים. השעיקו מחדש את משקע התאים בשני מיליליטר של מצע גידול תאים, לאחר מכן העבירו את ת сусפנזיית התאים בחזרה לבקבוק המכיל חמישה מיליליטר של מצע גידול תאים, וגדלו את התאים עד לרמת ההצפיפות (confluency) הנדרשת לניסויי אנליזת תאים. אנליזה של real time PCR של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי (human umbilical vein endothelial cells) חשפה עלייה ברמות ה-mRNA של tie two לאחר טיפול בגלי הלם.

דבר זה מרמז על כך שטיפול בגלי הלם מעודד פרוליפרציה של תאי אנדותל ואנגיוגנזה. רמות הסייטוקינים בווריד הטבורי. תאי אנדותל כומתו באמצעות מערך סייטוקינים.

נמצא כי שני הציטוקינים הדלקתיים IL six ו-IL eight עלו באופן משמעותי, שניהם מעורבים בדלקת הנלווית לתהליך האנגיוגנזה לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים רבים בתחום המדע הבסיסי של גלי הלם לבחון השפעות על סוג תא בודד בניסויי in vitro. אנו מקווים לשכנע חוקרים נוספים להשתמש במודל זה על מנת להשיג תוצאות הניתנות לשחזור ולהשוואה במדעי גלי ההלם.