Name: שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת כלמידיה חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: חקור דינמיקת צמיחה של כלמידיה בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה חיה. שיטה זו מאפשרת כימות אינקלוזיות בזמן אמת ומספקת תובנות לביולוגיה של החיידק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לאיאן קלארק ול-P. Scott Hefty על הפלסמידים pGFP-SW2 ו-pASK-GFP-mKate2-L2, בהתאמה. אנו מודים לפול מילר על הסיוע הטכני ולריצ'רד סטיבנס על משאבים אחרים. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH AI095603 (KH).

1. דור של שורות תאי מארח פלורסנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1. תאי יום 293T פלייט (או קו האריזה retroviral אחר) על 6 צלחות גם ב2 x 10 6 תאים / טוב, להיות ~ 75% ומחוברות למחרת. אם תרצה, בארות כפולות צלחת עבור כל רטרו-וירוס לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2. תאי היום לשאוב ולהוסיף 2 מיליליטר בינוני טרי צמיחה (DMEM + 10% FBS L- גלוטמין + 2 מ&quot;מ). Transfect תאים עם 5-8 ק&quot;ג כל אחד מוקטור retroviral (המכיל GFP) ווקטור אריזה (למשל., PVSVg) באמצעות Lipofectamine 2000 או מגיב דומה ובעקבות הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם DNA במשך 4-6 שעות בC-CO 2 באינקובטור 37 מעלות, ולאחר מכן להחליף בינוני עם 1 מיליליטר מדיום גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 48 שעות בחממת 37 ° C-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי יום 3. פלייט היעד (לדוגמא., הלה) על 6 צלחות גם בצפיפות של כ 10 5 תאים / טוב, להיות ~ ומחוברות 50%היום הבא. ודא transfection החיובי בתאי 293T על ידי ניטור הקרינה GFP על מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4. לאסוף supernatants את תאי 293T בעזרת פיפטה ולסנן את supernatant דרך פילטר מזרק אצטט 0.45 מיקרומטר תאית המכיל רטרו-וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מתאי הלה ולהוסיף בינוני 0.5 מיליליטר צמיחה המכיל polybrene / מיליליטר 16 מיקרוגרם. להוסיף ~ 0.5 מיליליטר של רטרו-וירוס המסונן לתאי ירידה מבחינת דגירה תאים בחממה CO 2 37 ° C למשך 24 שעות. אחסן כל רטרו-וירוס שנותר (כלומר, מלשכפל גם) בשעת 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5. אם בארות כפולות נעשו כדי ליצור רטרו-וירוס נוסף, חזור על שלב 1.7 להדביק סדרתי עם חלקיקי retroviral שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6. מעבר transfected תאי הלה 1: 1 לאנטיביוטיקת בחירת מנה מכילה 10 סנטימטר (למשל, 500 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה מספיק זמן לתאי transduced לצמוח בחזרה בנוכחות של antibio הבחירהטיק, אחרי שיכולים להיות מופצים על ידי תאי טכניקות סטנדרטיים עם ריכוז נמוך של אנטיביוטיקה בחירה (למשל., 200 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין). הערה: תאים יכולים להיות גם נבחר clonally לבהירות אידיאלית בשלב זה, במידת צורך. </li></ol> 2. דור של להביע GFP כלמידיה trachomatis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CaCl 2 חיץ 2x (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 100 מ&quot;מ CaCl 2) וחיץ 4SP (0.4 מ &#39;סוכרוז, 16 מ&quot;מ Na 2 HPO 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום ג 1. הקפוא הפשירי מניית trachomatis על קרח ולדלל מייד 10 חיידקי μl ל2x CaCl חיץ 2 μl 50. הוסף 3 פלסמיד דנ&quot;א מיקרוגרם (לדוגמא., PASK-GFP-mKate2-L2), מערבב היטב ודגירה של 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב זה, להכין תאי מארח ידי trypsinizing בקבוק T-75 של תאים מקוי לתוך צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspenתא גלולה ד בנפח המתאים של 1x CaCl חיץ 2 לתת ריכוז סופי של 4 x 10 7 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 30 דקות (מהשלב 2.2), להוסיף 100 μl מוכן תאים מקוי לצינור תערובת שינוי (סה&quot;כ נפח 200 μl) ו דגירה 20 דקות נוספות ב 25 מעלות צלזיוס. להוסיף תערובת של תאים הפך זה 100 μl ולאחת מצלחת 6 היטב וכיסוי בינוני עם 2 מיליליטר צמיחה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור במשך 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3. תאי Lyse מקוי היום נגועים בג trachomatis ידי החלפה בינונית עם 1 מיליליטר DH 2 O וגירוד תאים עם קצה pipet 1,000 μl כפוף. הוסף 1 מיליליטר חיץ 4SP ולהעביר השעיה באמצעות מחט 27.5 G ~ 5 פעמים לתמוגה יעילה תא ושחרורו של ג trachomatis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 2 מיליליטר של lysate התא המכיל ג trachomatis לבקבוק T-75 המכיל monolayer מחוברות של MCC טרי מצופהתאים אוי; להוסיף 8 מיליליטר DMEM (ללא FBS) ו דגירה של שעה 2 ב 25 ° C כדי לאפשר ג trachomatis לדבוק תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לשאוב ולהוסיף מדיום גידול טרי בתוספת 10 U / G פניצילין מיליליטר ו1 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide. דגירה בקבוק במשך 48 שעות בחממה 37 ° C-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4. ודא ידי מיקרוסקופ אור שתאים נגועות ותכלילים מכילים כלמידיה חריגה. לזהות תכלילים כvacuoles בהיר במיקרוסקופ אור רגילה, וגופי כלמידיה חריגים כאובייקטים כמו טבעת בתוך תכלילים כי הם יותר מ 2 מיקרומטר קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5. Lyse תרבות על ידי החלפה בינונית עם 2 מיליליטר DH 2 O ולגרד תאים לתוך השעיה. הוסף 2 מיליליטר חיץ 4SP ולהעביר השעיה באמצעות מחט 27.5 G ~ 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מיליליטר של lysate התא להדביק monolayer טרי של תאים מקוי בבאר יחידה בצלחת 6 היטב. דגירה תאים עם lysate לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס, לשאוב ולהוסיף צמיחה טרימדיום המכיל G פניצילין וcycloheximide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בחממה 37 ° C CO 2 במשך 3-5 ימים, תלוי בבריאות כללית של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.9-2.10 אחד או יותר פעמים, תרבויות צורך, passaging לתוך בארות טריות בצלחת 6-היטב עד תכלילים מחפשים נורמלים (נטולי גופים הסוטים) צמחו. בשלב זה להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לבדוק שג trachomatis להביע mKate2 (אדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיקף של עד תרבויות נגועות לדור של מניות כלמידיה גבוהה כייל, למשל על ידי קצירת transformants כלמידיה מהתאים מקוי או הלה נגוע גדלו בT-150 צלוחיות. </li></ol> 3. להדביק תאים עם כלמידיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת ה- GFP-הלה בכלי תרבות רצוי, לדוגמא כלים מזכוכית תחתונה או שקופיות קאמריות להדמיה ברזולוציה גבוהה, או 24 גם צלחות לקביעת IFU והקרנת multiwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר הלוך ושובצינור זן המכיל ג trachomatis, ג muridarum, או ג pneumoniae על קרח ולדלל בHBSS לריבוי רצוי של זיהום (משרד הפנים), למשל משרד הפנים = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זיהומים או סטטי או בעזרת צנטריפוגה המבוססים על זן כלמידיה המסוים שישמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהומים עם ג serovar trachomatis LGV L2 או ג muridarum, לשטוף תאי GFP-הלה עם HBSS ו דגירה עם חיידקים מדוללים לשעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס. לשאוב ולשטוף תאים עם HBSS, דגירה תאים במדיום גידול בחממת 37 ° C-CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהומים עם D serovar trachomatis ג או ג pneumoniae, לשטוף תאי GFP-הלה עם HBSS ולהוסיף חיידקים בדילול לתאים. מניחים צלחת multiwell או צלחת זכוכית תחתונה (מובטחת בקלטת במכסת צלחת multiwell) בבעל צלחת multiwell של קובץ מצורף הרוטור דלי מתנדנד בצנטריפוגה המעבדתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב 900 XG ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כלי תרבות מצנטריפוגות והמקום בחממה 37 ° C CO 2 עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לשאוב בארון בטיחות ביולוגית, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS, ולהוסיף מדיום גידול טרי. תאי מקום בC חממת CO 2 37 מעלות. </li></ol></li></ol> 4. ויזואליזציה של תא חי תכלילים כלמידיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי GFP-הלה נגוע כלמידיה מCO 2 באינקובטור ולהחליף בינוני עם RPMI ללא FBS% אדומים 5 + פנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הר על מיקרוסקופ הפוכה הקרינה (Nikon Eclipse טי-E או דומה) באמצעות מטרת 20X ומעלה שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הדמיה (Volocity 6 או דומה), ולהתמקד בזיהוי כלמידיה נגועה תאי GFP-הלה: תאים ירוקים המכילים חורים שחורים גדולים (תכלילים כלמידיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את מקומות XYZ של אזורים המכילים תאי -infected כלמידיה של עניין באמצעות תוכנת הדמיה (כרךocity 6 או דומה). לבצע זאת על ידי ידני &#39;הוספת נקודות&#39; ואילו במצב תצוגת XY השלב. באופן זה, קואורדינטות XYZ נשמרות עבור כל מיקום מסומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת הדו-שיח התקנת הרכישה, להגדיר את התוכנה לרכוש ירוק (GFP, cytosol הלה) ואדום (trachomatis mKate2, ג) ערוצים, ובשיעור של מסגרות חדשות לערוץ כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את התמונה ברצף באמצעות רכישת פרוטוקול נכנס לעיל על ידי לחיצה על &quot;/ לכידה רשומה&quot; הכפתור. </li></ol> 5. Quantitation של פרמטרי צמיחת הכללה בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמנים רצויים לאחר זיהום (למשל., 24, 48 HPI) להסיר כלמידיה נגועה תאי GFP-הלה מחממה וההר במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הערה: מטרת 20X או 40X אוויר עם NA גבוה היא מתאימה ביותר לצלחות 24 גם, ומטרת נפט 40X מומלצת לשקופיות קאמריות. לגדל תאים משני מצע לזה את התחתאיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בmidplanes של תאים, שבי תכלילים הם בקוטר המרבי שלהם ולהניב קצוות חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות לתחומים רבים וב( לפחות 10 בכל טוב) כל אחד; בארות בדרך כלל מייצגות משכפל או משתנים ניסיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנות את מספר תכלילים ידני, על ידי עין (תכלילים הם תאים שחורים בתאי ה- GFP-הלה) או להשתמש באלגוריתמי תוכנת הדמיה לזהות באופן אוטומטי ולספור תכלילים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תאי ה- GFP-ידי הלה עוצמת הקרינה (&quot;מצא את האובייקטים&quot; הפקודה) ולהתאים את עוצמת סף הקרינה המבוססת על עוצמות יחסי של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אובייקטי סינון שנבחרו באמצעות הנחיות גודל של שמירה על אלה של יותר מ -5 מיקרומטר 2 בלבד. זה &quot;אוכלוסייה 1 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל &quot;למלא חורים באובייקטים&quot; הפקודה באמצעות &quot;אוכלוסייה 1 &#39;כקלט. צעד זה מייצר &quot;אוכלוסייה 2 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;אוכלוסיית 1 &#39;הפחת מ&#39;עמ&#39;opulation 2 &#39;לתשואה חיובית מסומן תכלילים כלמידיה, המיועדים כ&#39;אוכלוסיית 3&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מסנן גודל ל&#39;אוכלוסייה 3 &#39;(הפקודה &quot;אוכלוסיית מסנן&#39;), לאובייקטי שמירת דוגמא יותר מ -25 מיקרומטר 2 לתכלילים בתאים נגועים למשך 24 שעות או יותר. לפעמי זיהום מוקדמות, כגון לפני 18 שעות, מסנן גודל מוגדר לשמור חפצים גדולים יותר מ -4 מיקרומטר 2, כתכלילים אלה הם הרבה יותר קטנים. תוצאות סינון גודל באוכלוסייה של אובייקטים המיועדים כ&#39;תכלילים &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב נתונים כמותיים מתמונות, למשל, מספר הכללה, גודל הכללה, והיקף הכללה, באמצעות תוכנת הדמיה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+infections%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).</li>
<li>Schachter, J. Infection and disease epidemiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchachter%2C+J+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).</li>
<li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).</li>
<li>Hackstadt, T. Cell biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHackstadt%2C+T+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells%3A+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li>
<li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li>
<li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li>
<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה הניסיונית ליצירת תאי מארח ניאון להדמיה בזמן אמת וניתוח של תכלילים כלמידיה. גישה להדמיה vacuole זה מקנה יכולת רבת עוצמה כדי להאיר, לעקוב ולמדוד כמותית את המאפיינים הדינמיים של תכלילים כלמידיה פני אוכלוסיות של תאים או בתאים בודדים לאורך זמן. תכלילים כלמידיה בתאי חלבון הנקראים ניאון מוגדרות בולט היטב, כך שהם מזוהים בקלות ללא הצורך בעיבוד נוסף immunofluorescent. יתר על כן, גישה זו היא רגישה מספיק כדי לפתור את המחלוקות בין חתימה מורפולוגיים...

מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי זנים של חיידק כלמידיה תאית לעורר נטל גדול על בריאות הגלובלית, כולל מחלות המועברים במגע מיני, מחלה דלקתית של אגן, עיוורון, דלקת ריאות ואולי טרשת עורקים 1-4. היכולת של כלמידיה לאינטראקציה עם התא המארח, מתוך vacuole (מכונה ההכללה), הוא הקובע קריטי לזיהומם המוצלח של תאים והמארח. ההכללה היא תא פתוגניים רומן המאפשר צמיחת כלמידיה והוא שונה באופן דינמי לאורך כל המחזור ההתפתחותי 2-3 היום השלם של כלמידיה 5. הטבע תאיים לחייב של chlamydiae מציג מספר רב של אתגרים לקהילת המחקר, בפרט לישירות לומד הביולוגיה הייחודית של ההכללה. מכשול עיקרי היה חוסר היכולת לחזות או כלמידיה תאית או ההכללה שלהם על ידי גישת ניאון ביעילותes בתאים חיים. תגלית האחרונה סוף סוף גילתה את האמצעים ליצור GFP להביע ג 6 trachomatis; עם זאת, ממצא זה עדיין לא הוביל לתיוג ספציפי של ההכללה. כמה טכניקות שתוארו לתיוג של חיידקים ותכלילים 7,8, אך הם סובלים מליקויים כגון אי-סגוליות, ארעיות ורגישות לphotobleaching. גילוי מפתח על ידי הקבוצה שלנו הוקם אסטרטגיה חדשה להארת ההכללה באמצעות GFP להביע תאי מארח 9. אסטרטגיה זו באופן רציונלי מנצלת את האטימות הפנימיות של קרום ההכללה למולקולות גדולות יותר מאשר 520 Da 10. כאשר תאים מהונדסים לבטא חלבון מסוים cytosolic ניאון (למשל, ה- GFP או mCherry) ביציבות, תכלילים כלמידיה נראים בבהירות יוצאת דופן על ידי ההדרה המוחלטת שלהם של הקרינה. אסטרטגית הדמיה הפוכה זה מאפשרת הדמיה מיידית של תכלילים לכל Chlמיני amydia וזה יכולים להתאים בקלות למרבית תאי המארח של עניין. כהפגנה של השירות שלה, שיטה זו שימשה בעבר כדי לחשוף ולהגדיר את נתיבי יציאה הסלולריים לכלמידיה spp 9. כאן, אנו נוספים להדגים כיצד שיטה זו מתבצעת, וניתן לנצל כדי להפיק נתונים כמותיים מפתח על דינמיקת צמיחת הכללה. יתר על כן, זה יכול למעשה תחליף לשיטות ספירה מבוסס נוגדנים יקרות וניתן להשתמש בו במקביל עם תוויות ניאון אחרות, כגון mKate2 להביע 11 כלמידיה. זה שילוב רב עוצמה של כלים מאפשר חקירה של התכונות הפיזיות של קרום הכללת כלמידיה בתוך תאי מארח חיים.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & micro; m מסננים</td><td>פישר</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/o פנול אדום</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>כלי תחתית מזכוכית</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>מגלשות קאמריות, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

