Name: בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למדו מדידת פעילות ציטוטוקסית של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תאים. שיטה זו משתמשת בתאי מטרה אוטולוגיים ראשוניים ומספקת הערכה ישירה של פעילות ציטוליטית בחקר אימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד התיירות, המסחר והפיתוח הכלכלי של פלורידה.

1. הכנת תאי T CD8+ אפקטור
<ol>
	<li>הפשירו PBMCs אוטולוגיים משומרים בהקפאה (2-3 בקבוקונים של 50 x 106 תאים) על ידי העברת הקריוביאל מחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שטפו את התאים על ידי מילוי השפופרת ל-50 מ"ל עם RPMI מלא (4 מ"מ L-גלוטמין, ו-100 U/ml פניצילין וסטרפטומיצין, בתוספת 10% FBS). ספור PBMCs והשהה מחדש תאים בריכוז של 5 x 106/ml ב-RPMI מלא.</li>
	<li>הוסף פפטיד ספציפי (5 מיקרוגרם/מ"ל) ו-IL-2 (10 ננוגרם/מ"ל) ל-PBMCs.</li>
	<li>הגדר תרבית בצלחת באר עמוקה 96; זרע 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר.</li>
	<li>לאחר 3 ימי תרבית, החלף מחצית ממדיום תרבית התאים ב- RPMI שלם טרי.</li>
	<li>לאחר 6 ימי תרבית, אספו את כל ה-PBMCs עם פיפטה רב-ערוצית והעבירו תאים במאגר סטרילי.</li>
	<li>ספרו, שטפו והשעו מחדש PBMCs ב-5 x 107/ml במאגר ההפרדה המומלץ בצינורות תחתונים עגולים של 14 מ"ל. הוסף קוקטייל העשרת תאי CD8+ T אנושיים בתאים של 50 מיקרוליטר/מ"ל. מערבבים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים חלקיקים מגנטיים ב-150 מיקרוליטר / מ"ל ודוגרים למשך 5 דקות.</li>
	<li>הביאו את תרחיף התאים עד 7 מ"ל על ידי הוספת מאגר ההפרדה. המשך לבידוד אימונומגנטי של תא CD8+ T שלא נגע בו על ידי הכנסת הצינור למגנט. לאחר 5 דקות, כשהצינור עדיין במגנט, שפכו את התאים המעניינים לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. קח מנה קטנה וצבוע את התאים בנוגדנים נגד CD3 ו-CD8 ב-1X PBS-2% FBS למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן למדוד את הטוהר של תאי CD8+ T באמצעות ציטומטריית זרימה עם טוהר צפוי של 95% ומעלה.</li>
	<li>השעו מחדש תאי CD8+ T ב-450 מיקרוליטר עם RPMI מלא.</li>
	<li>הוסף 225 מיקרוליטר של RPMI שלם ל-5 צינורות מכסה בורג.</li>
	<li>הכן דילולים סדרתיים (מ-1:2 עד 1:32) על ידי העברת 225 מיקרוליטר של CD8+ לצינור הבא (ראה איור 1 פאנל עליון).</li>
</ol>
2. הכנת תאי CD4+ T מטרה
<ol>
	<li>הפשירו PBMCs אוטולוגיים משומרים בהקפאה (בקבוקון אחד של 50 x 106 תאים) על ידי העברת הקריוביאל מחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל RPMI.</li>
	<li>שטפו תאים והשעו PBMCs ב-5 x 107/ml עם מאגר הפרדה בצינורות תחתונים עגולים של 14 מ"ל. הוסף קוקטייל העשרת תאי CD4+ T אנושי בתאים של 50 מיקרוליטר/מ"ל. מערבבים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוסף חלקיקים מגנטיים ב-100 מיקרוליטר/מ"ל ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הביאו את תרחיף התאים עד 7 מ"ל על ידי הוספת מאגר הפרדה. המשך לבידוד של תאי CD4+ T על ידי הכנסת הצינור למגנט. לאחר 5 דקות, כשהצינור עדיין בתוך המגנט, שפכו את התאים הרצויים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. קח מנה קטנה וצבוע את התאים בנוגדנים נגד CD3 ו-CD4 ב-1x PBS-2% FBS למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן למדוד את הטוהר של תאי CD4+ T באמצעות ציטומטריית זרימה עם טוהר צפוי של 95% ומעלה.</li>
