Name: חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: חקור נדידת תאים ספונטנית במערכת מיקרו-מובנית באמצעות ערוצי PDMS מצופים בפיברונקטין. השיטה מאפשרת ניתוח כמותי של מהירות תאי דנדריטיים ותגובתם לטיפולים תרופתיים שונים בסביבה מבוקרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים באופן משמעותי את פלטפורמת PICT IBiSA במכון קירי (CNRS UMR144). עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ: המועצה האירופית למחקר לAM.LD (Strapacemi 243,103), Nationale האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), קרן InnaBiosanté (Micemico) ל MP וPM. LD ומענק ERC חוקר הצעיר Strapacemi לAM.LD.

הערה חשובה: בפרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שהעובש המכיל את הצורה לmicrochannels הרצויה כבר כבר עשה. מידע נוסף על ההכנה של העובש כבר פורסם כבר 10. פרוטוקול זה גם בהנחה שתרבות DCs מח עצם ידועה. 1. ייצור שבבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שמן PDMS וסוכן ריפוי ב10:01 יחס משקל בכוס פלסטיק. מערבבים את שני התרכובות ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטיל את התערובת מעל microchannels נושאות העובש. הגובה הכולל חייב להיות בין 0.5-1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות אוויר בפעמון צנצנת ואקום בשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS הרדן בעובש על ידי הנחת האחרון בתנור במשך שעה 2 ב 65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע PDMS הוא בטמפרטורת חדר, לחתוך חתיכה סביב המבנה גדולה עם להב כירורגים ולקלף אותו מהתבנית (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים שבו תא יהיה מוזרק (בדרך כלל 2 מ&quot;מ) ולשנות את גודל PDMSעם להב כירורגים בהתאם לגודל לזכוכית תחתונה מנות שבהגירה תיבחן (איור 1). לפני שימשיך, להסיר אבק שנותר בצלחת באמצעות ניקוי עדשות נייר. זה מעדיף מחייב של PDMS לזכוכית מתוארת בשלב 1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שבב PDMS לשנות את הגודל המכיל את הערוצים על ידי דבק וקילוף נייר דבק בצידי המבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate חתיכות PDMS 30 שניות ב70% אתנול להסיר אבק וחלקיקי PDMS קטנים. ייבש אותם במהירות לאחר מכן על ידי נשיפת אוויר נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את PDMS (מבנים כלפי מעלה) ומנות תרבות בדרך אוויר (או חמצן) טיפול פלזמה במהלך 30 שניות ב300 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני משטחים מופעלים במגע להישאר באופן קבוע PDMS למצע. במידת הצורך, להשתמש במלקחיים מתכתיים ללחוץ מעט על החלק העליון של PDMS לכפות המגע בין הפולימר והזכוכית של הצלחת (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השבב בתנור ב 65 מעלות צלזיוס עבורr 1 שעות כדי לחזק את מחייב. </li></ol> 2. ציפוי של microchannels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל המבנה על ידי פלזמה אוויר ב300 mTorr דקות 1. זה יקדם את הכניסה של נוזל לערוצים בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו במהירות את חורי הכניסה של השבב עם פיברונקטין ב10 מיקרוגרם / מיליליטר במים. מצעים אחרים כגון PEG עשויים לשמש כדי לשנות היצמדות תא לקירות הערוץ. שים לב שהנוזל מתפשט בכל המבנה כולו. זה ניתן לבדוק בקלות על ידי העין תחת אור רגיל או באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל. הערה: במבנים קטנים מאוד, שבו דיפוזיה היא קשה יותר, כניסה של נוזל בערוצים ניתן לכפות על ידי הצבת המבנה בפעמון צנצנת ואקום בלפחות 15 דקות. כדי לוודא את היעילות של הציפוי ניתן להשתמש במצעי ניאון (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר לספיחה של פיברונקטין או כל subst ציפוי אחרשיעור לקירות של הערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המבנים 3x עם PBS להסיר את מצע nonbound. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, להמשיך לפרוטוקול 3 או לאחסן את השבב על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר (24 מקסימום שעה). </li></ol> 3. טעינה נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהצלחת ולמלא את microsystem עם מדיום סלולרי. בואו דגירה עבור שעה 1 כדי להרוות את הערוצים עם המדיום. הערה: לניסויים הכוללים תרופות כמו מעכבי מולקולה, מומלץ לpreincubate ערוצים עם מדיום המכיל את התרופה בריכוז הנכון. יתר על כן, תרופות מסוימות נוטות solubilize במבנה PDMS אשר מפחית את הריכוז היעיל. כמה פתרונות הוצעו כדי לנטרל נושא זה 11-12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DCs הצף ולשחזר תאים למחצה חסיד על ידי שטיפה עם מדיום לתרבות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. הערה: לקבלת הדמיה גרעין, מכתים Hoechst 33342 יכול להיות מושגת על ידי מראש בcubating 2 x 10 6 תאים במהלך 30 דקות עם הצבע ב200 / מיליליטר ng במדיום שלם. לשטוף פעמיים על ידי צנטריפוגה כדי להסיר את העודפים של צבע לפני שתמשיך את הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במהלך 5 דקות (זמן ומהירות יכולים להיות שונים בהתאם לסוג התא) וזורקים את המדיום. לדלל את גלולה להגיע לריכוז של 20 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את העודפים של מדיום מהצלחת ורוקן את חורי הכניסה במבנה PDMS באמצעות micropipette. מלא את הערכים עם 5 μl של פתרון תא להגיע לסכום של 1 x 10 5 תאים בכל חור כניסה. הערה: צפיפות תאים גבוהה נדרשת להעדיף את הקשר של התאים עם הערוצים. צפיפות תא נמוכה עלולה לגרום למספר הנמוך של תאים בתוך ערוצים וכישלון של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השבב ל30 דקות ב 37 ° C בחממה. הוסף 2 מיליליטר של מדיום שלם לצלחת הניסוי. הערה: מבנה PDMS כולה צריך bדואר מכוסה על מנת למנוע התייבשות של התאים במהלך הניסוי. אם 2 מיליליטר זה לא מספיק, להוסיף עוד מדיום כדי לכסות את מבנה PDMS לחלוטין. </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשטח התחתון החיצוני של המנות עם רקמת ניקוי עדשה לפני ששם את הצלחות מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את ההגירה במספר גדול של תאים, השתמש 10X ההגדלה ותאורה בשדה רחב בוידאו מיקרוסקופ מצויד CO 2 וטמפרטורה (איור 3). כדי להקל על מעקב תא, אור מכתים וUV Hoechst יכול לשמש (ראה שלב 3.2). הגירה יכולה להיות גם נותחה באמצעות מיקרוסקופיה confocal כדי לקבל רזולוציה גבוהה יותר של מבנים הסלולר במהלך נדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה זמן לשגות ב10X, בחר בתדירות זמן בהתאם למהירות התאים הצפויה (בדרך כלל 2 דקות לתאי דנדריטים נודדים עם מהירות של 5 מיקרומטר / min). הערה: הפרוטוקול המתואר כאן עושה not כולל ניתוח של הפרמטרים נדידת תאים. כמה נקודות מפורטות בדיון על מנת להודיע ​​לקוראים על איך להמשיך כדי לחלץ מידע מהזמן לשגות סרטים. </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מתארים מכשיר המורכב מmicrochannels כשיטה כדי ללמוד את מאפייני הנדידה של מספר הגדול של תאים בניסויים אחת. מערכת ניסיונית זה מחקה את הסביבה האילוצים מוגבלים נמצאים ברקמות על ידי תאים נודדים אנדוגני. עם זאת, על ידי אילוץ הגירה בממד אחד, זה מקל על מעקב תא אוטומטי והחילוץ של measurables (איור 5). כמו כן, אנו מראים כי המכשיר שלנו הוא בקנה אחד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכן ניתן להתאים ללמוד מיצוב אברון במהלך השלבים השונים של תנועתיות תא (איור 4)....

