פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן xenografts

הטכניקה המבוססת לחסן xenografts orthotopic פולשנית העיקרית לסרטן שלפוחית ​​השתן דורשת laparotomy והתגייסות של שלפוחית ​​השתן. הליך זה גורם תחלואה משמעותית בעכברים, הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש זמן רב. לפיכך, אנו פיתחנו דיוק גבוה, בגישה מלעורית ניצול הנחיית אולטרסאונד.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור השתלות סרטן שלפוחית השתן אורתוטופיות בצורה מהירה, מדויקת וזעיר פולשנית. זה מושג על ידי הרחבת קו תאי הגידול הספציפי והשעיה של תאי הגידול במטריג'ל. לאחר מכן, החיה מותקנת על פלטפורמת ההדמיה ושלפוחית השתן מדומיינת באמצעות אולטרסאונד.

לאחר מכן מופרדות השכבות הריריות והשריריות בשלפוחית השתן באמצעות זריקת מי מלח. לבסוף, תרחיף המטריגל של תאי הגידול מוזרק לחלל שנוצר באופן מלאכותי. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות צמיחת גידול באמצעות הדמיית אולטרסאונד וביו-לומינסנציה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון שימוש בלפרוטומיה לחיסון קסנוגרפטים ראשוניים, הוא שגישה זו מהירה, מדויקת ופולשנית מינימלית. ההשלכות של טכניקות אלה משתרעות על אבחון וטיפול בסרטן שלפוחית השתן מכיוון שהשתלות אוטומטיות הן תקן הזהב למחקר פרה-קליני של טיפולים חדשים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי ההזרקה די קשים ללמידה, והמים היו דלילים מאוד, הדגמת הליך זה תהיה.

לאיגור מוסקה יש עוזר מחקר ולוולפגנג ייגר, פוסט-דוקטורנט. שניהם אורולוגים לאחר שאישרו את זהות קווי התאים של סרטן שלפוחית השתן האנושית בהתאמה. למחקר זה באמצעות טביעת אצבע של DNA, השתמש במבנה לנטי-ויראלי הנושא את הגן לוציפראז גחלילית לניתוח גידול ביולומינסנציה של גידולי קסנוגרפט כדי להעביר את קווי התאים.

כאשר מוכנים להתחיל בהליך, יש להפשיר ולהשתמש ב-DMEM עם 10% FBS כדי להרחיב את קווי התאים הקיימים, לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO2. להכנת תרחיף תאים להזרקה לאחר הפשרה, מטריג'ל ושמירה על עיני טריפסין קרח, 70% תאי מפגש והשתמש במדיום גידול רגיל כדי להשהות, ואז לספור את התאים ולסובב את התרחיף ב 200 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו את הכמות המתאימה של נפחים שווים של D-M-E-M-F-B-S ו-MATRIGEL כדי להגיע לריכוז התאים הרצוי להזרקת נפח של 40 מיקרוליטר לבעל חיים.

מערבבים היטב והימנעו מיצירת בועות אוויר מכל סוג של חומר פלסטי שטוח וקשיח. חותכים מייצב שלפוחית השתן, בודקים בזהירות את הרצועה ומסירים קצוות חדים לפני המריחה על העכברים. לאחר הרדמת עכברים נקבות עם 3% איזופלורן בחמצן וביצוע צביטה בבוהן.

כדי להבטיח הרגעה נאותה, הרכיבו את החיה על שולחן ההדמיה המחמם של פלטפורמת ההדמיה של בעלי החיים הקטנים, תוך ניטור רציף של הסימנים החיוניים שלה עם גומיה. תקן את הגפיים התחתונות והשתמש ב-0.5% כלורהקסידין גלוקונאט כדי לחטא את הבטן לפני השימוש בקצה כותנה סטרילי כדי לנגב את העור. לאחר מכן, באמצעות רצועת ייצוב שלפוחית השתן, שתק את שלפוחית השתן כדי למנוע התחמקות ממנה במהלך הזרקה תוך-מורלית.