	<li>ספרו תאי CD4+ T, פצלו אותם לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ושטפו ב-PBS חם 1x.</li>
	<li>הכן תמיסת עבודה בגובה CFSE של 0.4 מיקרומטר ב-PBS חם.</li>
	<li>הכן פתרון עבודה נמוך CFSE של 0.04 מיקרומטר על ידי דילול חלק מתמיסת העבודה הגבוהה CFSE פי 10 ב-PBS חם.</li>
	<li>השעו מחדש תאים ב-20 x 106/ml של PBS (אם מספר תאי CD4+ T קטן מ-10 x 10,6/ml השעו מחדש תאים ב-0.5 מ"ל של PBS) וצבעו מחצית מתאי CD4+ T על ידי הוספת נפח שווה אחד של תמיסת עבודה גבוהה CFSE של 0.4 מיקרומטר (ריכוז סופי 0.2 מיקרומטר). לדוגמא, עבור 1 מ"ל תאים, הוסף 1 מ"ל מתמיסת העבודה CFSE. צבעו את המחצית הנותרת של ה-CD4+ על ידי הוספת נפח שווה אחד של 0.04 μM תמיסת עבודה נמוכה CFSE (ריכוז סופי 0.02 מיקרומטר). תאי כתמים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, תאי גלולה ב-1,500 סל"ד למשך 5 דקות והשעיה מחדש ב-1 מ"ל של RPMI מלא חם כדי להרוות את תגובת התיוג.</li>
	<li>דופק תאי CD4+ T נמוכים ב-CFSE על ידי הוספת הפפטיד המעניין בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-RPMI השלם ודגירה למשך 45 דקות באטמוספירה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שטפו תאי CD4+ T גבוהים ו-CFSE נמוכים ב-RPMI מלא. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות. השעו מחדש בריכוז של 2 x 105 תאים/מ"ל כל אחד ב-RPMI מלא.</li>
	<li>ערבבו את שתי אוכלוסיות היעד ביחס של 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (ראו איור 1 בפאנל התחתון).</li>
</ol>
3. קוקולטורה
<ol>
	<li>מכל דילול של תאי CD8+ T, זרע 100 מיקרוליטר בשכפול לצלחת 96 בארות תחתונה עגולה.</li>
	<li>הוסף את תאי המטרה המעורבים CD4+ T (100 מיקרוליטר) לכל דילול של תאי אפקטור לנפח סופי של 200 מיקרוליטר.</li>
	<li>כדי למדוד את האפופטוזיס הבסיסי, זרע 3 בארות עם תאי מטרה בלבד.</li>
	<li>דגירה של קוקולטורה למשך 6 שעות באטמוספירה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>
4. צביעה ורכישה של ציטומטריית זרימה
<ol>
	<li>העבירו תאים לצלחת 96 בארות עם תחתית V וצבעו עם טטרמרים pMHC מצומדים PE למשך 15 דקות באטמוספירה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שטפו ב-1x PBS-2% FBS ותאי כתמים עם תא מת הניתן לתיקון Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.</li>
	<li>שטפו תאים פעם אחת עם 1x PBS-2% FBS והשעו מחדש ב-100 מיקרוליטר עם 2% פורמלדהיד ב-1x PBS.</li>
	<li>לרכוש תאים על ציטומטר זרימה.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הבדיקה המתוארת כאן מאפשרת לכמת את הפונקציה העיקרית של תאי CD8+ T: הפעילות הציטוליטית. למדידה המדויקת של פונקציה זו יש חשיבות עליונה בעת אפיון פונקציות האפקטור של תאי CD8+ T, שכן מחקרים קודמים דיווחו על חוסר התאמה בין פונקציה זו לבין הפרשת הציטוקינים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן10,11. בשל זמן הדגירה הקצר של קוקולטורה (6 שעות) והשימוש בתאי מטרה אוטולוגיים, יש שיעור נמוך של הרג לא ספציפי של תאי מטרה. לכן בדיקה זו היא ספציפית ואמינה ביותר. ניתן גם לשנות את הבדיקה הזו בקלות כדי לנתח תת-קבוצות תאים שונות. ניתן להח...