הגירה היא פונקצית הסלולר מורכבת שחשובה לתהליכים פיסיולוגיים רבים באורגניזמים רב תאיים, כוללים פיתוח, תגובות חיסוניים, והתחדשות רקמות. בנוסף, במצבים מסוימים פתולוגיים כגון פלישת גידול וגרורות להסתמך על תא תנועתיות 1. מסיבות אלה, נדידת תאים הפכה לשדה עיקרי של מחקר בהקשר של מחקר בסיסי והן translational. בvivo, רוב הרקמות מאופיינות במטריצה ​​תאית עשירה וצפיפות תאים גבוהה. נדידת תאים ולכן, בתנאים פיסיולוגיים, מתרחשת בסביבה מוגבלת מורכבת. קלסי, ככל הנראה בשל סיבות היסטוריות ומגבלות טכניות, נדידת תאים נחקרה במערכות 2D שטוחות שלא מתרבות רבים של מאפייני הסביבה שנמצאו ברקמות, כגון כליאה. יתר על כן, גורמים כמו הידבקות תא, שהם חיוניים לתנועתיות ב2D, כבר הראו לאחרונה לא להיות necessarily נדרש להגירה in vivo או בתוך ג&#39;לים, טוען כי המנגנונים השולטים תנועת תאים ב2D ובסביבות אחרות נבדלים 2. מספר מערכות פותחו כדי לחקות את התכונות מורכבות של רקמות, ג&#39;ל קולגן להיות המפורסם ביותר, אשר מכוונות למשחזר את המאפיינים של הרכב המטריצה ​​תאי 3. כאן אנו מציעים microchannels כשיטה משלימה פשוט, המאפשרת נדידת תאי מחקר בממד אחד תחת סביבה מוגבלת. במערכת זו תאים נודדים לאורך microchannels שלתוכו הם נכנסים באופן ספונטני. תאים נודדים ולאחר מכן לרכוש את הצורה של הערוצים, אימוץ גיאומטריה צינורי שסביר להניח שמחזקת את הקוטביות שלהם. התנועה ליניארית של התאים בערוצים מאפשרת מעקב תא אוטומטי והחילוץ של פרמטרים כמותיים מניסויים. מנקודת מבט הטכנית, מערכת זו היא קלה וגמישה. Coatinגרם של קירות הערוץ ניתן להשפיע, בגודל ובצורה של הערוצים יכולים להיות מותאם, ומספר גדול של תאים ניתן לנתח בניסויים אחת. מערכת זו ניתן לשנותם למעלה גם לבצע ניתוח מסך לטווח בינוני של מולקולות מעורבות בתנועתיות תא. הפרוטוקול המתואר כאן כבר טופל תוך שימוש בתאים דנדריטים (DC) כמודל סלולארי. תאים אלה הם מפתח למערכת החיסונית כפי שהוא להשתתף בייזום והאחזקה של תגובות חיסוניים ספציפיות 4. במבחנה, DCS הוכחו להעביר באופן ספונטני בסביבות מוגבלות ולכן הם מודל טוב ללמוד תנועתיות תא בmicrochannels 5,6 . חשוב מכך, מערכת זו ניתנת להארכה לניתוח הגירה של כל סוג תא אחר ניעתי כלימפוציטים מסוג T, נויטרופילים, או תאים סרטניים 7-9.

<table><tbody><tr><td>פולידימתילסילוקסן (PDMS)</td> <td>GE סיליקונים</td><td>RTV615</td><td>חבילה של 90% בסיס סיליקון ו-10% חומר ריפוי</td></tr><tr><td>חותך דגימות ליבה</td><td>Ted Pella Int.</td><td>האריס קוטר חד ליבה</td><td>2.5 מ"מ</td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית</td><td>WPI</td><td>פלואורודיש FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>ברנסון אולטרסאונד</td><td>ברנסון 200</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>האריק פלזמה</td><td>PDC 32 גרם</td><td>לדוגמאות קטנות (35 כלים). גרסה גדולה יותר זמינה גם</td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמת בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>פוליליזין מושתל PEG (Pll-g-PEG)</td> <td>Susos</td><td>PLL(20)-g [3.5]-PEG(5)</td><td></td></tr> <tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר נדידת תאים בערוצי microfabricated