החיידק התוך-תאי המחייב כלמידיה מעורר נטל גדול על בריאות הציבור העולמית. קלוסטרידיום טרכומטיס הוא הגורם החיידקי המוביל לזיהומים המועברים במגע מיני וגם הגורם העיקרי לעיוורון הניתן למניעה בעולם. גורם חיוני להדבקה מוצלחת של תאי מארח על ידי כלמידיה הוא יכולתו של החיידק לתמרן את איתות התא המארח מתוך תא ריק חדש הנקרא הכללה. מתוך ההכללה, כלמידיה רוכשת חומרים מזינים הנדרשים לצמיחה ההתפתחותית שלהם במשך 2-3 ימים, והם מפרישים בנוסף פאנל של חלבוני אפקטור על הפנים הציטוזוליות של קרום הווקואול ולתוך הציטוזול המארח. עם זאת, פערים בהבנתנו את הביולוגיה של כלמידיה מציבים אתגרים משמעותיים להדמיה וניתוח תא תוך-תאי זה. לאחרונה תוארה אסטרטגיית הדמיה הפוכה להמחשת ההכללה באמצעות GFP המבטא תאים מארחים. גישה זו מנצלת באופן רציונלי את האטימות הפנימית של קרום ההכללה למולקולות גדולות כגון GFP. בעבודה זו, אנו מתארים כיצד נוצרים תאים מארחים המבטאים GFP או mCherry להדמיה עוקבת של תכלילים כלמידיים. יתר על כן, שיטה זו הוכחה כתחליף יעיל לשיטות ספירה יקרות המבוססות על נוגדנים, ניתן להשתמש בה במקביל לתוויות פלואורסצנטיות אחרות, כגון כלמידיה המבטאת GFP, וניתן לנצל אותה כדי להפיק נתונים כמותיים מרכזיים על צמיחת ממברנת הכללה ממגוון זנים וזנים של כלמידיה.

