Name: תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4D Confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: חקור תיקון היסחף תלת-ממדי בניסויים מיקרוסקופיה time-lapse באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח. שיטה זו משפרת מעקב תנועות תאים ומאפשרת יצירת מודלים תלת-ממדיים מדויקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות גבי מרטינס ומארגני סדנת EMBO2010 3D התפתחותית ההדמיה שבו עבודה זו החלה ואת כל התורמים לפרויקטי פיג&#39;י וImageJ.

1. ניסויי ההדמיה 4D הזמן לשגות ההגדרות המשמשות לרכישת תמונה תהיה שונות בהתאם לציוד המשמש. היכולת של מיקרוסקופיה confocal סעיף אופטי מדגם תלוי במספר הגורמים: אורך הגל של עירור, גודל חריר, צמצם מספרי של המטרה, השבירה של המדגם והמדיום שבו המדגם הוא משובץ. גודל חריר confocal נבחר יקבע את העובי של הסעיף האופטי שנאסף. חריר קטן יותר יפיק סעיף אופטי דק יותר הגדלת הרזולוציה Z-הציר, אבל להפחית את כמות האור שנתפס. חריר גדול יותר יגדיל את העובי של הסעיף האופטי, הקטנת רזולוציה Z-ציר, אלא מגביר את כמות האור שנתפס. גורמים נוספים שיש לשקול בעת איסוף נתוני 4D לפני התיקון כוללים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את מהירות סריקה כדי להסיר, או מגבלה, להיסחף דuring לכידתו של זמן בנקודה אחת. לכן הזמן שלוקח לאוסף התמונה צריך להיות חלק קטן של המרווח בין נקודות זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבנים בצורה מושלמת החוזרים, או רשתות, אינם מתאימים כמבנים לרישום כפי שלא ניתן לקבוע את התיקון הנדרש. חרוזים מתפזרים באופן אקראי או מבנים לא אחידים יאפשר רישום חד משמעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם להיסחף צפוי, להגדיל את שטח הסריקה וגבולות מוקד עליון ותחתונים על מנת להבטיח את השטח של עניין נשאר בתוך ערימת התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף להבטחה שיש רזולוציה מרחבית מתאימה כדי לפתור את המבנים של עניין, להגדיר את קצב הדגימה על מנת לספק פתרון זמני לאירועים הדינמיים הנלמדים. הערה: הזמן בין נקודות זמן תמונה ולכן צריך להיות לפחות חצי בזמן ההפסקה בין אירועים חוזרים הרגילים ולהקטין לאירועים חריגים. </li></ol> 2. פתיחת Confocal Dataset חבילת הקוד הפתוחה פיג&#39;י היא הפצה של תכנית ImageJ, המכילה תוספות מותקנות מראש לביצוע תהליכים רבים על נתונים שנאספו מניסויים במיקרוסקופ. התוכנה מספקת ארכיטקטורת עדכון התוספת קלה וכוללת עותק של התוספת להיסחף הנכונה 3D המשמשת לפרוטוקול זה. התוכנה תומכת ביבוא של מגוון רחב של פורמטים של תמונות מיקרוסקופיה קניינית באמצעות השימוש בביו פורמטי יבוא plug-in של מיקרוסקופית פתח הסביבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את תכנית פיג&#39;י (http://fiji.sc/Downloads). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את בסיס הנתונים נרכשו באמצעות תוסף יבואן לוקוסים Bio-הפורמטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בסיס הנתונים גדול יותר מהזיכרון שהוקצה לתכנית, בחר באפשרות &quot;השימוש וירטואלית הערימה&quot; בתוך קטע ניהול זיכרון. </li></ol> 3. תיקון הסחף של אובייקט 3D בהודעת עיבוד במהלך זמן לשגות מורחבלהתנסות מדגם עשוי לעבור גם כאשר משובץ. כדי לתקן את כל תנועה ולאפשר לאירועי ההגירה צילמו להיות מנותחים, שלאחר עיבוד של תמונות ניתן לבצע. כל ההודעה תמונת העיבוד חייב להיות מתואר באופן ברור במתודולוגיה של כל ניתוח הנגזר מעבודה זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהבסיס הנתונים נטען, להפעיל את התוסף להיסחף 3D הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש ערוצי תמונה מרובים, בחר את הערוץ שישמש לרשום את התמונות. זה אידיאלי צריך לייצג את מבנה סטטי בתוך המדגם ולא כל אלמנטים נודדים או ניידים. עם זאת, אם זה לא אפשרי יש לבחור את הערוץ עם התנועה לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זיכרון RAM הזמינים במערכת המשמשת לניתוח זה הוא פחות מכפול בגודל של בסיס הנתונים המקוריים, בחר באפשרות הערימה הווירטואלית השימוש. זה יהיה לאחסן hyperstack הרשום כתמונה ברצף, ולא לשמור את הקובץ ל-RAM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תיקייה לתוספת לאדם פלט מתוקן הר&quot;יקבצי GES. קובץ תמונה נפרד יופק עבור כל ערוץ בכל עמדת z. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן התוסף יערוך ניתוח מתאם שלב זוג חכם בין כל נקודת זמן כדי לקבוע את התיקון הנדרש אשר לאחר מכן מוחל על בסיס הנתונים. </li></ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