פעילות ציטוליטית היא הפונקציה העיקרית של תאי CD8+ T אך עדיין נמדדת לעתים רחוקות מכיוון שבדיקות המשמשות למטרה זו מסורבלות וקשה לתקן. למדידה מדויקת של פונקציה זו יש חשיבות עליונה בעת אפיון פונקציות אפקטור של תאי CD8+ T, מכיוון שעדיין לא תוארו מנבאים אמינים של ציטוטוקסיות יעילה בתיווך תאים1,2. כאן, אנו מציעים בדיקה פונקציונלית חדשה למדידת הפעילות הציטוטוקסית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתאי CD4+ T מטרה. פותחו מספר גישות כדי לספק חלופות לתקן הזהב, בדיקת שחרור כרום. אנו מציגים כאן בדיקה מבוססת תאים החושפת את כל תהליך ההרג כאשר היא מודדת את מותם של תאי מטרה חיים. שיטה זו נגזרה מפרוטוקולים של בדיקות ציטוטוקסיות מבוססות זרימה ציטומטרית in vivo בעכברים4,5 ובמבחנה בבני אדם6. בפרוטוקול זה, תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הכלולים באוכלוסיית תאי CD8+ T הכוללת משמשים כתאי אפקטור ותאי CD4+ T אוטולוגיים משמשים כתאי מטרה. תאי אפקטור CD8+ T מעניינים נספרים באמצעות טטרמרים MHCI/פפטיד7. מוות של תאי מטרה מחושב על ידי היחס בין תאי CD4+ T טעונים/לא טעונים בפפטיד. הראינו בעבר ששיטה זו הייתה ניתנת לשחזור, רגישה, ספציפית ולא הייתה תלויה במספר תאי האפקטור בתוך אוכלוסיית תאי CD8+ T הכוללת8. על ידי ספירת מספר תאי האפקטור ותאי המטרה בבדיקת הקוקולטורה, ניתן לחשב ולבטא את היכולת הפנימית של תאי CD8+ T להרוג תאי מטרה ביחידות ליטיות9.

<table><tbody><tr><td>ערכת העשרת תאי EasySep אנושיים CD4+ T</td><td>תאי גזע תאי גזע</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD8+ T ערכת העשרת תאי</td><td>גזע</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים CellTrace CFSE - לזרימה ציטומטריה</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>אדום רחוק חי / מת תא מת לתיקון</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 עכבר אנטי אנושי CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>מבריק סגול 650 אנטי אנושי CD4 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP אנטי אנושי CD8 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין 100x תמיסת</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי - זהב, PAA מושבת בחום</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות; מטופלים; תחתית U; עם מכסה</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פוליסטירן סטרילי, מאגרים עטופים בנפרד</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות U-bottom, סטריליות 2 מ"ל צלחות באר עמוקות</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), דרגת מחקר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, מאגר הפרדה</td><td>תאי</td> <td>גזע20104</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>BD פלקון</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל צינור תחתון עגול, פוליפרופילן</td><td>BD פלקון</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>תא גזע מגנט מגנט גדול</td><td></td><td>קל 18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-well; צלחת תחתונה V עם מכסה</td><td>פישר</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד, מגיב ACS, 37 wt % ב-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור מכסה בורג, חרוטי</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