לאחר מכן מרחו ג'ל אולטרסאונד סטרילי על הבטן התחתונה. התקדם לאט לאט את סריקת האולטרסאונד, פנה לעור ודמיין את שלפוחית השתן על מסך האולטרסאונד. אם שלפוחית השתן ריקה, השתמש ב-50 מיקרוליטר PBS חם בצנתר אנג'יו 24 מד דרך השופכה כדי למלא אותו כדי להפריד את שכבות דופן שלפוחית השתן.

התחל בחיבור מזרק של 1.0 מיליליטר מלא ב-PBS ומחובר למחט בגודל 30 שלושת רבעי אינץ' למהדק המזרק. מקם את המחט לכיוון העור ממש מעל עצם הערווה. בזווית של 30 עד 45 מעלות, זהה את המחט על מסך האולטרסאונד לפני ניקוב איטי של העור ושרירי דופן הבטן.

לאחר מכן, סובב את שיפוע המחט 180 מעלות כך שהוא פונה לאחור, והכנס את קצה המחט לדופן שלפוחית השתן מבלי לחדור לרירית לאחר מכן כדי ליצור מרחב מלאכותי, הזרקו לאט 50 מיקרוליטר PBS בין שכבת השריר לרירית לפני משיכת המחט. כדי להזריק לתאי סרטן שלפוחית השתן, חבר מזרק שני של 1.0 מיליליטר מלא בתרחיף המטריג'ל של תאי הסרטן, ומחט בגודל 30 בגודל שלושת רבעי אינץ' למהדק המזרק.

הנח את קצה המחט לחלל המלא ב-PBS. זה עתה יצר והזריק 40 מיקרוליטר מהמתלים לחלל. לאחר מכן משוך את המחט לאחר פירוק העכבר מפלטפורמת ההדמיה.

שמור אותו בסביבה חמה ונוחה תחת ניטור רציף. לאחר החזרה להכרה ותנועה רגילה, החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה. הזרקה תוך-מורלית של שלושה קווי תאי גידול שונים בוצעה ב-50 בעלי חיים בהנחיית אולטרסאונד במשך שלושה ימים רצופים.

החיסון בוצע ביעילות ולא היה קשור לסיבוכים תוך-התערבותיים או לאחר התערבות. ניטור צמיחת הגידול בוצע על ידי הדמיית אולטרסאונד וביו-לומינסנציה. ביום השלישי, ניתן היה לזהות גידול על ידי אולטרסאונד בשלפוחית השתן הקדמית של כל 50 בעלי החיים, ו-98% מהעכברים הראו גידול קבוע במהלך תקופת המעקב לאחר החיסון של UC. שלוש.

לוק עכבר אחד פיתח התפשטות גידול תוך צפקי והגידול התפתח לאחר היום השביעי בחיה שנייה. זו הייתה קבוצת העכברים הראשונה שחוסנה בטכניקה חדשה זו לאחר חיסון UC. שלוש. לוקס uc, לוקס אחד, ו-uc.

13 לוקס. העכברים הוקרבו בימים 24, 28 ו-37 בהתאמה. גידולי קסנוגרפט נקצרו ונבדקו באמצעות חתכי h ו-d.

כל הגידולים היו פולשניים לשרירים וחלקם חדרו לשומן הקרביים, אך לא נצפתה פלישה לאיברים סמוכים. 60% מה-uc, 13 לוק ו-20% מה-uc. שלושה עכברים נושאי גידול לוק פיתחו גרורות בבלוטות הלימפה הרטרופריטונאליות, שאושרו על ידי צביעת h ו-e.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש דקות. היכרות עם הדמיית אולטרסאונד היא תנאי הכרחי לביצוע הליך זה לאחר שגידולים חוסנו בצורה זו, האולטרסאונד מאפשר לנו לא רק לעקוב אחר צמיחת הגידול לאורך זמן וגם להסתכל על זלוף הגידול באמצעות מיקרו-בועות. זה מאפשר לנו גם לבצע הזרקה תוך גידולית עם חומרים ניסיוניים חדשים.