שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת כלמידיה חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת את דינמיקת הגידול של הכללת כלמידיה בתאים חיים. זה מושג על ידי יצירת תאי מארח פלואורסצנטיים המבטאים ביציבות חלבון פלואורסצנטי כגון GFP בציטופלזמה שלהם. לאחר מכן, התאים המארחים נגועים בכלמידיה ומאפשרים להם לדגור.

לאחר מכן התאים הנגועים נראים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי. לבסוף, מאפייני הכללת כלמידיה מכומתים באמצעות תוכנת ניתוח מיקרוסקופ בסופו של דבר מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי משמש להמחשת תכלילים כלמידיים בתוך התא המארח ולמדידת פרמטרים ביולוגיים של תכלילים לתוצאות כמותיות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ספירה מבוססת נוגדנים הם שניתן להשתמש באסטרטגיית הדמיה הפוכה זו על תאים חיים וגם בשיתוף פעולה עם תוויות פלואורסצנטיות אחרות כדי לכמת את דינמיקת ההכללה של כל מיני הכלמידיה.

יתר על כן, בניגוד לשיטות שגרתיות המסמנות חיידקים בתאים, גישה זו מאירה את קרום ההכללה בתאים חיים ובכך יכולה לחשוף תכונות דינמיות חשובות של תא המכיל פתוגן זה. לאחר יצירת תאי הלה פלואורסצנטיים, על פי לוחית פרוטוקול הטקסט, תאי GFP Hela על כלי תרבית רצוי, כגון צלחות תחתית זכוכית להדמיה ברזולוציה גבוהה 4 24 צלחות באר לקביעת IFU וסינון רב בארות מפשירים צינור קפוא המכיל קוטוס קריץ', או כל זן כלמידיה רצוי אחר על קרח ומדללים ב-HBSS לריבוי הזיהום הרצוי. כדי לבצע זיהום סטטי עם Crich Cotus, LGV zero VL two שואב את המדיה מהבארות ומשתמש ב-HBSS כדי לשטוף את תאי הלה GFP.

הוסיפו חיידקים מדוללים לבארות ודגרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, שאפו את התאים ושטפו עם HBSS. לאחר מכן, לאחר הוספת מצע גידול, יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני כדי לבצע זיהום בעזרת צנטריפוגה עם קריך לסרובר D או כל זן כלמידיה אחר. השתמש ב-HBSS כדי לשטוף את תאי הלה GFP ולהוסיף חיידקים מדוללים לתאים.

לאחר מכן הניחו את צלחת התאים הנגועים במחזיק צלחת מרובה בארות של רוטור דלי מתנדנד בצנטריפוגה על ספסל. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 900 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הניחו את כלי התרבות באינקובטור פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה בארון בטיחות ביולוגית, שאפו את התאים לשטוף פעמיים עם HBSS והוסיפו מצע גידול.

דגרו על צלחת התאים הנגועים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לדמיין תכלילים של כלמידיה, הסר תאי GFP hela נגועים בכלמידיה מאינקובטור הפחמן הדו חמצני והשתמש ב-RPMI ללא פנול אדום ו-5% FBS כדי להחליף את המדיה, הנח את הצלחת או הצלחת מרובת הבארות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם יעד שמן של פי 20 ומעלה. באמצעות תוכנת הדמיה, זהו תאי GFP hela נגועים בכלמידיה המופיעים כתאים ירוקים המכילים חורים שחורים גדולים.

בתיבת הדו-שיח של הגדרת הרכישה, הגדר את התוכנה כך שתשיג את הערוץ הירוק וכל ערוץ אחר שנוסף במדגם. השתמש בלחצן הקלטת לוכסן כדי להשיג את התמונה בזמנים הרצויים. לאחר הדבקה. הסר תאי GFP hela נגועים בכלמידיה מהאינקובטור והנח את המנה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מהפך.