פעילות ציטוליטית של תאי CD8+ T מוערכת לעתים רחוקות. אנו מתארים כאן בדיקה חדשה מבוססת תאים למדידת היכולת של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן להרוג תאי CD4+ T טעונים בפפטיד הקוגנטי שלהם. תאי יעד CD4+ T מחולקים לשתי אוכלוסיות, המסומנות בשני ריכוזים שונים של CFSE. אוכלוסייה אחת פועמת עם הפפטיד המעניין (CFSE-low) ואילו השנייה נשארת לא פועמת (CFSE-high). תאי CD4+ T פועמים ולא פועמים מעורבבים ביחס שווה ומודגרים עם מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T מטוהרים. ההרג הספציפי של תאי CD4+ T יעד אוטולוגיים מנותח על ידי ציטומטריית זרימה לאחר קוקולטורציה עם תאי CD8+ T המכילים את תאי CD8+ T הספציפיים לאנטיגן שזוהו על ידי צביעת פפטיד/MHCI טטרמר. הליזה הספציפית של תאי CD4+ T מטרה הנמדדת ביחסי אפקטור שונים לעומת מטרה, מאפשרת חישוב של יחידות ליטיות, LU30/106 תאים. בדיקה פשוטה וישירה זו מאפשרת מדידה מדויקת של היכולת הפנימית של תאי CD8+ T להרוג תאי CD4+ T מטרה.

הסכמה ב-איור 1 מסכמת את הבדיקה. תאי CD8+ T מטוהרים (תאי אפקטור) הושעו מחדש ב-450 µl של RPMI מלא, וביצעו דילולים סדרתיים על ידי הוספת 225 µl של תאי CD8+ T לשפופרת הבאה המכילה 225 µl של מדיום (פאנל עליון). תאי CD4+ T מטוהרים (תאי מטרה) נספרו, פולחו לשתי שפופרות ונצבעו בשני ריכוזים שונים של CFSE (גבוה ונמוך) כפי שמתואר בפרוטוקול. תאי CFSE-low CD4+ T עברו פולסציה עם הפפטיד הרלוונטי, ותאי CFSE-high CD4+ T נותרו ללא טעינה כביקורת. תאי CFSE-high ו-CSFE-low CD4+ T הושעו מחדש בריכוז של 2 x 105/ml ועורב...