יכולים להיות מהונדסים תאי יונקים להביע חלבוני ניאון cytosolic (למשל, ה- GFP) כדי לאפשר הארת תכלילים כלמידיה בתרביות תאים חיות, נגועות. על הזיהום בכלמידיה, תכלילים הם בקלות לעין כמו כתמים שחורים בתאי המארח (איור 1). הבהירות של תכלילים חסרי-הקרינה יכולה להיות מנוצלת לזיהוי האוטומטי של תכלילים על פני מספר רב של תחומים מבט ו / או טיפולים (איור 1). ברגע שתאי מארח ניאון כבר נוצרו, עבודה חדשה ורבה עצמה מופעלת לניתוח מהיר, כמותי...

מתוארת שיטה מבוססת חלבון פלואורסצנטי של תאים חיים להארת ואקואולים תאיים (תכלילים) המכילים כלמידיה. אסטרטגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ואוטומטית של זיהום כלמידיה בדגימות וניתן להשתמש בה כדי לחקור כמותית את דינמיקת הצמיחה של הכללה.

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים ולכמת את דינמיקת הגדילה של התכלילים (inclusions) של חלמידיה בתאים חיים. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת תאי מאכסן פלורסצנטיים המבטאים באופן יציב חלבון פלורסצנטי, כגון GFP, בציטופלזמה שלהם. לאחר מכן, תאי המאכסן מודבקים בחלמידיה ונשארים לדגירה.לאחר מכן, התאים המודבקים נדגמים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים. לבסוף, מאפייני ההכלילה (inclusion) של הכלמידיה נמדדים באמצעות תוכנה לניתוח מיקרוסקופי; בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה של תאים חיים כדי להנחית ויזואלית את הכלילות של הכלמידיה בתוך תא המאכסן וכדי למדוד פרמטרים ביולוגיים של הכלילות לצורך קבלת תוצאות כמותיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספירה מבוססת נוגדנים, הם שניתן להשתמש באסטרטגיית הדמיה הפוכה זו על תאים חיים, וכן בשילוב עם סמנים פלואורסצנטיים אחרים כדי לכמת את דינמיקת הכלילה של כל מיני הכלמידיה.יתרה מכך, בניגוד לשיטות שגרתיות המסמנות חיידקים בתוך תאים, גישה זו מאירה את ממברנת התכליל (inclusion membrane) בתאים חיים, ובכך יכולה לחשוף תכונות דינמיות חשובות של תא זה המכיל את הפתוגן. לאחר יצירת תאי HeLa פלואורסצנטיים, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זרע תאי GFP HeLa בכלי תרבית רצוי, כגון צלחות בעלות תחתית זכוכית לדמיון ברזולוציה גבוהה או פלטות 24 בארות לקביעת IFU וסריקת רב-בארות; הפשר שפופרת קפואה המכילה Crich Cotus, או כל זן חלאמידי אחר רצוי, על קרח ודלל ב-HBSS לריבוי זיהומים (multiplicity of infection) הרצוי. כדי לבצע זיהום סטטי עם Crich Cotus, LGV zero VL two, שאב את המדיום מהבארות והשתמש ב-HBSS כדי לשטוף את תאי ה-GFP HeLa.הוסיפו חיידקים מדוללים לבארות והדגירו בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך שעתיים, שאבו את התאים ושטפו עם HBSS. לאחר מכן, לאחר הוספת מצע גידול, הדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור פחמן דו-חמצני כדי לבצע הדבקה בסיוע סנטריפוגציה עם crich to serovar D או כל זן אחר של chlamydial. השתמשו ב-HBSS לשטיפת תאי GFP hela והוסיפו חיידקים מדוללים לתאים.לאחר מכן, מקמו את הצלחת עם התאים המודבקים במחזיק פלטות רב-בארים של רוטור עם דליים נדנדים בצנטריפוגת שולחנית. צנטריפוגו את התאים ב-900 ×g ובטמפרטורה של 25 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, מקמו את כלי התרבית באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת בתוך קבִינת בטיחות ביולוגית, שאבו את התאים, שטפו פעמיים עם HBSS והוסיפו מצע גידול.דגרו את צלחת התאים המודבקים ב-37 °C. כדי להדמיות של הכלואות (inclusions) של החלאמידיה, הוציאו את תאי ה-GFP hela המודבקים בחלאמידיה מדגירת ה-carbon dioxide והשתמשו ב-RPMI ללא phenol red ו-5%FBS להחלפת המצע. הניחו את הצלחת או את פלטת הרב-בארים על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך עם עדשת שמן 20x או יותר. בעזרת תוכנת דימוי, זהו תאי GFP hela המודבקים בחלאמידיה, הנראים כתאים ירוקים המכילים חורים שחורים גדולים.