היכולת שלנו להשתמש בתוכנה שלאחר עיבוד כדי לתקן להיסחף מדגם של מערכי נתונים הנגזרים מניסויים מיקרוסקופיה זמן לשגות מורחבים מוגבלת על ידי מספר הגורמים. היכולת להבחין להיסחף לעומת תנועת נדידה של מדגם תלויה בסמנים הסלולריים בשימוש. סמנים נייד שהם גם הביעו נרחב בתוך מדגם או אינם מעורבים באירועים נודדים במהלך רכישת תמונה לספק את המקור הטוב ביותר לתיקון להיסחף. התוסף משתמש בערוץ אחד כדי לרשום את התנועה בין נקודות זמן ולאחר מכן חל רישום זה לכל הערוצים של התמונה שנאסף. לכן, זה עשוי להיות י...

confocal הדמיה נעשתה שימוש נרחב בתא וביולוגיה התפתחותית לעקוב תנועות תא ושינויים במורפולוגיה. לכידת סדרה של סעיפים אופטיים במטוסי מוקד שונים מאפשרת את הדור של מודל תלת ממדי (3D) של מדגם, אשר לאחר מכן ניתן להרחיב לארבעה ממדים (4D) על ידי יצירת סדרת הזמן לשגות של מערכי נתונים 3D. הדור של מערכי נתונים 4D מאפשר מדידה מפורטת של תנועות תא והתנהגויות. בניסויי הזמן לשגות לטווח ארוך זה נפוץ לצפות בתנועה לדוגמא. זה יכול להיגרם על ידי אי דיוקים קלים בשלב השליטה החומרה ועמדות מוקד. בעוד שבמקרים אחרים, סחיפה היא תוצאה של תנועות הנגרמות על ידי צמיחת מדגם או גמישות בתוך מדגם תקשורת ההרכבה. שיטות קיימות כדי לפצות או להגביל את תנועות אלה כוללים שיפורים במערכות התמקדות חומרה וקשיחות מוגברת של ההרכבה בינונית. עם זאת, לא ניתן להחיל גישות אלה במקרים רבים עקב של ההדמיהet הנדרש כדי לספק תנאים מתאימים לשימור הדגימות והצמיחה. פתרונות תוכנת קוד פתוח קיימים לתיקון התנועה ב2D לאורך זמן, באמצעות השימוש בStackReg וTurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 התוספים בImageJ או פיג&#39;י, אבל לא יכולים אלה להיות מיושם על מערכי נתונים 4D. כדי לתקן את סחיפת המדגם שפיתחנו plug-in (להיסחף 3D נכון) לנצל את פלטפורמת עיבוד ההדמיה קוד הפתוח, 1 פיג&#39;י. התוספת שלנו היא מסוגלת לבצע רישום מתאם שלב לתקן תנועה המתרחשת כתוצאה מסחיפת מדגם בניסויי הזמן לשגות בתלת ממד. מתאם שלב 6 הוא שיטה יעילה חישובית כדי לקבוע תרגום בין תמונות. Plug-in שתואר כאן מנצל את ספריית שלב המתאם שפותחה על ידי Preibisch et al. 7. בניסויים רב ערוצית, התוספת מנצלת ערוץ אחד לdetermine התיקון הנדרש. תיקון זה הוא אז מיושם על כל ערוצים נוספים וכתוצאה מכך הרישום של בסיס נתוני 4D. במערכת מודל דג הזברה זה אפשרי לבצע הדמיה הזמן לשגות על פני תקופה של שעות רבות, או אפילו כמה ימים 8. שיטה נפוצה להרכבת דג הזברה היא להטביע את העובר החי מורדם בagarose נקודת התכה הנמוך (.8-1.5%), המגביל את תנועתה 9-11. בעוד תנועה מוגבלת צמיחה של המדגם עדיין מתרחשת, וכתוצאה מכך התאים בתוך שדה ראיית הסטת עמדה. על מנת לעקוב אחר תנועתם של התאים בתוך העובר יש צורך תחילה לתקן את תנועה של המדגם כולו. פרוטוקול זה פותח עם דגימות דג הזברה, ונוצל לפיתוח somite התמונה 12 אבל יכול להיות מיושם על כל מערך נתונים confocal 4D.

