עיצוב והפעלה של רציף

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק חומר צמחי המועשר באופן גבוה ב-carbon 13 וב-nitrogen 15, באופן אחיד בכל הצמח או באופן דיפרנציאלי ברקמות מבניות ומטבוליות. דבר זה מושג תחילה על ידי בניית תא אטום לאוויר לצמיחת הצמחים. השלב השני הוא בקרה על הטמפרטורה, הלחות ורמות ה-carbon dioxide בתא כדי לשמור על תנאי גידול מתאימים עבור הצמחים.

בשלב הבא, הצמחים גדלים בתא אטום עם אוויר המכיל 13 C, פחמן דו-חמצני והשקיה ודישון המכילים חנקן 15. השלב הסופי הוא הפסקת הסימון על ידי הוצאת הצמחים המסומנים באופן דיפרנציאלי מהתא שבועות לפני הבציר, כך שהחומר המטבולי שלהם יהיה פחות מועשר ב-carbon 13 ובחנקן 15. בהשוואה לרכיבי המבנה של הצמח לאחר קציר החומר הצמחי, משתמשים במיצוי במים חמים ובספקטרומטריית מס של יחסי איזוטופים כדי למדוד את הסימון האיזוטופי הכללי ואת ההבדלים בעוצמת הסימון.

היתרון המרכזי של סימון רציף על פני שיטות אחרות, כגון יישום על העלים או סימון פולסים חוזר, הוא שהוא מייצר חומר צמחי מסומן באופן אחיד שניתן לסמן באופן דיפרנציאלי במרכיביו המטבוליים או המבניים. כדי להתחיל בהליך זה, בנו את תא הסימון כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף על ידי הרכבת דפנות אקרילי שקוף בעובי 3.18 millimeter ותקרת אקרילי שקוף בעובי 6.35 millimeter על שלדת אלומיניום עם רצפת פלדה צבועה בלבן; ניתן להתאים את מימדי התא לצרכי גידול ספציפיים של הצמח. התא המוצג כאן הוא במידות של 1.2 על 2.4 על 3.6 meters ומכיל 40 עציצים של 15 liter; ודאו שהתא אטום לאוויר על ידי כיסוי כל התפרים בחומר איטום סיליקון מתאים.

חבר את הדלת לבורגי מכונה, שניתן להבריג ולהסיר באמצעות אומים כנפיים נשלפים. אטום את הדלת באמצעות איטום מזג אוויר כדי למנוע דליפת אוויר באזור הסמוך ישירות לתא הסימון. חבר את מרכז הבקרה למסך וכוון את הטמפרטורה, הלחות והפחמן הדו-חמצני בתוך התא.

יש לוודא שהחוטים החשמליים וצינורות הגז העוברים אל תוך התא אטומים היטב בעזרת סיליקון כדי למנוע דליפת אוויר. ניתן להוסיף תאורה לתא כדי להגביר את חדירות האור ולשלוט באורך היום. כדי לווסת את טמפרטורת התא, התקינו מזגן מסוג split מסחרי, כאשר סלילי המאייד ממוקמים בתוך התא, והמדחס וסלילי המעבה ממוקמים מחוץ לתא לצורך פיזור החום.

בשלב הבא, התקינו מסיר לחות קטן לחדרים בתוך התא. קדחו חור ברצפה בסמוך למסיר הלחות, והעבירו את צינור הניקוז של מסיר הלחות דרך החור אל תוך צנצנת המוכנה מראש עם מים. פעולה זו יוצרת אטם הרמטי לניקוז ומאפשרת איזון בלחץ. וותקו את הלחות בתא על ידי חיבור בקר ניתן לתכנות, כגון omega eye series עם חיישן לחות, למסיר הלחות.

לאחר מכן, התקינו מנתח גז באינפרא-אדום או ER a עם משאבת דיאפרגמה ששואבת אוויר באופן רציף מהתא דרך ה-ER A ובחזרה לתא. פעולה זו שומרת על מערכת סגורה תוך ניטור רציף של ריכוז הפחמן הדו-חמצני בתא. לאחר מכן, חברו שני מיכלי גז פחמן דו-חמצני טהור למערכת הבקרה של הפחמן הדו-חמצני.

