בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את הפעילות הציטוטוקסית של תאי T CD8 ספציפיים לאנטיגן באמצעות בדיקת פלוו-ציטומטריה מבוססת תאים. זאת מושג ראשית על ידי הרחבת תאי T CD8 אפקטורים למשך שישה ימים בנוכחות הפפטיד הרלוונטי, ובשלב השני תאי T CD4 מטרה נחשפים לפפטיד הרלוונטי ולאחר מכן מומסחים עם תאי T CD4 שאינם חשופים לפפטיד. לאחר מכן, תאי T CD8 אפקטורים ותאי T CD4 מטרה מתורגבים יחד למשך שש שעות ביחסי אפקטור-מטרה שונים.

בשלב הסופי, ההריגה של תאי CD4 מטרה הטעונים פפטיד ומספר תאי CD8 אפקטורים נמדדים באמצעות פלוו Cytometry. לבסוף, ניתן לחשב את יכולת ההריגה האינסטרינזית של תאי CD8 ספציפיים לאנטיגן, המבוטאת ביחידות ליטיות. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו, בדומה לבדיקת שחרור חלקיקי חמצן, הם שהיא משתמשת בתאי מטרה ראשוניים אוטולוגיים במקום בקווי תאים עלמתוח ובתוך תאי המטרה המקוריים.

בנוסף, ניתן לכמת את מספר תאי האפקטור ברמת התא הבודד. כעת, עוזר מחקר במעבדתי ידגים את הפרוצדורה לבידוד תאי אפקטור CD8 חיוביים. התחילו בהפשרת PBMC אוטולוגיים שהוקפאו בבנייה של מים בטמפרטורה של 37 °C, ולאחר מכן שטפו את התאים בעד 50 mL של מצע גידול מלא.

לאחר הספירה, דללו את ה-pbmc בריכוז של 5 מיליון תאים למילליטר במצע מלא, ולאחר מכן הוסיפו לתרבית IL-2 ואת הפפטיד הרלוונטי. בשלב הבא, זרעו מיליליטר אחד של תרחיף התאים לכל באר בפלטה בעלת 96 בארות. לאחר שלושה ימי תרבית, החליפו חצי מהעלות (supernatant) במצע מלא טרי. לאחר שישה ימי תרבית, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר את התאים למאגר סטרילי, ולאחר מכן ספרו ושטפו את התאים.

ששעו שוב את המשקע בריכוז של 50 מיליון תאים למילליליטר בבופר הפרדה, והדגירו את ה-pbmc בתוך מבחנה בעלת תחתית עגולה בנפח 14 מיליליטר עם תערובת העשרה לתאי T חיוביים ל-CD8 אנושי בריכוז של 50 µL למילליליטר תאים, בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, הדגירו את התאים עם חלקיקים מגנטיים מצומדים ל-anti CD8 IgG בריכוז של 150 µL למילליליטר למשך חמש דקות נוספות, ולאחר מכן השלימו את נפח ת сусפנזיית התאים לשבעה מיליליטר באמצעות בופר הפרדה נוסף. הכניסו את המבחנה למגנט הפרדה. לאחר חמש דקות, כאשר המבחנה עדיין במגנט, שפכו את התאים למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר. לאחר מכן, צבעו מנה קטנה של התאים עם נוגדנים נגד CD3 ו-CD8 ב-PBS תוסף 2% FBS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

יש לוודא באמצעות פלוו ציטומטריה (flow cytometry) כי טוהר התאים הוא 95% CD8 positive או גבוה יותר. כעת, הוסיפו 225 microliters של מצע גידול מלא לחמישה מבחנות עם פקק הברגה, ולאחר מכן בצעו דילול סדרתי של התאים מהיחס 1:2 ועד 1:32. כדי לבודד את תאי המטרה CD4 positive, התחילו בהפשרת pbmc אוטולוגיים שהקפאו בבמבחנת מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius.

העבירו את התאים שהופשרו למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטרים של מצע. בצעו העשרה של תאי T המבטאים CD4 באמצעות הפרדה של חלקיקים מגנטיים כפי שהודגם זה עתה, תוך אישור של רמת טוהר של 95% ומעלה של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות ציטומטריה של זרימה. לאחר ספירת התאים, חלקו אותם לשתי מבחנות קוניות של 15 מיליליטר ולאחר מכן רחצו אותם ב-PBS חם; השעיקו את המשקעים ב-PBS בריכוז של 20 מיליון תאים למילליטר.

לאחר שווידאתם שהתאים מוגנים מאור, צבעו מחצית מה-T cells שחיוביים ל-CD4 בתמיסת עבודה טרייה של CFSE בריכוז גבוה, עד לריכוז סופי של 0.2 millimolar, ואת המחצית השנייה בתמיסת עבודה טרייה של CFSE בריכוז נמוך, עד לריכוז סופי של 0.04 millimolar, למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%CO2. בסיום תקופת הצביעה, סבבו את התאים במערך צנטריפוגה ושספנדו את המשקעים במיליליטר אחד של מצע מלא וחם כדי לעצור את תגובת הסימון. חלפו את ה-T cells שחיוביים ל-CD4 שסומנו ב-CFSE בריכוז נמוך עם ריכוז סופי של five micrograms per milliliter של הפפטיד הרצוי במצע מלא למשך 45 דקות באינקובטור לתרבית תאים.