בתיבת הדיאלוג של הגדרות הרכישה (acquisition setup), הגדירו את התוכנה לרכישת הערוץ הירוק וכל ערוץ נוסף שהתווסף לדגימה. השתמשו בכפתור הלכידה/הקלטה (capture/record) כדי לרכוש את התמונה בזמנים הרצויים. לאחר ההדבקה, הוציאו את תאי ה-HeLa המבטאים GFP והמדובקים ב-Chlamydia מהאינקובטור והניחו את הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך.התמקדו במישורי האמצע של התאים, שם ההכלילים (inclusions) נמצאים בקוטר ובנבואיות המקסימליים שלהם. רכשו תמונות עם קצוות חדים בלפחות 10 שדות ראיה לכל באר. הבארים מייצגות בדרך כלל חזרות או משתנים ניסיוניים.כדי למצוא תאי HeLa המבטאים GFP תחת לשונית המדידות (measurements), השתמשו בפקודת find objects ובחרו בערוץ הירוק. התאימו את עוצמת הסף (threshold intensity) בהתבסס על העוצמות היחסיות של התאים. ספרו ידנית את מספר ההכלילים או התאים השחורים ואת תאי ה-HeLa המבטאים GFP באמצעות ראייה, או השתמשו באלגוריתמים של תוכנת דימוי כדי לזהות ולספור את ההכלילים באופן אוטומטי.סננו את האובייקטים שנבחרו על ידי השארת אלו שגודלם גדול מחמישה מיקרומטרים רבועיים בלבד. הגדירו זאת כאוכלוסייה אחת. באמצעות אוכלוסייה זו, השתמשו בפקודת fill holes in objects; קלט זה ייצור את אוכלוסייה שתיים.החסיר את אוכלוסייה אחת מאוכלוסייה שתיים כדי לקבל הכללות חלאמידיה מסומנות באופן חיובי, המוגדרות כאוכלוסייה שלוש. השתמש בפקודת סינון האוכלוסייה כדי להחיל מסנן גודל על אוכלוסייה שלוש. לדוגמה, לצורך שמירה על אובייקטים הגדולים מ-25 square micrometers עבור הכללות בתאים שהודבקו למשך 24 שעות או יותר, או עבור זמני הדבקה מוקדמים, הגדר את מסנן הגודל כדי לשמור על אובייקטים הגדולים מ-4 square micrometers.מאחר שההכלילות הללו קטנות הרבה יותר, מסנן הגודל מניב אוכלוסייה של עצמים המוגדרים כהכלילות. השתמש בתוכנת הדימוג כדי לחשב נתונים כמותיים מהתמונות, כגון מספר ההכלילות, גודל ההכלילות והיקף ההכלילות. בעקבות זיהום ב-chlamydia, ההכלילות נראות בבירור כנקודות שחורות ותאי המאכסן או chlamydia המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתוך תאי המאכסן, וניתן לנצל את בהירותן לצורך זיהוי אוטומטי במספר רב של שדות ראייה ו/או טיפולים.כפי שמוצג בגרף זה, יישום מרכזי אחד הוא קביעת יחידות יוצרות-הכלה (inclusion forming units) של קלמידיה בתאים חיים נגועים, דבר המבטל את הצורך בהליכי אימונופלואורסצנציה, שהם גם גוזלי זמן וגם יקרים. מאפיין מרכזי נוסף של גישת הדמיה זו הוא שניתן ליישמה בקלות לכל מין או זן של קלמידיה. בדוגמה זו, בוצע ניתוח של מהלך זמן בתאי HeLa המבטאים GFP שהודבקו באחד מארבעה מינים או זנים של קלמידיה, עבור כל אחד מהמינים ומהזנים הללו.ההכלילות (inclusions) סומנו ונותחו כדי לחשב את השטח הממוצע, אורך ההיקף ומספרן לתא בנקודות הזמן שצוינו. מאפיינים אלו מספקים מידע חשוב על הביולוגיה של הכלילות של החלמידיה, כולל האופן שבו הן מקיימות אינטראקציה עם תא המארח. מוצג כאן סרטון של תאי HeLa המבטאים mCherry שהודבקו ב-GFPC, Tracom L two, המורכב מתמונות time-lapse שצולמו במרווחים של חמש דקות למשך 125 דקות, החל מ-48 שעות לאחר ההדבקה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בטכניקת הדימוי ההפוך זו, לא רק לצורך ויזואליזציה של הכלות (inclusions) של Chlamydia, אלא גם לצורך כימות של דינמיקת ההכלות, כגון היקף שטח ההכלה ומספר ההכלות לתא. טכניקה זו היא חסכונית יותר בהשוואה לטכניקות ויזואליזציה מסורתיות יותר, והיא יעילה עבור כל מיני וזני החיידקים של chlamydial.