<table><tbody><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאנסולפונאט (טריקאין)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורת ג'ל נמוכה אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #4 מלקחיים</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי 3 מ"ל בוגר</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת</td><td></td><td></td> <td>העברת פוליאתילן</td></tr><tr><td>צלחות פטרי בדרגת חיידקים 9 ס"מ</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אתילן פרופילן פלואור (FEP) Bola</td><td></td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM-710 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4d confocal

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

הדור של מערכי נתונים confocal (4D) ארבעת ממדים; בהיקף של רצפי תמונת 3D לאורך זמן; מספק מתודולוגיה מעולה כדי ללכוד התנהגויות הסלולר מעורבות בתהליכי התפתחות. היכולת לעקוב ולעקוב אחר תנועות תא היא מוגבלת על ידי תנועות מדגם המתרחשות עקב סחיפה של המדגם או, במקרים מסוימים, צמיחה במהלך רכישת תמונה. תאי מעקב במערכי נתונים מושפעים מסחף ו / או צמיחה ישלבו התנועות הללו לכל ניתוח של מצב תא. זה עלול לגרום לתנועה לכאורה של מבנים סטטיים בתוך המדגם. לכן לפני המעקב סלולרי, צריך להיות מתוקן כל להיסחף מדגם. שימוש בקוד פתוח הפצת פיג&#39;י 1 של ImageJ 2,3 והכלים לוקוסים שילבו 4, פיתחנו את סחף התוספת 3D הנכונה כדי להסיר תנועת מדגם שגויה במערכי נתוני confocal. פרוטוקול זה מפצה באופן יעיל לתרגום מדגם או שינויים בפו המוקדsition ידי ניצול מתאם שלב לרשום בכל פעם נקודה של מערכי נתונים confocal ארבעה ממדים תוך שמירה על היכולת לחזות ולמדוד תנועות תא מעל ניסויי הזמן לשגות מורחבים.

בדג הזברה מתפתחת, תאי שריר מהירים למזג לתוך סיבי multinucleated מ19 שעות לאחר הפריה (20 - שלב somite) 13. על מנת להמחיש את תנועתם של גרעינים ואיחוי של תאי שריר שבוצעו זמן לשגות הדמיה confocal 4D באמצעות זן מהונדס המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של ​​אמרגן α-אקטין השלד לתייג את כל השרירים תאים 14 והזריק RNA המקודד את חלבון הניאון האדום mCherry מתויג עם רצף לוקליזציה גרעיני, לתייג את הגרעינים. עוברים מהונדסים הוחדרו היו רכובים בagarose התכה הנ...

מיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרת ההדמיה של תהליכים התפתחותיים. צמיחה או סחיפה של דגימות במהלך רכישת תמונה מפחיתה את היכולת לעקוב באופן מדויק ולמדוד תנועות תא במהלך פיתוח. אנו מתארים את השימוש בתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח לתיקון לשלושה להיסחף מדגם ממדי לאורך זמן.

תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4D Confocal

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

מיקרוסקופיית TimeLapse מאפשרת ויזואליזציה של תהליכי התפתחות, צמיחה או סחיפה של דגימה המתרחשים לאורך זמן. רכישת תמונות עלולה להוביל לחוסר יכולת לעקוב אחר תנועות התאים; הפרוטוקול הבא מפרט זאת. אנו משתמשים בתוכנה לעיבוד תמונות בקוד פתוח כדי לתקן סחיפה תלת-ממדית לאורך זמן.לכידה של סדרה של חתכים אופטיים במישורי מיקוד שונים מאפשרת יצירה של מודל תלת-ממדי של הדגימה. ניתן להרחיב זאת לארבעה ממדים על ידי יצירת סדרת צילומי time-lapse של מערכי נתונים בתלת-ממד. בניסויי time-lapse ארוכי טווח, נפוץ להבחין בתנועה של הדגימה.דבר זה עלול להיגרם מחוסר דיוק בהזזה בשלב הבקרה של החומרה ובמיקומי המיקוד, בעוד שבמקרים אחרים הסחף הוא תוצאה של תנועות הנגרמות על ידי גדילת הדגימה או גמישות בתוך שיטות תוךי המיקום. קיימות שיטות לפיצוי במטרה להגביל תנועות אלו, עם שיפורים רבים במערכות מיקוד חומרתיות ובקשיחות מוגברת של תוך המיקום. עם זאת, גישות אלו אינן ניתנות ליישום במקרים רבים בשל מערך הדמיה הנדרש כדי לספק תנאים מתאימים לתחזוקה וגדילה של הדגימות לצורך תיקון. עבור סחף דגימה, פיתחנו תוסף המנצל את פלטפורמת עיבוד ההדמיות בקוד פתוח של Fiji.תוסף ה-correct 3D drift שלנו מסוגל לבצע רישום באמצעות קורלציית פאזה (phase correlation registration) כדי לתקן תזוזות המתרחשות כתוצאה מסיבוב או סחף של הדגימה בניסויי time-lapse תלת-ממדיים בניסויים רב-ערוציים. תוסף ה-correct 3D drift משתמש בערוץ אחד כדי לקבוע את התיקון הנדרש. תיקון זה מוחל לאחר מכן על כל שאר הערוצים, מה שמוביל לרישום של מערך הנתונים ה-4D.חבילת רשת חינמית בקוד פתוח. Fiji היא גרסה נגזרת (fork) של תוכנת Image J, הכוללת תוספים מותקנים מראש לביצוע תהליכים רבnumerous על נתונים שנאספו מניסויי מיקרוסקופיה. Fiji מספקת ארכיטקטורת תוספים פשוטה יותר וכוללת אותם בהתקנה כברירת מחדל.עותק של תוסף ה-EG הנכון השלישי, שבו נשתמש לניתוח זה לאחר השלמת ההתקנה. פתח את Fiji. תוכנת Fiji תומכת בייבוא של מגוון רחב של פורמטים קנייניים של תמונות מיקרוסקופיה. ניתן לבצע זאת באמצעות גרירה והשמה (drag and drop) או דרך סביבת המיקרוסקופיה הפתוחה (Open microscopy environment) של המשתמש.תוסף ייבוא בפורמט Bio-formats. אם מערך הנתונים עולה על גודל הזיכרון המותקן במערכת שלך, פתח את קובץ התמונה כמחסנית וירטואלית (virtual stack) והשתמש באפשרות לניהול זיכרון. מערך הנתונים שבו נשתמש בניתוח זה הופק מניסוי סדרת זמן תלת-ממדי של דגי זברה טרנסגננטיים ACTA1-GFP, שבהם ה-GFP מתבטא בשריר השלד.כדי להדמיא את הגרעינים, שורת התוצאות הטרנסגנית הזו הוזנקה ב-M cherry הממוקם בגרעין; כדי לייצג טוב יותר את הפלואורופורים הללו, ניתן לשנות את טבלאות הנתונים (lookup tables) עבור כל אחד מהערוצים הללו תחת כלי ערוץ הצבע. לאורך סדרת הזמנים שנאספה, נראה כי דגימת דג הזיפר (zipper fish) נסחפה משדה הראייה. כדי לתקן סחף זה, פתחנו את תוסף ה-3D drift המתאים בתפריט המשנה של הרישום (registration) תחת התוספים המותקנים ב-Fiji.סמני ייחוס (Fiducial Markers) המבוטאים באופן נרחב בתוך דגימה או כאלה שאינם מעורבים באירועי סימון במהלך רכישת התמונה, מהווים את המקור הטוב ביותר לתיקון סחיפה (drift correction). בדוגמה זו, מדובר ב-ACTA בנתיב אחד, ובפלורסצנציית GFP בנתיב השני. אם הזיכרון במערכת שלכם מוגבל, בחרו באפשרות ה-virtual stack ואפשרו לתוסף Correct 3D drift לרוץ.