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הלימוד של נדידת תאים תחת כליאה בממד אחד. היא מבוססת על השימוש בערוצי microfabricated, המטילים הפנוטיפ מקוטב לתאים על ידי אילוצים פיזיים. ברגע שערוצים פנימיים, יש תאים רק שתי אפשרויות: לנוע קדימה או אחורה. ההגירה פשוטה הזה שבו כיווניות מוגבלת מאפשרת מעקב האוטומטי של תאים והחילוץ של פרמטרים כמותיים כדי לתאר את תנועת תא. פרמטרים אלה כוללים תא מהירות, שינויי כיוון, והפסקות בזמן התנועה. Microchannels גם תואם את השימוש בסמני ניאון ולכן מתאימים ללמוד לוקליזציה של האברונים ומבנים תאיים במהלך נדידת תאים ברזולוציה גבוהה. לבסוף, את פני השטח של הערוצים יכולים להיות פונקציונליות עם מצעים שונים, המאפשרים שליטה על מאפייני ההדבקה של הערוצים או המחקר של haptotaxis. לסיכום, מערכת שעותפה תאר נועד לנתח את ההגירה של מספרים סלולריים גדולים בתנאים שבהם הן את הגיאומטריה והטבע ביוכימיים של הסביבה מבוקרות, להקל על הנורמליזציה ושחזור של ניסויים בלתי תלויים.

בכל ניסוי את פני השטח של PDMS הוא מצופה במולקולה המותאמת לאינטרס של המחקר. איור 2 ערוצי הופעות מצופים במולקולת ניאון, PLL-G-PEG, לפני ואחרי שטיפה (שלב 2.4). ניסוי כזה מאפשר שליטה על ההומוגניות של הציפוי בערוצים. לאחר טעינה סלולרי, מיקרוסקופ וידאו ניתן לבצע כדי לעקוב אחר נדידת תאים. איור 3 א מציג דוגמא של DC הנודד בmicrochannels בצפיפות מתאימה כדי לעקוב אחר התאים. שניהם, בניגוד של...