using-fluorescent-proteins-to-visualize-quantitate-chlamydia-vacuole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקולים לביצוע מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחיות תאים חיידקיים לאפשר קומפלקסים מולקולריים תפקודית כדי להתגלות, מעקב לכמת.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

מקור: צ'טריט, ד. ואחרים. יישום הדמיית תאים חיים וטומוגרפיית קריואלקטרונים לפתרון תכונות מרחב-זמן של מערכת ההפרשה Legionella pneumophila dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020).הווידאו הזה מדגים את ההכנה וההדמיה של חיידקים פתוגניים מסומנים בפלואורסצנטית. כריות אגרוז מוכנות וממוקמות תחילה בתוך מסגרת דבק. תלייה של חיידקים מהונדסים גנטית המבטאים חלבון פלואורסצנטי מוחל על הפד כדי לייצב את התאים. המסגרת נאטמת באמצעות כיסוי ונצפית תחת מיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות פלואורסצנציה של חיידקים.

הכנת דגימה והדמיה של חיידקים מסומנים פלואורסצנטית

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

צבעי פלורסנט חיוניים הם כלים חיוניים לניתוח הדמיה של תא חי בביולוגיה מודרנית של תאים פטרייתיים. נייר זה מפרט את היישום של צבעי פלורסנט ידוע פחות ידועים עבור מעקב הדינמיקה קרום הפלזמה, אנדו-/אקסוציטוזה וקיר התא מורגנזה בפטריות filamentous.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

חקור דינמיקת צמיחה של כלמידיה בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה חיה. שיטה זו מאפשרת כימות אינקלוזיות בזמן אמת ומספקת תובנות לביולוגיה של החיידק.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת

גלה סרטונים נוספים