שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת
13 באוקטובר 2015
מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים ולכמת את דינמיקת הגדילה של התכלילים (inclusions) של חלמידיה בתאים חיים. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת תאי מאכסן פלורסצנטיים המבטאים באופן יציב חלבון פלורסצנטי, כגון GFP, בציטופלזמה שלהם. לאחר מכן, תאי המאכסן מודבקים בחלמידיה ונשארים לדגירה.
לאחר מכן, התאים המודבקים נדגמים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים. לבסוף, מאפייני ההכלילה (inclusion) של הכלמידיה נמדדים באמצעות תוכנה לניתוח מיקרוסקופי; בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים כדי להנחית ויזואלית את הכלילות של הכלמידיה בתוך תא המאכסן וכדי למדוד פרמטרים ביולוגיים של הכלילות לצורך קבלת תוצאות כמותיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספירה מבוססת נוגדנים, הם שניתן להשתמש באסטרטגיית הדמיה הפוכה זו על תאים חיים, וכן בשילוב עם סמנים פלואורסצנטיים אחרים כדי לכמת את דינמיקת הכלילה של כל מיני הכלמידיה.
יתרה מכך, בניגוד לשיטות שגרתיות המסמנות חיידקים בתוך תאים, גישה זו מאירה את ממברנת התכליל (inclusion membrane) בתאים חיים, ובכך יכולה לחשוף תכונות דינמיות חשובות של תא זה המכיל את הפתוגן. לאחר יצירת תאי HeLa פלואורסצנטיים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זרע תאי GFP HeLa בכלי תרבית רצוי, כגון צלחות בעלות תחתית זכוכית לדמיון ברזולוציה גבוהה או פלטות 24 בארות לקביעת IFU וסריקת רב-בארות; הפשר שפופרת קפואה המכילה Crich Cotus, או כל זן חלאמידי אחר רצוי, על קרח ודלל ב-HBSS לריבוי זיהומים (multiplicity of infection) הרצוי. כדי לבצע זיהום סטטי עם Crich Cotus, LGV zero VL two, שאב את המדיום מהבארות והשתמש ב-HBSS כדי לשטוף את תאי ה-GFP HeLa.
הוסיפו חיידקים מדוללים לבארות והדגירו בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שעתיים, שאבו את התאים ושטפו עם HBSS. לאחר מכן, לאחר הוספת מצע גידול, הדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור פחמן דו-חמצני כדי לבצע הדבקה בסיוע סנטריפוגציה עם crich to serovar D או כל זן אחר של chlamydial. השתמשו ב-HBSS לשטיפת תאי GFP hela והוסיפו חיידקים מדוללים לתאים.
לאחר מכן, מקמו את הצלחת עם התאים המודבקים במחזיק פלטות רב-בארים של רוטור עם דליים נדנדים בצנטריפוגת שולחנית. צנטריפוגו את התאים ב-900 ×g ובטמפרטורה של 25 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, מקמו את כלי התרבית באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת בתוך קבִינת בטיחות ביולוגית, שאבו את התאים, שטפו פעמיים עם HBSS והוסיפו מצע גידול.
דגרו את צלחת התאים המודבקים ב-37 °C. כדי להדמיות של הכלואות (inclusions) של החלאמידיה, הוציאו את תאי ה-GFP hela המודבקים בחלאמידיה מדגירת ה-carbon dioxide והשתמשו ב-RPMI ללא phenol red ו-5%FBS להחלפת המצע. הניחו את הצלחת או את פלטת הרב-בארים על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך עם עדשת שמן 20x או יותר. בעזרת תוכנת דימוי, זהו תאי GFP hela המודבקים בחלאמידיה, הנראים כתאים ירוקים המכילים חורים שחורים גדולים.
בתיבת הדיאלוג של הגדרות הרכישה (acquisition setup), הגדירו את התוכנה לרכישת הערוץ הירוק וכל ערוץ נוסף שהתווסף לדגימה. השתמשו בכפתור הלכידה/הקלטה (capture/record) כדי לרכוש את התמונה בזמנים הרצויים. לאחר ההדבקה, הוציאו את תאי ה-HeLa המבטאים GFP והמדובקים ב-Chlamydia מהאינקובטור והניחו את הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך.
התמקדו במישורי האמצע של התאים, שם ההכלילים (inclusions) נמצאים בקוטר ובנבואיות המקסימליים שלהם. רכשו תמונות עם קצוות חדים בלפחות 10 שדות ראיה לכל באר. הבארים מייצגות בדרך כלל חזרות או משתנים ניסיוניים.