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להכין תעלות שיוצרו במיקרו-פבריקציה כדי לחקור נדידה תאית ספונטנית תחת הגבלה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת שבב poly polymethyl SUBOXANE או PDMS המכיל את התעלות. כשלב שני, התעלות מצופות בפיברונקטין או בתשתית ציפוי אחרת, המאפשרת את הפונקציונליזציה של המכשיר.לאחר מספר שטיפות, תאים דנדריטיים מוכנסים למיקרו-מערכת כדי לחקור נדידת תאים. התוצאות המתקבלות מראות הבדלים במהירות עבור סוגי תאים או טיפולים שונים, בהתבסס על מיקרוסקופיה וניתוח תמונות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקות נדידה קלאסיות, הוא העובדה שאנו בוחנים את הגאומטריה ואת ההגבלה המרחבית של התאים.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה בשל הדיוק הנדרש בכל שלב. כדי להתחיל, ערבבו שמן PDMS וחומר מעקש ביחס משקלי של 10 ל-1 בכוס ערבוב מפלסטיק; ערבבו את שני התרכובות ביסודיות ויצקו את התערובת על התבנית הנושאת מיקרו-ערוצים. הגובה הכולל חייב להיות בין 0.5 ל-1 סנטימטר.הסר בועות אוויר באמצעות פעמון ואקום למשך שעה אחת, ולאחר מכן הקשה את ה-PDMS בתבנית על ידי הנחתה בתנור למשך שעתיים בטמפרטורה של 65 °C. לאחר שה-PDMS התקרר לטמפרטורת החדר, חתוך חתיכה גדולה מסביב למבנה באמצעות להב כירורגי וקלף אותה מהתבנית. לאחר מכן, קדח חורים במקומות שבהם יוזרקו התאים, ולאחר מכן התאם את גודל ה-PDMS בעזרת להב כירורגי כך שיתאים לצלחות עם תחתית זכוכית שבהן תיבחן הנדידה. נקה.לאחר שינוי גודל שבב ה-PDMS המכיל את התעלות באמצעות הדבקה והסרה של סרט דביק מצדי המבנה, יש לבצע סוניקציה לחלקי ה-PDMS למשך 30 שניות ב-70% ethanol כדי להסיר אבק וחלקיקי PDMS קטנים לפני ההמשך. הסר שאריות אבק מהצלחת באמצעות נייר לניקוי עדשות.הפעילו את ה-PDMS ואת צלחות התרבית באמצעות טיפול בפלזמת אוויר למשך 30 שניות ב-300 Milit; במידת הצורך, הניחו את שני המשטחים המופעלים במגע כדי להדביק את ה-PDMS למצע באופן קבוע. השתמשו בפינצטה מתכתית כדי ללחוץ קלות על החלק העליון של ה-PDMS כדי לאכוף את המגע בין הפולימר לזכוכית של הצלחת. דגרו את השבב בתנור בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך שעה אחת.כדי לחזק את הקישור, הפעילו את המבנה כולו באמצעות פלזמה של אוויר בלחץ של 300 millitorr למשך דקה אחת. פעולה זו תקדם את כניסת הנוזל לתעלות בשלב הבא. לאחר מכן, מלאו במהירות את חורי הכניסה של השבב בפיברונקטין בריכוז של 10 micrograms per milliliter במים.ניתן להשתמש בתשתיות אחרות, כגון polyethylene glycol, כדי לשנות את היצמדות התאים לדפנות התעלה. יש לוודא שהנוזל מתפשט לאורך כל המבנה. ניתן לבדוק זאת בקלות בעין תחת תאורה רגילה, או באמצעות מיקרוסקופ brightfield רגיל.לאחר מכן, הדגרו את המבנה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ספיגה של הפיברונקטין או של כל מצע ציפוי אחר לדפנות התעלות. לבסוף, שטפו את המבנים כדי להסיר את המצע שאינו קשור על ידי הוצאת כל הנוזל מהתעלות ומהצלחת לפני ההשריה ב-phosphate buffered saline או PBS טרי למשך חמש דקות. הסירו את ה-PBS מהצלחת ומלאו את המיקרו-מערכת במצע גידול תאים.