הפרדה אוטומטית של ג elegans יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את תרומת הקולוניזציה והנזק הנלווה אליה להתחלת תגובות חיסוניות מולדות באלגנטיות ימית. זה מושג על ידי חשיפת אוכלוסייה מסונכרנת של אלגנטיות ים צעירה לפסאודומונס ארוזה המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP, המייצר אוכלוסייה של תולעים המתיישבות באופן משתנה על ידי הפתוגן. לאחר שטיפת הדיפרנציאלית, אוכלוסיות תולעים מושבות מופרדות לאוכלוסיות טהורות המתמקדות בשני הקצוות של תולעים שעברו קולוניזציה מלאה ולא מושבות.

לאחר מכן, RNA מופק מאוכלוסיות אלה וביטוי הגנים החיסוני מוערך בהשוואה לתולעים הגדלות על אי קולי לא פתוגני. על מנת לבחון את הקשר בין התגובה החיסונית לקולוניזציה, מתקבלות תוצאות המראות כי ניתן לנתק את התגובה החיסונית המולדת של אלגנטיות הים ל-p arosa מהתיישבות פתוגנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני גישות אחרות לחקר התחלת תגובה חיסונית באלגנטיות ים הוא שהיא מתייחסת לשונות בזיהום באוכלוסיות חמות, ומאפשרת לנו להפריד בין היבטים שונים של תהליך ההדבקה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באלגנטיות ים, חסינות מולדת כגון מהו הבסיס להתחלת תגובות חיסוניות מולדות ובאופן תפוקה גבוהה. מה ההשפעה של מניפולציות גנטיות או סביבתיות שונות על היכולת להתנגד להתיישבות פתוגנים? להתחיל לגדל תולעים על מספר נמטודות, מצע גידול או לוחות NGM שנזרעו בחיידקי אי קולי עד שתולעים רבות הגיעו לשלב הקבר.

לאחר מכן טפל בחיות קבר בתמיסת הכנת ביצים כדי לקבל תרבית מסונכרנת. הצלחת הבאה. הביצים על כמה צלחות של 60 מילימטר NGM זרועות בחיידקים בצפיפות של כ-150 עד 200 ביצים לצלחת.

יהיה צורך במינימום של 15 עד 20 צלחות כדי להשיג כמה אלפי תולעים. לצורך ניסוי המיון, על המשתמשים להגדיל את קנה המידה על ידי שימוש בצלחות בקוטר גדול יותר עם יותר ביצים לצלחת אם יש צורך במספר גדול יותר של תולעים. דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד שהתולעים מגיעות לשלב L ארבע או לשלב הבוגר הצעיר.

למחרת הכנת הביצים יש לחסן GFP המבטא תרבית POSA, PA 14 GFP, לשני מיליליטר של קינגס B.Medium המכיל אנטיביוטיקה. דגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה למשך הלילה. למחרת צלחת את תרבית PA 14 GFP על כמה צלחות הרג איטיות הדרושות לבדיקה על כל צלחת פטרי של 150 מילימטר.

פיפטה 75 עד 100 מיקרוליטר של תרבית רוויה ומתפשטת באופן שווה. בעזרת מפזר זכוכית סטרילי, דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 24 שעות. הסר את הצלחות עם PA 14 GFP מהחממה ואפשר להן להתקרר לטמפרטורת החדר.

בינתיים, כדי לאסוף את התולעים הגדלות על צלחות NGM, הוסף כמות קטנה של M nine buffer מספיק כדי לכסות את הצלחת. סובבו בעדינות את הצלחת והעבירו את הנוזל לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הניחו לתולעים להתיישב לתחתית והסירו עודפי נוזלים לפני העברת התולעים לצלחות PA 14 GFP בנפח מינימלי של נוזלים, בעת שימוש בצלחות של 150 מילימטר, ניתן להניח כמה מאות תולעים על צלחת אחת.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 21 שעות עבור תולעים בוגרות צעירות חשופות. זהו חלון הזמן המציג את ההתפלגות האופטימלית של בעלי חיים מושבים לעומת בעלי חיים שאינם מושבים לפני ביצוע מיון הדגימה לוודא שהמכונה פועלת כראוי. שלבים חיוניים מתוארים כאן וניתן לקבל פרטים באינטרנט.

הגדר את לחץ שסתום הנדן לכחמישה PSI כדי לוודא שקצב זרימת נוזל הנדן מתאים. הנח צינור חרוטי של 15 מיליליטר מתחת למתקן. הפעל את שסתום הנדן וכבה את שסתום המיון.

החזק את הצינור מתחת למתקן למשך 60 שניות. הנפח בצינור צריך להיות תשעה עד 10 מיליליטר. אם הוא נמצא מחוץ לטווח זה.

כוונן את לחץ שסתום הנדן בהתאם כדי להבטיח שקצב זרימת נוזל הנדן יאפשר מיון מדויק. בדוק את קצב המיון על ידי כיבוי תחילה של שסתום הנדן. לאחר מכן הוסף למאגר כ -25 מיליליטר של תמיסת חלקיקי בקרה.

