Name: הפרדה אוטומטית של ג elegans יישבו variably ידי פתוגן חיידקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: למדו כיצד להפריד אוטומטית תולעי Caenorhabditis elegans לפי רמות התיישבות פתוגן באמצעות wormsorter. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים חיסוניים והבנת הקשר בין זיהוי פתוגן לתגובה חיסונית בתולעים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים הרפואית אליסון הקרן על תמיכתם. אנו מאחלים גם להודות לחברי המעבדה אבי Dernburg לקבלת סיוע בשימוש בwormsorter.

1. קבלת תרבות מסונכרן של בעלי חיים למבוגרים צעירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תולעים בכמה צלחות NGM seeded עם OP50-1 E. חיידקי קולי (10x מרוכז מתרבות רוויה) עד תולעים רבים הגיעו לשלב הרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בבעלים חיים הרה להולדת עם פתרון ביצת הכנה כדי לקבל תרבות מסונכרנת (ביצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי צלחת על כמה צלחות NGM 60 מ&quot;מ זרע עם 10x OP50-1 מרוכז בצפיפות של כ 150-200 ביצים / צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים (עד תולעים הגיעו L4 - במה למבוגרים צעירה). </li></ol> 2. הכנת צלחות aeruginosa Pseudomonas ומדביק את התולעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של ביצת ההכנה (שלב 1.1) לחסן תרבות PA14 :: ה-GFP לתוך 2 מיליליטר של ריפאמפיצין מדיה המכילה B של המלך בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם התסיסה O / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט הרחוב ללא PA14 :: ה-GFPture על כמה שיותר צלחות איטית הריגה (SKP) לפי צורך עבור assay. על כל צלחת פיפטה 150 מ&quot;מ SKP פטרי 75-100 μl של תרבות רוויה ולהתפשט באופן שווה באמצעות מפזר זכוכית סטרילית. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן החממה ולאפשר להם להתקרר לRT (~ 20 דקות). באמצעות חיץ M9, לשטוף תולעים משלב 1.4 על PA14 :: לוחות GFP בנפח מינימאלי של נוזלים. בעת שימוש ב150 צלחות מ&quot;מ, יכולים להיות ממוקמים כמה מאה תולעים בצלחת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 18-21 שעות. לפ תולעים צעירים מבוגרים חשופים aeruginosa, זה חלון הזמן בו מוצגות החלוקה האופטימלית של קולוניות לעומת חיות noncolonized. </li></ol> 3. הגדרת Wormsorter לפני ביצוע סוג המדגם, להבטיח כי המכשיר פועל כהלכה. פרטים ניתן לקבל בhttp://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, והדואר צעדים חיוניים המפורטות להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לחץ שסתום נדן לכ -5 psi (4.5-5.5 טווח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לוודא שקצב זרימת נוזל הנדן מתאים, למקם את צינור חרוטי 15 מיליליטר מתחת למתקן, להפעיל את שסתום הנדן, ולכבות את שסתום סדרן. החזק את הצינור מתחת למתקן ל60 שניות. הנפח בצינור צריך להיות 9-10 מיליליטר. אם זה מחוץ לטווח זה, התאם את לחץ שסתום נדן בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שקצב זרימת נוזל נדן (כפי שנקבע בשלב 3.2) יאפשר מיון מדויק, לבחון את שיעור מין באמצעות 40 חלקיקי מיקרומטר שליטה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את שסתום הנדן. הוסף על 25 מיליליטר של תמיסת חלקיקי שליטה למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שסתום הנדן, ואת שסתום המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת המחשב, נווט אל &quot;מצב חלקיק השליטה&quot; ולחץ על רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את זרימת חלקיקי השיעור הוא ~ 5-8 חלקיקים / sec, עם TOF (שעת טיסה) שלהן דומים לרוחבשל החלקיקים, 40 מיקרומטר. כגון TOF מציין כי רק אובייקט 40 מיקרומטר אחת עובר דרך בכל פעם. אם ערכים נמצאים מחוץ לטווח זה, התאם את הגדרות (להלן כיוונים לעיל) בהתאם. </li></ol> 4. מיון יישב לעומת התולעים Noncolonized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות M9, לשטוף תולעים לתוך צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל. לאפשר תולעים בוגרות לשקוע לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה ולהסיר את supernatant. מלא את הצינור עם M9 הטרי. חזור על תהליך זה 3-4x. זה מסיר חלק גדול מזחלים, כמו גם חיידקים עודפים ולוקח בערך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תולעים למאגר wormsorter עם בר ומערבב קטן בעדינות ללישת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם רווח אות ראשוני על ידי הגדרה הירוקה PMT 600 והאדומים וצהוב PMT 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכישת נתונים כדי להתאים את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוף לשיעור סוג של 25-30 אירועים (תולעים) לשנייה. אם שיעור המספר גבוה מדי, לדלל את התולעים במאגר עם M9 בהתאם. אם השיעור הואo נמוכה, להוסיף עוד תולעים בנפח קטן של M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הניסוי דורש הפרדה מחמירה מאוד של קולוניות לעומת תולעי noncolonized, להגדיר את &quot;בדיקת צירוף מקרים&quot; ל&quot; טהורה &quot;. הדבר מבטיח כי במקרה שני עצמים מתרחשים קרובים מדי זה לזה או באותו הירידה, המכונה דוחה את הירידה ולא לאסוף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למיין את האוכלוסייה של עניין, לצייר שערים סביב הצירים המציינים גודל (להשיג תולעים בוגרות) ועוצמת הקרינה (כלומר גבוהה לקולוניזציה, נמוכה לnoncolonized). הערכים עבור gating הקרינה צריכים להיקבע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת רב גם או צלחת פטרי מתחת למתקן לאיסוף תולעים לאחר מכן פתח את השסתום מהסוג להתחיל מיון תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף אוכלוסייה קטנה של בעלי חיים כדי לוודא תחת המיקרוסקופ שהאוכלוסייה מסודרים היא האוכלוסייה של עניין. אם לא, להתאים את הפרמטרים gating בהתאם, ולהמשיך באיסוף דגימה. </li></ol>