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ציטוטוקסיות רגישה מבוססת תאים. על ידי ספירת הירידה בתדירות של תאי CD4+ T מטרה חיים בנוכחות מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T אפקטיביים, בדיקה זו מאפשרת הערכה ישירה של הפעילות הציטוליטית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את הפעילות הציטוטוקסית של תאי T CD8 ספציפיים לאנטיגן באמצעות בדיקת פלוו-ציטומטריה מבוססת תאים. זאת מושג ראשית על ידי הרחבת תאי T CD8 אפקטורים למשך שישה ימים בנוכחות הפפטיד הרלוונטי, ובשלב השני תאי T CD4 מטרה נחשפים לפפטיד הרלוונטי ולאחר מכן מומסחים עם תאי T CD4 שאינם חשופים לפפטיד. לאחר מכן, תאי T CD8 אפקטורים ותאי T CD4 מטרה מתורגבים יחד למשך שש שעות ביחסי אפקטור-מטרה שונים.בשלב הסופי, ההריגה של תאי CD4 מטרה הטעונים פפטיד ומספר תאי CD8 אפקטורים נמדדים באמצעות פלוו Cytometry. לבסוף, ניתן לחשב את יכולת ההריגה האינסטרינזית של תאי CD8 ספציפיים לאנטיגן, המבוטאת ביחידות ליטיות. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו, בדומה לבדיקת שחרור חלקיקי חמצן, הם שהיא משתמשת בתאי מטרה ראשוניים אוטולוגיים במקום בקווי תאים עלמתוח ובתוך תאי המטרה המקוריים.בנוסף, ניתן לכמת את מספר תאי האפקטור ברמת התא הבודד. כעת, עוזר מחקר במעבדתי ידגים את הפרוצדורה לבידוד תאי אפקטור CD8 חיוביים. התחילו בהפשרת PBMC אוטולוגיים שהוקפאו בבנייה של מים בטמפרטורה של 37 °C, ולאחר מכן שטפו את התאים בעד 50 mL של מצע גידול מלא.לאחר הספירה, דללו את ה-pbmc בריכוז של 5 מיליון תאים למילליטר במצע מלא, ולאחר מכן הוסיפו לתרבית IL-2 ואת הפפטיד הרלוונטי. בשלב הבא, זרעו מיליליטר אחד של תרחיף התאים לכל באר בפלטה בעלת 96 בארות. לאחר שלושה ימי תרבית, החליפו חצי מהעלות (supernatant) במצע מלא טרי. לאחר שישה ימי תרבית, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את התאים למאגר סטרילי, ולאחר מכן ספרו ושטפו את התאים.ששעו שוב את המשקע בריכוז של 50 מיליון תאים למילליליטר בבופר הפרדה, והדגירו את ה-pbmc בתוך מבחנה בעלת תחתית עגולה בנפח 14 מיליליטר עם תערובת העשרה לתאי T חיוביים ל-CD8 אנושי בריכוז של 50 µL למילליליטר תאים, בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, הדגירו את התאים עם חלקיקים מגנטיים מצומדים ל-anti CD8 IgG בריכוז של 150 µL למילליליטר למשך חמש דקות נוספות, ולאחר מכן השלימו את נפח ת сусפנזיית התאים לשבעה מיליליטר באמצעות בופר הפרדה נוסף. הכניסו את המבחנה למגנט הפרדה. לאחר חמש דקות, כאשר המבחנה עדיין במגנט, שפכו את התאים למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, צבעו מנה קטנה של התאים עם נוגדנים נגד CD3 ו-CD8 ב-PBS תוסף 2% FBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.יש לוודא באמצעות פלוו ציטומטריה (flow cytometry) כי טוהר התאים הוא 95% CD8 positive או גבוה יותר. כעת, הוסיפו 225 microliters של מצע גידול מלא לחמישה מבחנות עם פקק הברגה, ולאחר מכן בצעו דילול סדרתי של התאים מהיחס 1:2 ועד 1:32. כדי לבודד את תאי המטרה CD4 positive, התחילו בהפשרת pbmc אוטולוגיים שהקפאו בבמבחנת מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius.העבירו את התאים שהופשרו למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטרים של מצע. בצעו העשרה של תאי T המבטאים CD4 באמצעות הפרדה של חלקיקים מגנטיים כפי שהודגם זה עתה, תוך אישור של רמת טוהר של 95% ומעלה של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות ציטומטריה של זרימה. לאחר ספירת התאים, חלקו אותם לשתי מבחנות קוניות של 15 מיליליטר ולאחר מכן רחצו אותם ב-PBS חם; השעיקו את המשקעים ב-PBS בריכוז של 20 מיליון תאים למילליטר.