אחד המכלים צריך להכיל פחמן דו-חמצני עם ריכוז של 10 אטומי אחוז של 13C ומעלה, והמכל השני צריך להכיל פחמן דו-חמצני בריכוז טבעי של 13C. הגדירו את וסתי המכלים ל-20 PSI; לאחר הווסתים, התקינו שסתומי סולנואיד בקווי הגז כדי לשלוט בהזרקות של הפחמן הדו-חמצני באמצעות תוכנת ה-Ergo.

שלוטו בפתיחה ובסגירה של שסתומי הסולנואיד על ידי חיבורם ל-ER rga באמצעות תוכנית ממסר במצב מוצק (solid state relay), התראת מינימום (low alarm) בתוכנת ה-ergas להפעלת פתיחת שסתומי הסולנואיד כאשר ריכוז הפחמן הדו-חמצני בתא יורד מתחת לערך מסוים, וטווח מת (deadband) לסגירת השסתומים ברגע שריכוז הפחמן הדו-חמצני מגיע לנקודת ייחוס עליונה. לאחר שסתומי הסולנואיד, חברו שסתום מדידה לכל אחד משני קווי מיכלי הגז וכווננו אותם בזהירות לרמת העשירה הרצויה של carbon 13 באטמוספירה.

כאן אנו משתמשים בהעשרה של 4.4 אטומי אחוז של פחמן 13. חברו את פתחי היציאה יחדיו ולבסוף הניחו את הצינור במרכז התא בין המאווררים, דבר המסייע להפצה שווה של הפחמן הדו-חמצני המסומן ברחבי התא לצורך הקמת מערכת ההשקיה. ראשית, צרו טבעת השקיה בטיפות אחת לכל עציץ והעבירו את צינור ההשקיה דרך חור קטן שנוצר בדופן התא אל החלק החיצוני.

לאחר מכן, אטמו את החורים מסביב לצינור ההשקיה באמצעות איטום סיליקון כדי למנוע דליפת אוויר מהחלק החיצוני של התא. חברו את צינור ההשקיה לצינור של משאבה פריסטלטית והניחו עליו תפס צינור קטן כדי למנוע דליפת אוויר בין השקאות. הנביטו את הזרעים לפני השתילתו בעציצים כדי להבטיח חיוניות, והדביקו את השתילים בבוצת קרקע טרייה. כדי להחדיר מיקרובים מועילים, מלאו את העציצים בתערובת שתילה נטולת קרקע כדי למנוע החדרת פחמן וחנקן לא מסומנים מהקרקע.

כאן אנו משתמשים בתערובת של חול, ורמיקוליט וקרמיקה נקבובית פרופילית. לאחר נביטת הזרעים, השתילו בזהירות את השתילים לעציצים עם כמות מינימלית של מצע שתילה. לאחר מכן, העבירו את העציצים לתא וחברו לכל עציץ צינור השקיה נפרד.

לבסוף, אטמו את דלת התא ובצעו ספיחה של הפחמן הדו-חמצני החיצוני על ידי חיבור ספיח soda lime למשאבת האוויר, עד שריכוז הפחמן הדו-חמצני ירד ללפחות 200 עד 250 parts per million. לפני כן, מלאו שוב את התא עד לריכוז של 400 parts per million. תוך שימוש בתערובת ממיס הפחמן הדו-חמצני 13 C, השתדלו להשאיר את התא סגור לאורך כל עונת הגדילה כדי למזער זיהום של פחמן דו-חמצני בשפע טבעי.