לאחר הדגירה, שטוף את אוכלוסיות תאי ה-T בעלות הרמות הגבוהות והנמוכות של CFSE. השהה את שתי תרחיפי התאים במצע חסר פעמיים עד לריכוז של 200,000 תאים למילליטר בכל מצע חסר, ולאחר מכן ערבב את שתי אוכלוסיות המטרה ביחס של אחד ለአחד בין CFSE גבוה ל-CFSE נמוך.

כעת הוסיפו 100 µL של תאי T מעורבבים חיוביים ל-CD4 לכל באר בלוח 96 באערים בעל תחתית עגולה, ולאחר מכן זרעו 1 µL של כל סספנסיות תאי T חיוביים ל-CD8 בשכפול, לנפח סופי של 200 µL לבער. למדידת האפופטוזיס הבסיסי, זרעו שלוש באערים עם תאי מטרה בלבד, ולאחר מכן הדגרירו את התרבית המשולבת למשך שש שעות באינקובטור לתרביות תאים. עם סיום ההדגירה, העבירו את התאים ללוח VBO עם 96 באערים וצבעו כל באר באמצעות MHC Tetramers פפטידיים המשולבים עם PE למשך 15 דקות.

בתוך אינקובטור תרביות התאים, שטפו את התאים ב-PBS המכיל 2% FBS ולאחר מכן צבעו את התאים למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, בהגנה מאור, לאחר שטיפת התאים. שספפו שוב את המשקעים ב-100 microliters של 2% formaldehyde ב-PBS ובדקו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר השקיפה (co-culture), התאים נותחו וסווגו (gated) כפי שמוצג בגרפים של נקודות (dot plots) אלו.

היחס בין תאי מטרה חיים עם רמת CFSE גבוהה לבין תאים עם רמת CFSE נמוכה, ללא עיגור פפטיד או עם עיגור פפטיד, מנותח באמצעות שער (gate) קטן של פיזור קדמי לצד פיזור צדי (forward by side scatter). תאים חיים מסומנים על בסיס שליליות לצבעי חי/מת (live dead negative) ותאי T חיוביים ל-CD4 מוצגים על פני CFSE כדי לנתח את היחס בין תאים עם CFSE נמוך לתאים עם CFSE גבוה. לאחר מכן, נוצר שער פיזור קדמי לצד פיזור צדי גדול יותר כדי לספור את המספר הכולל של תאי אפקטור ותאי מטרה, חיים או מתים. לאחר דגירה של שש שעות, תאי T חיוביים ל-CD8 וחיוביים לטטראמר, ותאי T חיוביים ל-CD4 עם CFSE נמוך, מוצגים בניתוח כדי לבחון את היחס בין תאי אפקטור לתאי מטרה.

מספרם הכולל של תאי T אפקטורים CD8+ נקבע לאחר הגדרה (gating) של תאים CD8+ חיוביים לטטרמר. מספרם הכולל של תאי המטרה נקבע על ידי הגדרה של תאי T מסוג CD4+, בעלי ביטוי נמוך של CFSE, ותאים חיים ומתים (live dead) חיוביים ושליליים. יחס המטרה של תאי CFSE low לעומת תאי CFSE high הוא 1:1.

כאשר תאי המטרה החיוביים ל-CD4 תורגשים בהיעדרה של תאי אפקטור, יחס זה יורד באופן דרסטי. כאשר תאים בעלי דופק CFSE נמוך מדגירים יחד עם אוכלוסיית תאי T חיוביים ל-CD8 הכוללת תאי T אפקטורים חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן.

ככל שהיחס פוחת, תאי מטרה מסוג CD4 חיוביים שעברו פעימה של פפטיד ובעלי רמת CFSE נמוכה מתחילים להפוך לחיוביים לצבעי חי-מת. דילול של תאי האפקטור גורם לפיכך לשחזור של יחס ה-CFSE, ובסופו של דבר לשחזור של מספרם של תאי T מטרה בני חיים מסוג CD4 חיוביים, בעלי רמת CFSE נמוכה, שעברו פעימה של פפטיד. ניתן להצג את אחוז הליזיס הספציפי כפונקציה של יחס האפקטור למטרה בסולם לוגריתמי. כפי שמוצג בגרף, מחושב רגרסיה ליניארית מהתרשים, ומשוואת קו המגמה משמשת לחישוב היחידות הליטיות.

זהו מספר תאי T אפקטורים חיוביים ל-CD8 הנדרשים כדי להרוג 30% ממיליון תאי T חיוביים ל-CD4 מטרה, זאת כדי לקבוע את היכולת הציטוליטית האינהרנטית של תאי T חיוביים ל-CD8 הספציפיים לאנטיגן, ולהשוות את התוצאות בין תורמים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש בציטומטריה כדי למדוד את הפעילות הציטוטוקסית של תאי T ספציפיים לאנטיגן. ניתן להתאים טכניקה זו בקלות גם לסוג תאי T משלכם.