השאירו את הפלטה לדגירה למשך שעה אחת כדי להרווי את התעלות במצע לצורך איסוף תאים להדמיה. הסירו תאים דנדריטיים צפים והשיגו תאים בעלי היצמדות חלקית על ידי שטיפת הפלטה במצע תרבית. בצעו זאת לפני ספירת התאים.באמצעות המוסיטומטר (hemo cytometer), סבב את התאים בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות והסר את המצע. דלל את המשקע עד להשגת ריכוז של 20 מיליון תאים למיליליטר. הסר את עודפי המצע מהפלטה ורוקן את חורי הכניסה במבנה ה-PDMS.באמצעות מיקרופיפט. לאחר מכן, מלאו את הלוגים בחמישה µL של תמיסת תאים כדי להגיע לכמות של 1×10⁵ תאים בכל לוג. לאחר דגירה של המיקרוצ'יפ למשך 30 דקות ב-37 °C באינקובטור, הוסיפו 2 mL של מצע גידול מלא לצלוחית הניסוי לצורך הדמיה.ראשית, נקה את פני השטח החיצוניים של תחתית הצלחות באמצעות נייר ניקוי לעדשות לפני הנחת הצלחות תחת המיקרוסקופ. כדי לנתח נדידה במספר גדול של תאים, השתמש בהגדלה של 10x ובתאורה בשדה רחב במיקרוסקופ וידאו המצויד בבקרת טמפרטורה ו-CO2 כדי להקל על מעקב אחר התאים. ניתן להשתמש בצביעת Hirsch ובאור UV כפי שדן בפרוטוקול הטקסט עבור מיקרוסקופיית time lapse בהגדלה של 10x.בחרו תדירות זמן בהתאם למהירות התאים הצפויה. בדרך כלל מדובר בשתי דקות עבור תאי דנדריטיים הנודדים במהירות של five microns per minute. בכל ניסוי, פני השטח של ה-PDMS מצופים במולקולה המותאמת למטרת המחקר.באיור זה, התעלות מצופות במולקולה פלואורסצנטית. פוליליזין המחובר לפוליאתילן גליקול לפני ואחרי שטיפה. ניסוי כזה מאפשר בקרה של הומוגניות הציפוי בתעלות; לאחר טעינת תאים, ניתן לבצע מיקרוסקופיית וידאו כדי לעקוב אחר נדידת התאים.להלן דוגמה לתאי דנדריטים הנודדים במיקרו-תעלות בצפיפות המתאימה למעקב אחר התאים. לצורך זה ניתן להשתמש הן בניגודיות פאזה והן בצביעת Hersch. הטכניקה תואמת גם למיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה יותר, וניתן להשתמש בה למעקב אחר אברונים או מבנים תאיים, כפי שמוצג בדינמיקה של אקטין פולימריזד בתאי דנדריטים נודדים המבטאים life act GFP.כאן מוצגת דוגמה לכימות של ניידות תאים שנותחה בתאי דנדריטיים נודדים. הכוחות שנמדדו בתאי דנדריטיים מסוג בר (wild type) או תאים שטופלו ב-Y 27 632 dihydrochloride מראים כי התרופה היא מעכב מאופיין היטב של התכווצות תאים ונדידה, והיא שימשה כדי לאמת את יכולתו של המערכת לזהות שינויים במהירות. ניתן לנתח את ה-kog בהמשך כדי להוציא את המיקום והגודל של התאים כפונקציה של הזמן, מה שמאפשר לחקור פרמטרים שונים לתיאור נדידת תאים.מהירות הנדידה נמדדה על ידי דימוי של מיקום הגרעין באמצעות תוכנה שהוכנה במעבדה. לתאי דנדריטיים יש מהירות ממוצעת הקרובה ל-6 מיקרון לדקה. טיפול בתרופה מפחית באופן משמעותי את מהירותם.דוגמה זו מדגימה את עוצמתה של הטכניקה, המאפשרת כימות של מספר רב של תאים בניסויים בודדים, ואת יעילות המערכת בזיהוי הבדלים המושרים על ידי טיפולים תרופתיים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הטכניקה המוצגת כאן בשלוש שעות, אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוחה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנדידה ללמידה על תנועת תאים בסביבות מוגבלות ומבוקרות.