ראשית, סמנו תמיסת דשן מסוג hyland בעזרת nitrogen 15 על ידי ערבוב של potassium nitrate עם nitrogen 15 בריכוז של 98% אטומים, עם potassium nitrate בעל שפע טבעי של nitrogen 15, ולאחר מכן הוסיפו זאת לשאר תמיסת hookin. כאן אנו משתמשים בתמיסת nitrogen 15 בריכוז של 7% אטומים לצורך הדישון. השתמשו במשאבה פריסטלטית כדי להזרים את תמיסת הדשן המסומנת ב-nitrogen 15 דרך צינורות ההשקיה.

הדקו את צינורות ההשקיה באמצעות תפסני UNC והנפיקו כמויות משתנות של דשן לצמחים הבודדים בהתאם לדרישה ולתכנון הניסוי. לאחר מכן, הזרימו מים דרך הצינורות כדי לשטוף את הדשן מתוכם. כמות הנוזל הכוללת שנוספה לא צריכה לעלות על קיבולת השמירה על המים של העציצים, וזאת כדי למזער את בזבוז הדשן.

הדק את התפסים ואת כל הצינורות לאחר ההפריה וההשקיה כדי למנוע דליפת אוויר מהתא. לצורך סימון דיפרנציאלי של רכיבים מבניים ומטבוליים, הוצא את הצמחים מתא הסימון שבוע עד שלושה שבועות לפני הקציר. השאר את הצמחים המיועדים לסימון אחיד בתוך התא עד לקציר.

כדי להשרות נשירה (senescence), פשוט הפסיקו את ההשקיה כאשר תהיו מוכנים. קצרו את הצמחים על ידי גזירה ראשונית של הביומסה שמעל פני הקרקע.

לאחר קציר הביומסה מעל פני השטח, שפכו את תערובת השתילה והשורשים מעל נפה עם רשת של שש מילימטרים כדי להפריד את השורשים מתערובת השתילה. לאחר מכן, שטפו את השורשים מעל נפה עם רשת של שני מילימטרים כדי להסיר שאריות של חומרי השתילה. השתמשו בפינצטה במידת הצורך כדי להסיר שאריות של תערובת שתילה שייתכן ונדבקו לשורשים, ולאחר מכן הניחו לשורשים להתייבש באוויר כהכנה לניסויים עתידיים.

במהלך שלושה עונות גידול של פעילות, התא שמר בהצלחה על טמפרטורה שבין 26 ל-29 °C, לחות שבין 36% ל-56% וריכוזי פחמן דו-חמצני שבין 360 ל-400 ppm, כפי שהוגדרו במרכז הבקרה. מוצגים כאן תוצאות מייצגות מעונת הגידול של שנת 2011 של *Andra Pogon* Girard di. נראה כי הצטברות הפחמן הדו-חמצני במהלך הנשימה הלילית אינה פוגעת בצמחים הגדלים, והיא נספגת במהירות לאחר הזריחה.

סימון בחנקן 15 באמצעות תמיסת הוגלנין המכילה 7% אטום של חנקן 15 הניב חומר צמחי מסומן בריכוז של 6.7% אטום חנקן 15; דילול קל מהסימון המתוכנן של חנקן 15 עשוי לנבוע משפע טבעי של חנקן בתערובת השתילה או מההחדרה של קרקע טבעית. סימון בפחמן 13 באמצעות פחמן דו-חמצני עם יעד של 4.4% אטום 13C הניב 4.46% אטום פחמן 13. לאורך כל מצע השבבים של החומר הצמחי המסומן באופן אחיד, לצמחים המסומנים באופן דיפרנציאלי, שהוצאו מהתא שבעה, 14 או 22 ימים לפני הקציר, היה הבדל משמעותי בפחמן 13 ובחנקן 15.

תכולה ברכיבים מטבוליים שהושגו כתמציות במים חמים ורכיבים מבניים שהושגו כשאריות של תמציות במים חמים, המצביעים על סימון דיפרנציאלי של חומרים צמחיים מטבוליים ומבניים. לאחר פיתוחה, סללה שיטת הסימון הרציף באיזוטופים כפולים את הדרך עבור חוקרים בביוגיאוכימיה לחקור את גורלם ואת התמירתו של רכיבי צמחים בסביבה בקנה מידה מאקרו וננו.