הפעל את שסתום הנדן ואת שסתום הדגימה בתוכנת המחשב. נווט למצב חלקיקי הבקרה ולחץ על השג. ודא שקצב זרימת החלקיקים הוא כחמישה עד שמונה חלקיקים לשנייה כאשר זמן הטיסה מתקרב לרוחב החלקיק של 40 מיקרומטר.

זה יבטיח שרק אובייקט יחיד של 40 מיקרון יעבור בכל פעם. אם הערכים נמצאים מחוץ לטווח זה, התאם להגדרות בהתאם. שימוש במאגר M תשע שוטף תולעים לתוך צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר, מאפשר לתולעים בוגרות לשקוע לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה ולהסיר את הסופרנטנט.

מלאו את הצינור במאגר M nine טרי. חזור על תהליך זה שלוש עד ארבע פעמים. זה מסיר חלק גדול מהזחלים כמו גם עודפי חיידקים ולוקח כ -10 דקות.

הוסף תולעים למאגר מיון התולעים המכיל מוט ערבוב קטן בעדינות. כוונן את רווח האות הראשוני על ידי הגדרת צינור מכפיל הפוטו הירוק ל-600 ואת צינור מכפיל הפוטו האדום והצהוב ל-200. התחל להשיג נתונים כדי להתאים את ההגדרות.

כוון לקצב מיון של 25 עד 30 אירועים או תולעים בשנייה. אם קצב המספרים גבוה מדי, יש לדלל את התולעים במאגר ב-M תשע. חוצץ בהתאם.

אם הקצב נמוך מדי, הוסף עוד תולעים בנפח קטן של M 9. אם הניסוי דורש הפרדה קפדנית מאוד בין תולעים מושבות לעומת תולעים שאינן מושבות, הגדר את בדיקת צירוף המקרים לטהורה. זה מבטיח שאם שני חפצים מתרחשים קרוב מדי זה לזה או באותה טיפה, המכונה דוחה את הטיפה.

במקום לאסוף אותו כדי למיין את האוכלוסייה המעניינת, צייר שערים סביב הציר המציינים גודל ועוצמת הקרינה. יש לקבוע את הערכים לשער פלורסנט באופן אמפירי. לאחר מכן הניחו צלחת מרובת בארות או צלחת פטרי מתחת למתקן כדי לאסוף את התולעים.

לאחר מכן פתח את שסתום המיון כדי להתחיל למיין תולעים. אסוף אוכלוסייה קטנה של בעלי חיים כדי לוודא במיקרוסקופ שהאוכלוסייה הממוינה היא האוכלוסייה המעניינת. אם לא, התאם פרמטרי שער בהתאם והמשך באיסוף הדגימה.

כאשר הגיל תואם אלגנטיות ים זהה גנטית שנחשפה ל-GFP המבטא פוזה מביא לפיזור רחב ברמות הקולוניזציה, הפרדה יעילה של תולעים שאינן מושבות מתולעים מושבות הושגה באמצעות ממיין תולעים. בניגוד לתולעים שאינן מושבות, תולעים שעברו מושבות מראות סימנים גלויים של איטיות ומפחיתות את עשיית הצרכים. האחרון עשוי להיות סיבה לכך שתולעים שהתיישבו על ידי P arosa מתקשות לנקות זיהום.

ארבעה גנים הושרו באופן דומה לחשיפה ל-P arosa ללא קשר למצב הקולוניזציה של התולעים ונעשה שימוש ב-R-T-P-C-R כמותי למדידת ביטוי הגנים. ידוע כי ארבעת הגנים הם חלק מהתגובה החיסונית של CL egan. Lys 2 מקודד ליזוזים שני גנים לא מאופיינים, תגובה ספציפית לזיהום, שאחד מהם תורם גם לעמידות לזיהום, ו-PGP 5 מגיב לזיהום כמו גם ללחץ על מתכות כבדות.

התוצאות מאששות תוצאות שפורסמו בעבר המצביעות על כך שקולוניזציה והנזק הנלווה אליה אינם נדרשים לתגובה חיסונית. במקום זאת, הצביעו על דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן כנתוני האות המראים כי PGP 5 מושרה בבעלי חיים שאינם מושבים, אשר לא צפויים לחוות. נזק נרחב מצביע על חפיפה בתוכניות הרגולציה, שליטה בתגובות החיסון ותגובות לחץ כלליות באלגנטיות ימית.

שיטה זו יכולה לספק תובנות חדשות לגבי התחלת תגובות חיסוניות באלגנטיות ימית, אך ניתן ליישם אותה גם בשאלות אחרות כגון השפעות של תנאים סביבתיים או מניפולציה גנטית על קולוניזציה או תחרות בין פתוגנים שונים מלבד תהליכי זיהום. ניתן ליישם שיטה זו גם כדי לעקוב אחר אינטראקציות אחרות של תולעים עם סביבתן, כגון בליעה או קיבוע של מטבוליטים או כימיקלים. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש באוכלוסיות הממוינות המעניינות למגוון מטרות מעבר לביטוי גנים.

אלה כוללים איסוף בעלי חיים לבדיקות זיהום או הישרדות או ניסויים התנהגותיים. טכניקה זו מספקת אמצעי שימושי לחקר ההשפעות של חשיפה לפתוגנים וקולוניזציה על חסינות מולדת ואלגנטיות ים.