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מכשיר microfluidic מידור לחקר נדידת תאי גזע סרטני מתואר. פלטפורמה חדשנית זו יוצרת microenvironment סלולרי קיימא ומאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של תנועת תאים חייה. מאוד ניעתי תאים סרטניים מבודדים ללמוד מנגנונים מולקולריים של חדירה אגרסיבית, שעלולים לגרום לטיפולים יעילים יותר בעתיד.

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

מכשירים מיקרופלואידיים רבים פותחו לשימוש בחקר אלקטרוטקסיס. עם זאת, אף אחד מהשבבים הללו אינו מאפשר מחקר יעיל של השפעות השדה הכימי והחשמלי בו-זמנית (EF) על התאים. פיתחנו מכשיר מבוסס פולימתיל-מתאקרילט המציע EF דו-קיום מבוקר טוב יותר וגירוי כימי לשימוש במחקר אלקטרוטקסיס.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

פרוטוקול זה מפרט שיטה להתאמה אישית למדוד נדידת תאים בתגובת chemoattractants שעשוי לשמש גם כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של תרופה מתוך פולימר מטריקס.

תא להתאמה אישי עבור נדידת תאים מדידות

השליטה בשיפועים כימיים וחמצן חיונית לתרביות תאים. מאמר זה מדווח על מכשיר מיקרופלואידי-נוזלי פולידימתילסילוקסן-פוליקרבונט (PDMS-PC) המסוגל לייצר באופן אמין שילובים של שיפועים כימיים וחמצן למחקרי נדידת תאים, שניתן להשתמש בהם באופן מעשי במעבדות ביולוגיות ללא מכשור מתוחכם.

Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

פרוטוקול להערכה כמותית של נדידת תאים תלת מימדיים בתוך ולתוך הממשק של הידרוג'לים גרגירים מוצג כאן.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

חקור נדידת תאים ספונטנית במערכת מיקרו-מובנית באמצעות ערוצי PDMS מצופים בפיברונקטין. השיטה מאפשרת ניתוח כמותי של מהירות תאי דנדריטיים ותגובתם לטיפולים תרופתיים שונים בסביבה מבוקרת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

גלה סרטונים נוספים