<ol><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li>
<li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%3A+mechanisms+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li>
<li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance%2C+danger%2C+and+the+extended+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
<li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149, 452-466 (2012).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li>
<li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li>
<li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li>
<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li>
<li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li>
<li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
<li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection%2C+by+modulating+the+nematode%27s+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li>
<li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li>
<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השיטה שאנו מתארים מנצלת ניאון תיוג של גופים מחוץ לתולעת, לעקוב אחרי יחסי גומלין בין התולעת וסביבתו. במקרה שאנו מציגים, הפרדה הייתה מבוססת על תיוג של הפתוגן והועסקה לתולעים נפרדים עם עומס הפתוגן כבד מאלה שאין לי (או אור) עומס. ניתוח ביטוי גנים לאחר לא מצא הבדל בתגובה חיסונית בין שתי הקבוצות שמראות כי הם היו תלויים בעומס הפתוגן. האות שיוזמת את התגובה הראתה במקום אחר להיות קשורים פיזי עם החיידקים, במקום להיות מופרש, מה שמרמז שאות זו עשויה להיות PAMP. יחד, תוצאות אלו תומכות בהשערה כי ...

מיון תולעת אוטומטי הוא הרבה יותר כמו FACS, הפועל על ידי מדידת אות ניאון בתולעת (הניתנת בדרך כלל על ידי ביטוי של חלבונים מהונדסים כתב) כשהוא עובר יישר בצינור, המאפשר ניתוב מחדש או לצינור איסוף / טוב או למכל פסולת על פי לgating פרמטרים שנקבעו על ידי החוקר 1. Wormsorter יכול להקל על מחקר בדרכים רבות; דוגמא להעסקתו ככלי אנליטי היא מחקר שבא בעקבות דפוסי spatiotemporal פעילות אמרגן לכמעט 1,000 גנים 2. עם זאת, השימוש העיקרי של wormsorter הוא במסכים גנטיים, בעקבות רמות יעד גן הביטוי או לוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי לאורך הציר של התולעת 3-5. כאן, אנו מתארים יישום חדש לwormsorter, בבעקבות הקולוניזציה של התולעת על ידי פתוגן מתויג fluorescently. עם זה ככלי שאנחנו מתמקדים במערכת היחסים בין pathogen קולוניזציה / עומס ואת התגובה החיסונית, כדי לקבל תובנות חדשות על המנגנונים אחראים לייזום של מערכת החיסונית בתולעת. כמעט בכל היצורים שנחקרו עד כה, ייזום של תגובה חיסונית מולדת לחיידקי גורמי מחלה תלוי בהכרה של דפוסים הקשורים לפתוגן