כדי למצוא תאי HeLa המבטאים GFP תחת לשונית המדידות (measurements), השתמשו בפקודת find objects ובחרו בערוץ הירוק. התאימו את עוצמת הסף (threshold intensity) בהתבסס על העוצמות היחסיות של התאים. ספרו ידנית את מספר ההכלילים או התאים השחורים ואת תאי ה-HeLa המבטאים GFP באמצעות ראייה, או השתמשו באלגוריתמים של תוכנת דימוי כדי לזהות ולספור את ההכלילים באופן אוטומטי.
סננו את האובייקטים שנבחרו על ידי השארת אלו שגודלם גדול מחמישה מיקרומטרים רבועיים בלבד. הגדירו זאת כאוכלוסייה אחת. באמצעות אוכלוסייה זו, השתמשו בפקודת fill holes in objects; קלט זה ייצור את אוכלוסייה שתיים.
החסיר את אוכלוסייה אחת מאוכלוסייה שתיים כדי לקבל הכללות חלאמידיה מסומנות באופן חיובי, המוגדרות כאוכלוסייה שלוש. השתמש בפקודת סינון האוכלוסייה כדי להחיל מסנן גודל על אוכלוסייה שלוש. לדוגמה, לצורך שמירה על אובייקטים הגדולים מ-25 square micrometers עבור הכללות בתאים שהודבקו למשך 24 שעות או יותר, או עבור זמני הדבקה מוקדמים, הגדר את מסנן הגודל כדי לשמור על אובייקטים הגדולים מ-4 square micrometers.
מאחר שההכלילות הללו קטנות הרבה יותר, מסנן הגודל מניב אוכלוסייה של עצמים המוגדרים כהכלילות. השתמש בתוכנת הדימוג כדי לחשב נתונים כמותיים מהתמונות, כגון מספר ההכלילות, גודל ההכלילות והיקף ההכלילות. בעקבות זיהום ב-chlamydia, ההכלילות נראות בבירור כנקודות שחורות ותאי המאכסן או chlamydia המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתוך תאי המאכסן, וניתן לנצל את בהירותן לצורך זיהוי אוטומטי במספר רב של שדות ראייה ו/או טיפולים.
כפי שמוצג בגרף זה, יישום מרכזי אחד הוא קביעת יחידות יוצרות-הכלה (inclusion forming units) של קלמידיה בתאים חיים נגועים, דבר המבטל את הצורך בהליכי אימונופלואורסצנציה, שהם גם גוזלי זמן וגם יקרים. מאפיין מרכזי נוסף של גישת הדמיה זו הוא שניתן ליישמה בקלות לכל מין או זן של קלמידיה. בדוגמה זו, בוצע ניתוח של מהלך זמן בתאי HeLa המבטאים GFP שהודבקו באחד מארבעה מינים או זנים של קלמידיה, עבור כל אחד מהמינים ומהזנים הללו.
ההכלילות (inclusions) סומנו ונותחו כדי לחשב את השטח הממוצע, אורך ההיקף ומספרן לתא בנקודות הזמן שצוינו. מאפיינים אלו מספקים מידע חשוב על הביולוגיה של הכלילות של החלמידיה, כולל האופן שבו הן מקיימות אינטראקציה עם תא המארח. מוצג כאן סרטון של תאי HeLa המבטאים mCherry שהודבקו ב-GFPC, Tracom L two, המורכב מתמונות time-lapse שצולמו במרווחים של חמש דקות למשך 125 דקות, החל מ-48 שעות לאחר ההדבקה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בטכניקת הדימוי ההפוך זו, לא רק לצורך ויזואליזציה של הכלות (inclusions) של Chlamydia, אלא גם לצורך כימות של דינמיקת ההכלות, כגון היקף שטח ההכלה ומספר ההכלות לתא. טכניקה זו היא חסכונית יותר בהשוואה לטכניקות ויזואליזציה מסורתיות יותר, והיא יעילה עבור כל מיני וזני החיידקים של chlamydial.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להדמיה וכמותית של דינמיקת הגדילה של הכלולות (inclusions) של חלמידיה בתאים חיים באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאפשרת קביעה מהירה של הזיהומיות של Chlamydia וניתנת לשילוב עם סמנים פלואורסצנטיים אחרים לצורך ניתוח מקיף.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- זיהומי חламиדיה משמעותיים במחלות שונות.
- הבנת הדינמיקה של הגוף המכיל (inclusion) חיונית לחקר הביולוגיה של ה-Chlamydia.
- שיטות מסורתיות מסתמכות לעיתים קרובות על תאים מקובעים ונוגדנים.