לאחר שווידאתם שהתאים מוגנים מאור, צבעו מחצית מה-T cells שחיוביים ל-CD4 בתמיסת עבודה טרייה של CFSE בריכוז גבוה, עד לריכוז סופי של 0.2 millimolar, ואת המחצית השנייה בתמיסת עבודה טרייה של CFSE בריכוז נמוך, עד לריכוז סופי של 0.04 millimolar, למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%CO2. בסיום תקופת הצביעה, סבבו את התאים במערך צנטריפוגה ושספנדו את המשקעים במיליליטר אחד של מצע מלא וחם כדי לעצור את תגובת הסימון. חלפו את ה-T cells שחיוביים ל-CD4 שסומנו ב-CFSE בריכוז נמוך עם ריכוז סופי של five micrograms per milliliter של הפפטיד הרצוי במצע מלא למשך 45 דקות באינקובטור לתרבית תאים.לאחר הדגירה, שטוף את אוכלוסיות תאי ה-T בעלות הרמות הגבוהות והנמוכות של CFSE. השהה את שתי תרחיפי התאים במצע חסר פעמיים עד לריכוז של 200,000 תאים למילליטר בכל מצע חסר, ולאחר מכן ערבב את שתי אוכלוסיות המטרה ביחס של אחד ለአחד בין CFSE גבוה ל-CFSE נמוך.כעת הוסיפו 100 µL של תאי T מעורבבים חיוביים ל-CD4 לכל באר בלוח 96 באערים בעל תחתית עגולה, ולאחר מכן זרעו 1 µL של כל סספנסיות תאי T חיוביים ל-CD8 בשכפול, לנפח סופי של 200 µL לבער. למדידת האפופטוזיס הבסיסי, זרעו שלוש באערים עם תאי מטרה בלבד, ולאחר מכן הדגרירו את התרבית המשולבת למשך שש שעות באינקובטור לתרביות תאים. עם סיום ההדגירה, העבירו את התאים ללוח VBO עם 96 באערים וצבעו כל באר באמצעות MHC Tetramers פפטידיים המשולבים עם PE למשך 15 דקות.בתוך אינקובטור תרביות התאים, שטפו את התאים ב-PBS המכיל 2% FBS ולאחר מכן צבעו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, בהגנה מאור, לאחר שטיפת התאים. שספפו שוב את המשקעים ב-100 microliters של 2% formaldehyde ב-PBS ובדקו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר השקיפה (co-culture), התאים נותחו וסווגו (gated) כפי שמוצג בגרפים של נקודות (dot plots) אלו.היחס בין תאי מטרה חיים עם רמת CFSE גבוהה לבין תאים עם רמת CFSE נמוכה, ללא עיגור פפטיד או עם עיגור פפטיד, מנותח באמצעות שער (gate) קטן של פיזור קדמי לצד פיזור צדי (forward by side scatter). תאים חיים מסומנים על בסיס שליליות לצבעי חי/מת (live dead negative) ותאי T חיוביים ל-CD4 מוצגים על פני CFSE כדי לנתח את היחס בין תאים עם CFSE נמוך לתאים עם CFSE גבוה. לאחר מכן, נוצר שער פיזור קדמי לצד פיזור צדי גדול יותר כדי לספור את המספר הכולל של תאי אפקטור ותאי מטרה, חיים או מתים. לאחר דגירה של שש שעות, תאי T חיוביים ל-CD8 וחיוביים לטטראמר, ותאי T חיוביים ל-CD4 עם CFSE נמוך, מוצגים בניתוח כדי לבחון את היחס בין תאי אפקטור לתאי מטרה.מספרם הכולל של תאי T אפקטורים CD8+ נקבע לאחר הגדרה (gating) של תאים CD8+ חיוביים לטטרמר. מספרם הכולל של תאי המטרה נקבע על ידי הגדרה של תאי T מסוג CD4+, בעלי ביטוי נמוך של CFSE, ותאים חיים ומתים (live dead) חיוביים ושליליים. יחס המטרה של תאי CFSE low לעומת תאי CFSE high הוא 1:1.כאשר תאי המטרה החיוביים ל-CD4 תורגשים בהיעדרה של תאי אפקטור, יחס זה יורד באופן דרסטי. כאשר תאים בעלי דופק CFSE נמוך מדגירים יחד עם אוכלוסיית תאי T חיוביים ל-CD8 הכוללת תאי T אפקטורים חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן.ככל שהיחס פוחת, תאי מטרה מסוג CD4 חיוביים שעברו פעימה של פפטיד ובעלי רמת CFSE נמוכה מתחילים להפוך לחיוביים לצבעי חי-מת. דילול של תאי האפקטור גורם לפיכך לשחזור של יחס ה-CFSE, ובסופו של דבר לשחזור של מספרם של תאי T מטרה בני חיים מסוג CD4 חיוביים, בעלי רמת CFSE נמוכה, שעברו פעימה של פפטיד. ניתן להצג את אחוז הליזיס הספציפי כפונקציה של יחס האפקטור למטרה בסולם לוגריתמי. כפי שמוצג בגרף, מחושב רגרסיה ליניארית מהתרשים, ומשוואת קו המגמה משמשת לחישוב היחידות הליטיות.זהו מספר תאי T אפקטורים חיוביים ל-CD8 הנדרשים כדי להרוג 30% ממיליון תאי T חיוביים ל-CD4 מטרה, זאת כדי לקבוע את היכולת הציטוליטית האינהרנטית של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים לאנטיגן, ולהשוות את התוצאות בין תורמים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש בציטומטריה כדי למדוד את הפעילות הציטוטוקסית של תאי T ספציפיים לאנטיגן. ניתן להתאים טכניקה זו בקלות גם לסוג תאי T משלכם.