התמקדו במישורים האמצעיים של התאים שבהם התכלילים נמצאים בקוטר המקסימלי שלהם ובתפוקתם. קצוות חדים רוכשים תמונות ב-10 שדות לפחות בכל באר. בארות מייצגות בדרך כלל שכפולים או משתנים ניסיוניים.

כדי למצוא תאי GFP hela בכרטיסייה מדידות, השתמש בפקודה find objects ובחר בערוץ הירוק. התאם את עוצמת הסף בהתבסס על עוצמות יחסיות של תאים. ספור ידנית את מספר התכלילים או התאים השחורים ותאי GFP hela בעין או השתמש באלגוריתמים של תוכנת הדמיה כדי לזהות ולספור תכלילים באופן אוטומטי.

סנן את האובייקטים שנבחרו על-ידי שמירת האובייקטים הגדולים מחמישה מיקרומטרים רבועים בלבד. התייחס לזה כאוכלוסייה אחת. באמצעות אוכלוסייה זו, החל את הפקודה מילוי חורים באובייקטים כקלט ששלב זה יוצר אוכלוסייה שתיים.

הפחיתו אוכלוסייה אחת מאוכלוסייה שתיים כדי להניב תכלילי כלמידיה מסומנים באופן חיובי המוגדרים כאוכלוסייה שלוש. השתמש בפקודה אוכלוסיית מסנן כדי להחיל מסנן גודל על אוכלוסייה שלוש. לדוגמה, שמירה על חפצים גדולים מ-25 מיקרומטר רבוע עבור תכלילים בתאים, נגועים במשך 24 שעות או יותר עבור זמני הדבקה מוקדמים, הגדירו את מסנן הגודל כך שישמור על עצמים גדולים מארבעה מיקרומטר רבוע.

מכיוון שתכלילים אלה קטנים בהרבה, מסנן הגודל מביא לאוכלוסייה של אובייקטים המוגדרים כתכלילים. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לחשב נתונים כמותיים מהתמונות כגון מספר הכללה, הכללה, גודל והכללה. היקף הזיהום בתכלילים של כלמידיה נראה בקלות ככתמים שחורים ותאי המארח או חלבון פלואורסצנטי המבטאים כלמידיה בתוך תאי המארח, וניתן לנצל את בהירותם לזיהוי אוטומטי על פני שדות ראייה ו/או טיפולים רבים.

כפי שמודגם בגרף זה, יישום עיקרי אחד הוא קביעת יחידות יוצרות הכללת כלמידיה בתאים נגועים חיים, מה שמייתר את הצורך בהליכים אימונופלואורסצנטיים, שהם גם גוזלים זמן וגם יקרים. מאפיין מרכזי נוסף של גישת הדמיה זו הוא שניתן ליישם אותה בקלות על כל זן או זן של כלמידיה. בדוגמה זו, ניתוח מהלך זמן של תאי GFP hela הנגועים באחד מארבעת המינים או הזנים הכלמידיים בוצע עבור כל אחד מהמינים והזנים הללו.

תכלילים סומנו ונותחו כדי לחשב את השטח הממוצע, אורך ההיקף ומספרם לתא בזמנים שצוינו. תכונות אלו מספקות מידע חשוב על הביולוגיה של תכלילים כלמידיים, כולל כיצד הם מתקשרים עם התא המארח. מוצג כאן סרטון של תאי דובדבן הלה הנגועים ב-GFPC, Tracom L 2 המורכב מתמונות זמן-lapse שצולמו במרווחי זמן של חמש דקות למשך 125 דקות, החל מ-48 שעות לאחר ההדבקה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקת הדמיה הפוכה זו לא רק כדי לדמיין תכלילים כלמידיים, אלא כדי לכמת דינמיקת הכללה כגון היקף אזור ההכללה ומספר התכלילים לתא. טכניקה זו חסכונית בהשוואה לטכניקות הדמיה מסורתיות יותר ועובדת עם כל המינים והזנים של כלמידיה.