המולקולריים (PAMPs), ו / או דפוסים מולקולריים סכנה / הקשורים לנזק (damps) 6,7. המבנים הראשונים שמורים של חיידקים הכוללים רכיבים של קיר חיידקי התא, השוטון שלו, או bilayer השומנים שלה 6; השני, כוללים שני מולקולות שפורסמו (למשל ה-ATP 8), חלבונים שונים או סמנים אחרים של תהליכים תאיים שינו 9,10. שני סוגי האותות מוכרים על ידי חלבונים המיועדים כקולטניים זיהוי תבניות (PRRs), שעליו ספציפי מחייב של מולקולת דפוס להפעיל את שרשרת האירועים שהובילו לתגובה המגנה. ג elegans כבר מאוד שימושי כמו tractaמודל ble לנתח היבטים שונים של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן, אבל דבר אחד שאינו מובן היטב הוא איך תגובות חיסוניים הם יזמו בתולעת. אף אחד מהקולטנים המשוערת שorthologous לקולטנים זיהוי תבניות (PRRs) באורגניזמים אחרים הוכחו לאגד PAMPs, ורבים מorthologs של PRRs שהם מרכזיים לתגובות חיסוניים באורגניזמים אחרים להראות תרומה מוגבלת באופן מפתיע לתגובות הפתוגן התולעת והתנגדות. לדוגמא, קולט דרוזופילה האגרה, שהוא חיוני להתנגדות פתוגנים גראם חיוביים, מיוצג בג elegans ידי homolog בלעדי, tol-1, אשר תורם להגנה מפני הפתוגן השלילי גרם סלמונלה 11 Typhimurium, אבל לא מגורמי מחלה אחרות שנבדקו גראם שליליות, או חיובית 11,12. תצפיות אלו, בשילוב עם נתונים המצביע על כך תגובה חיסונית יכול להיגרם על ידי שיבוש שעות תרגום חלבונים תאייםכהוביל כמה להציע כי ג elegans מזהה בעיקר damps 9,13,14. עם זאת, דיווחים המתארים את היכולת של פתוגנים מתים כדי לעורר תגובות חיסוניים מראים כי PAMP מחייב ניתן יש תפקיד חשוב בזיהוי הפתוגן בג elegans 15,16. עבודה קודמת מתמקדת בתגובות חיסונית בג הזהה מבחינה גנטית מסונכרן גיל elegans אוכלוסיות, הפגינו השתנות בודדת גדולה בקולוניזציה במעי על ידי פתוגן החיידקים גראם שלילי Pseudomonas aeruginosa. עם זאת, מחקרי פרופיל תעתיק טופלו אוכלוסיות variably-יישבו אלה כישות אחת 17,18. ניצול של השונות הזאת, פיתחנו פרוטוקול תוך התמקדות wormsorter אוטומטי להפריד אוכלוסיות יישבו באופן דיפרנציאלי של elegans Caenorhabditis נחשף לפ-GFP-לבטא aeruginosa. בדיקת ביטוי גנים באוכלוסיות שונה, יישבו faciהערכת litated של הקשר בין עומס הפתוגן (והנזק קשור) ואת התגובה חיסונית ותובנות חדשות הניתנות על הכרת הפתוגן בג elegans 19. להלן נתאר את הפרוטוקול, אשר יכול להיות מיושם כדי למיין תולעים נגועים בפתוגן כל שכותרתו fluorescently. למשתמשים פוטנציאליים יש לציין כי מספר התולעים נדרשו להיות מיינו תלוי באופי של הניתוחים שלאחר מכן ופרוטוקולים שבשימוש. לדוגמא, במקרה של ניתוח ביטוי גני microarray,&gt; 1,000 תולעים יידרשו להשיג מספיק RNA, אם פרוטוקולים סטנדרטיים משמשים, אבל ~ 100 תולעים יספיקו אם הגברה היא מועסקות, המאפשרים איסוף מהיר של חומר ובכך למזער את הלחץ על התולעים.