- דימות תאים חיים מספק תובנות בזמן אמת לגבי תהליכי זיהום.
מטרת המחקר
- להדמיית תכלילים (inclusions) של חלאמידיה בתאים חיים.
- לכימות דינמיקת הגדילה של תכלילים אלו.
- לשיפור שיטות קיימות לחקר זיהומיות של Chlamydia.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת תאי מאכסן פלואורסצנטיים המבטאים GFP.
- הדבקת תאי מאכסן ב-Chlamydia.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חיה לצורך ויזואליזציה.
- כימות מאפייני ההכלילה (inclusion) באמצעות תוכנת ניתוח.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של הכלות (inclusions) של כלאמידיה בתאים חיים.
- השגת נתונים כמותיים על דינמיקת הצמיחה של ההכלות.
- הדגמת יתרונות על פני שיטות מסורתיות המבוססות על נוגדנים.
- פוטנציאל לשימוש עם סמנים פלואורסצנטיים שונים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את ההבנה של זיהומי Chlamydia.
- היא מאפשרת ניתוח בזמן אמת של דינמיקת ה-inclusion.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים נרחבים יותר על מיני chlamydia.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי כמי בשפה של תאים חיים של גדילת an inclusion של Chlamydia באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים נותן מענה לצורך קריטי במודלים דינמיים ובעתירי-תוכן של זיהום בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת של אינטראקציות בין הפתוגן למארח, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בתהליכי תיקוף של מטרות (target validation) והורדת סיכונים מנגנונית. התאימות של השיטה למספר מיני chlamydial ולסממנים פלואורסצנטיים שונים מגבירה את ערכה למחקר תרגומי של מחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה וכימות של דינמיקת ואקואולות המושרה על ידי פתוגנים בתאי מאכס חיים.
- תומך בהסרת סיכונים מנגנונית על ידי חשיפת פרמטרי גדילה של האינקלוזיה (inclusion) במאמתי חламиדיה שונים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור פעילות חלבוני אפקטור לפנוטיפים מדידים של האינקלוזיה.
- מספק פלטיים כמותיים לבחינה מונחית-השערה של אינטראקציות בין מאכס לפתוגן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקות תאים חיים (live-cell assays) מתוקשפות וניתנות לשחזור עבור ספירת הכללה ומדידת גודל.
- מפחית את ההסתמכות על שיטות מבוססות נוגדנים, ובכך מוריד את העלות ומגדיל את התפוקה עבור קמפיינים של סריקה.
- מאפשר ריבוי (multiplexing) באמצעות תיוגים פלואורסצנטיים נוספים לקבלת תוצאות רב-פרמטריות.
- תומך בניתוח תמונות אוטומטי להערכת תרכובות ניתנת להרחבה וסריקה פנוטיפית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים של זיהום הרלוונטיים למחלה על ידי לכידה של דינמיקת ההכללה (inclusion dynamics) בזמן אמת בתשביות תאים אנושיות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מדדי זיהום כמותיים וניתנים לתרגום.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום מותאם-סיכון, בהתבסס על נתונים דינמיים של אינטראקציית פתוגן-מארח.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטת דימות תאים חיים זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכת בתיקוף מוקדם של מטרות, בסריקה פנוטיפית ובמידול זיהומים תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: דימוי כמותי תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מנגנוני של אפקטורים של חלאמידיה.
- סריקה: שחזור של הבדיקה ותוצרים כמותיים מאפשרים סריקה חסונה ואנליזה השוואתית.
- אנליטיקה: מדידה אוטומטית של מספר האינקלוזיות, גודלן והיקפן מספקת נתונים ברי-יישום להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מדדי זיהום בזמן אמת מקלים על התאמה למערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: הפלטפורמה ניתנת להתאמה בין מיני חלאמידיה ותואמת סמנים פלואורסצנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מאח-פתוגן.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות זיהום בתאים חיים לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון באמצעות אספקת נתוני זיהום כמותיים בזמן אמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות ומודלים של מחלות זיהומיות בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים ובתוכנות לניתוח תמונות.
- נדרשת גישה לקווי תאי מאחס פלואורסצנטיים שעברו טרנספקציה יציבה ולתשתית דימוג מתאימה.
- נדרשת סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הדימוג והכימות בין צוותים שונים לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאימה למגוון זני chlamydia והיא תואמת לסימון פלואורסצנטי מרובה (multiplexed).
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בסף (thresholding) וסינון גודל קפדניים במהלך ניתוח התמונות.