לסט הנתונים המתוקן יהיה גודל קנבס גדול יותר בהשוואה למקורי, כדי להכיל את תנועת הדגימה. יצירת תמונות היטל מקסימליות (maximum Projection) של החתכים האופטיים מאפשרת לבצע השוואה של הסחף (drift) שהוסר מהדגימה המתוקנת.הקרנת עוצמה מקסימלית (Maximum intensity Projection) מסירה את הממד מסט הנתונים, אך היא מהווה גישה שימושית לבחיקה מהירה של תוצאות תיקון הסחף (drift Correction). כאן אנו רואים את תמונות ההקרנה המקסימלית עבור כל נקודת עיגון (tie point) בסטים של הנתונים המתוקנים והלא-מתוקנים. כאשר ניסוי צילום רב-זמני (time-lapse) זה מוקרן כתמונה אחת, ניכרת כמות הסחף שעלולה להתרחש אפילו בניסוי time-lapse קצר.התיקונים שבוצעו על ידי רישום הסחף של ערוץ אחד של הדגימה שלכם יחולו גם על כל שאר הערוצים הכלולים במחסנית תמונות זו. ההליך לתיקון סחף במקרים בהם הזיכרון במערכת שלכם מוגבל שונה מעט. בחרו באפשרות used virtual stack הן בתפריט import בפורמט ה-buy, והן בתפריט הפופ-אפ של תוסף correct 3D drift.בעת בחירה באפשרות זו, תתבקשו לבחור מיקום שבו תוסף (plugin) יוכל לייצא קבצי תמונה בודדים עבור כל פרוסת ערוץ ונקודת זמן של ניסוי ה-time-lapse שלכם. הערימה הווירטואלית שנוצרה כוללת את אותו תיקון סחף (drift correction) כמו בדוגמה הקודמת שלנו. אם נפתח את מיקום השמירה שנבחר, נראה את קבצי רצף התמונות הבודדים שנוצרו.כדי לפתוח אוסף קבצים זה, השתמש בכלי ייבוא רצף התמונות (image sequence import tool). הקובץ שיתקבל לא יפריד בין ערוצים, חתכים אופטיים או נקודות זמן. כדי להציג מאפיינים אלו, המר את הערימה (stack) להיפר-ערימה (hyper stack) באמצעות הנתונים מקובץ הלוג, והזן את מספר הערוצים, הפרוסות האופטיות ונקודות הזמן שנאספו. ניתן לשנות שוב את טבלאות המיפוי (lookup tables) כדי להתאים את הצבע המוצג של ניסוי ה-time-lapse שלנו.פרוטוקול זה מתקן סחף המתרחש בין נקודות זמן; סחף המתרחש במהלך הלכידה של נקודת זמן בודדת אינו ניתן לתיקון באמצעות פרוטוקול זה. אנו ממליצים כי הפרמטרים המשמשים לרכישת הדמיות יצמצמו את הזמן הדרוש ללכידה של כל נקודת זמן. היכולת לתקן סחף בתוכנת עיבוד לאחר הצילום מאפשרת לנתח ולמדוד תנועות תאים שאלמלא כן היו נבלעות בסחף של הדגימה.

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים את ההכנה של שלוש דגימות בדיקה וכיצד הם יכולים לשמש כדי לייעל ולהעריך את הביצועים של מיקרוסקופים סערה. שימוש בדוגמאות אלה אנו מראים כיצד לרכוש נתונים גולמיים ולאחר מכן לעבד אותו לרכוש תמונות ברזולוציה סופר בתאים של כ 30-50 ברזולוציה ננומטר.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים...

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

עבודה זו מציגה זרימת עבודה למעקב אחר מיקום אטומי בהדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה אטומית. זרימת עבודה זו מתבצעת באמצעות אפליקציית Matlab בקוד פתוח (EASY-STEM).

מעקב אחר מיקום אטומי מדויק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

חקור תיקון היסחף תלת-ממדי בניסויים מיקרוסקופיה time-lapse באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח. שיטה זו משפרת מעקב תנועות תאים ומאפשרת יצירת מודלים תלת-ממדיים מדויקים.

תיקון להיסחף לדוגמא בעקבות הזמן לשגות הדמיה 4D Confocal

גלה סרטונים נוספים