<table><tbody><tr><td>M9 Buffer</td><td>מוכן בבית</td><td></td><td>מתכון ב</td></tr><tr><td>wormbook.org Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת הכנת ביצים</td><td>שהוכנה בבית</td><td></td><td>50 מ"ל מים; 40 מ"ל אקונומיקה; 10 מ"ל של 10 N נתרן הידרוקסיד</td></tr><tr><td>צלחות NGM</td><td>שהוכנו בבית</td><td></td><td>מתכון ב wormbook.org</td></tr><tr><td>צלחות SKP</td><td>שהוכנו בבית</td><td></td><td>מתכון זהה ל- NGM רק 0.35% פפטון במקום 0.25%</td></tr> <tr><td>חלקיקי בדיקת בקרה</td><td>יוניון ביומטריקה</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Wormsorter הוא מכשיר דומה למכשיר FACS המשמש במחקרים של elegans Caenorhabditis, בדרך כלל כדי למיין תולעים המבוססים על ביטוי של כתב ניאון. כאן, אנו מדגישים את השימוש אלטרנטיבי של מכשיר זה, למיון תולעים על פי מידתם של קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא. שימוש חדש זה מאפשר לנו להתייחס למערכת היחסים בין קולוניזציה של מעי התולעת והאינדוקציה של תגובה חיסונית. בעוד ג תגובות חיסוניים elegans לפתוגנים שונים תועדו, זה עדיין לא ידוע מה יוזם אותם. שתי האפשרויות העיקריות (שאינן סותרים) הן הכרה הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, וזיהוי של נזק שנגרם על ידי זיהום. כדי להבדיל בין שתי האפשרויות, חשיפה לפתוגן חייבת להיות מנותקת מהנזק שהיא גורמת. ההפרדה אפשר wormsorter של תולעים ש- יישבו בהרחבה על ידי גראם nהפתוגן egative Pseudomonas aeruginosa, עם הניזק, אשר עלול להיגרם על ידי עומס הפתוגן, מתולעים שנחשפו באופן דומה, אבל לא, או שולי, קולוניאלי. אוכלוסיות מובחנות אלה שימשו כדי להעריך את הקשר בין עומס הפתוגן והאינדוקציה של תגובה חיסונית תעתיק. מהתוצאות עולה כי שני הם ניתקו, התומכים באפשרות של הכרת הפתוגן.

ג כאשר מתאימים בגיל, זהה מבחינה גנטית elegans נחשפים לפ aeruginosa, הפצה רחבה הוא ציין ברמות (איור 1 א) קולוניזציה. בעזרתו של הפרוטוקול המתואר כאן הפרדה יעילה של noncolonized מתולעים יישבו יכולה להיות מושגת (איור 1). שלא כמו תולעי noncolonized, תולעים יישבו להראות סימנים של נזק, כגון זחילה והפרשת צואה מופחתת 19. האחרון עשוי להיות סיבה לכך שתולעים יישבו על ידי פ יש לי aeruginosa קושי ניקוי זיה...

Wormsorter מאפשר מסכי גנטיים בelegans Caenorhabditis ידי מיון תולעים לפי ביטוי של כתבי ניאון. כאן, אנו מתארים את השימוש חדש: מיון על פי קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא, ואנו מעסיקים אותו כדי לבחון את התפקיד הבין היטב הכרת הפתוגן בייזום תגובה חיסונית.