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מבחן ציטומטריית זרימה מבוסס תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה למדידת היכולת ציטוטוקסית של תאי רוצח המושרה על ידי ציטוקינים (CIK) כנגד תאים סרטניים. לאחר תרבית משותפת של תאי סרטן מטרה עם תאי CIK, תאי הסרטן המתים מזוהים באמצעות צבע כדאיות פלואורסצנטי ומכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה, האומדת את ההשפעה ציטוטוקסית של תאי CIK.

בדיקת מבחנה לחקר היכולת ציטוטוקסית של תאי הרג הנגרמים על ידי ציטוקינים

סרטון זה מדגים את הפעילות הליטית של תאי הרג טבעיים כנגד תאי מטרה מוכתמים פלואורסצנטית. השיטה מאפשרת מדידת ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תאי NK על ידי צביעת תאים מתים ושימוש בציטומטר זרימה לכימות תאי מטרה חיים ומתים.

בדיקת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים הכנת דגימה לניתוח ציטומטרי זרימה

סרטון זה מציג בדיקת אפופטוזיס בתאי סרטן המושרה על ידי תאי T משפיעים שהופעלו מראש. על ידי תרבית משותפת של תאים אלה עם תאים סרטניים המסומנים בגרעינים פלואורסצנטיים, מתווסף מצע פלואורוגני הניתן לשבירה קספאזית. תאי סרטן אפופטוטיים יציגו צבע שונה בגרעין שלהם, מה שיוביל לפלואורסצנטיות כפולה. פלואורסצנטיות כפולה זו מעידה על תאים סרטניים העוברים אפופטוזיס.

בדיקת מבחנה לחקר ציטוטוקסיות של תאי T CD8+ מופעלים מראש נגד תאים סרטניים

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Assay כל cytotoxicity הדם (אש"ל) הוא assay cytotoxicity שפותח על ידי שילוב טכנולוגיית מיקום תא תפוקה גבוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ועיבוד תמונה אוטומטי. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן לנתח תאי הלימפומה שטופלו בנוגדן anti-CD20 בזמן אמת בכל דם אדם כדי לספק ניתוח cytotoxicity סלולארי כמותי.

בזמן אמת Cytotoxicity מבחני בדם כל אדם

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

עבודה זו מתארת זרימת עבודה מתקדמת לקביעה מדויקת ומהירה של ספירת תאי NK (רוצח טבעי) וציטוטוקסיות של תאי NK בדגימות דם אנושיות.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת טיפות תחליב כפולות המכילות תא T אחד ותא מטרה סרטני כדי לבחון הרג תאים ברמת התא הבודד. שיטה זו מאפשרת כימות כפול הן של מולקולות ציטוטוקסיות והן של אפופטוזיס של תאי מטרה בתוך אוכלוסייה גדולה של תאי T.

בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת טיפות להערכת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ברמת התא הבודד

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מאוזן במבחנה למדידה עקבית של ציטוטוקסיות טבעית, מתווכת קולטני אנטיגן כימריים ותלויה בנוגדנים של תאי רוצח טבעיים אנושיים, באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה.

כימות ציטוטוקסיות של תאי NK המועצמת על ידי קולטני אנטיגן כימריים ונוגדנים טיפוליים באמצעות הדמיית תאים חיים וציטומטריית זרימה

למדו מדידת פעילות ציטוטוקסית של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תאים. שיטה זו משתמשת בתאי מטרה אוטולוגיים ראשוניים ומספקת הערכה ישירה של פעילות ציטוליטית בחקר אימונולוגיה.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

גלה סרטונים נוספים