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את התרומה של הקולוניזציה והנזק הנלווה לה להפעלת תגובות חיסון מולדות ב-sea elegance. זאת מושג על ידי חשיפה של אוכלוסייה מסונכרנת של תולעי sea elegance בוגרות וצעירות ל-pseudomonas arosa המבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP, דבר היוצר אוכלוסייה של תולעים שחלקן עברו קולוניזציה על ידי הפתוגן במידה משתנה. לאחר שטיפה, אוכלוסיות התולעים שעברו קולוניזציה באופן דיפרנציאלי מופרדות לאוכלוסיות טהורות, תוך התמקדות בשני הקצוות: תולעים שעברו קולוניזציה מלאה ותולעים שלא עברו קולוניזציה.בשלב הבא מופק RNA מאוכלוסיות אלו, וביטוי הגנים החיסוניים מוערך בהשוואה לתולעים שגודלו על e coli שאינו פתוגני. כדי לבחון את הקשר בין התגובה החיסונית לבין הקולוניזציה, התוצאות המתקבלות מראות כי ניתן להפריד בין התגובה החיסונית המולדת של sea elegance לבין קולוניזציה של p arosa. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני גישות אחרות ללימוד התחלת התגובה החיסונית ב-sea elegance הוא שהיא נותנת מענה לשונות בזיהומים באוכלוסיות תולעים, מה שמאפשר לנו להבחין בין היבטים שונים של תהליך הזיהום.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בחסינות מולדת של תולעי רקע, כגון מהו הבסיס להפעלת תגובות חיסוניות מולדות, וזאת באופן של תפוקה גבוהה. מהי ההשפעה של מניפולציות גנטיות או סביבתיות שונות על היכולת לעמוד בפ

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: טיילור, מ.נ., et.al. שימוש בנתוני תולעת בודדת כדי לכמת הטרוגניות באינטראקציות חיידקיות-חיידקיות Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את החשיפה של תולעי Caenorhabditis elegans נטולות חיידקים ותואמות גיל לזן חיידקים לצורך קולוניזציה של המעי. זה מסביר את ההסרה הסלקטיבית של חיידקים חיצוניים שאינם נדבקים, ומשאירים רק חיידקים ברי קיימא דבוקים לאפיתל המעי לצורך כימות.

הערכת קולוניזציה של חיידקי מעיים ב - C. elegans נטול חיידקים

מקור: פטרסן, ק. ואחרים, בידוד ואפיון המיקרוביום הטבעי של הנמטודה המודל Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של מיני חיידקים הקשורים ל-Caenorhabditis elegans. פירוק מבוסס חרוזים של C. elegans, ואחריו גידול סלקטיבי, מאפשר בידוד של זנים מיקרוביאליים מגוונים לניתוח נוסף.

בידוד וגידול חיידקים קשורים ל-Caenorhabditis elegans

מקור: צ'ן, י. ואחרים. הערכת אלימות ופתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)הסרטון הזה מדגים בדיקת הישרדות באמצעות C. elegans למידול פתוגנזה של Aeromonas , שבה בליעת חיידק דרך הפה מובילה לזיהום במעי ולמוות, ומאפשרת הערכה כמותית של אלימות חיידקית במערכת מארחת חיה.

מידול פתוגנזה של Aeromonas ב-C. elegans באמצעות מבחן הישרדות

מקור: לה, ט. א. נ., ואחרים, מדידת השפעות חיידקים וכימיקלים על חדירות המעיים של Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לכמת חדירות המעי ב-C. elegans שנחשפו ל-Pseudomonas aeruginosa. בהשוואה לביקורת שקיבלו Escherichia coli, תולעים שטופלו בפתוגן מראות דליפת פלואורופור מוגברת לחלל הגוף, מה שמעיד על נזק למחסום האפיתליאלי.

הערכת חדירות המעי ב-C. elegans לאחר חשיפה לחיידקים

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

למדו כיצד להפריד אוטומטית תולעי Caenorhabditis elegans לפי רמות התיישבות פתוגן באמצעות wormsorter. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים חיסוניים והבנת הקשר בין זיהוי פתוגן לתגובה חיסונית בתולעים.

הפרדה אוטומטית של

גלה סרטונים נוספים