אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את המנגנונים שבאמצעותם החיידק ניר דלקת קרום המוח מדביק כלי דם אנושיים in vivo. זה מושג על ידי השתלת עור אנושי על עכבר חסר חיסון, ובכך החדרת כלי דם עוריים אנושיים. בשלב השני, העכברים המואנשים נדבקים בחיידקים.

לאחר מכן מותר לזיהום להמשיך לפרק זמן קבוע מראש. בשלב האחרון מתקבלות דגימות דם ורקמות להערכת תוצאת הזיהום. בסופו של דבר, שילוב של היסטולוגיה, אימונופלואורסצנציה וניתוח דם ורקמות משמש לחקר התקדמות הזיהום בכלי הדם האנושיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו מודלים של תרבית תאים או מודלים של בעלי חיים, הוא שלראשונה אנו יכולים לצפות בפתולוגיה הקלינית האופיינית המתרחשת במהלך זיהומים אלה. מיד לאחר האיסוף, יש לנקות את משטח עור האדם עם אתנול 70%, ואז להניח אותו שטוח על משטח נקי היטב, רצוי מתחת למכסה המנוע. לאחר מכן, השתמש בדרמטום בעובי מוגדר מראש כדי לחתוך פרוסות של 200 עד 400 מיקרומטר מהחלק העליון של העור.

בדוק את תקינות הפרוסות ואז חתוך אותן עוד יותר לריבועים של שניים על שני סנטימטרים. הניחו את הריבועים לתוך PBS ולאחר מכן נקו את האזור המגולח של עכבר בז' משולב בן שישה עד שמונה שבועות עם כשל חיסוני חמור עם 70% אתנול. לאחר מריחת חומר הרדמה מקומי על מקום ההשתלה, השתמש במספריים מעוקלים כדי להסיר בזהירות את השכבה השטחית של עור העכבר באזור מעט קטן יותר מחלקי השתל, תוך הקפדה לא להפריע לכלי הדם הבסיסיים.

נע במהירות כדי למנוע ייבוש השתל, הנח את אחת מפרוסות העור האנושי מעל מיטת השתל, וודא שצד האפידרמיס פונה כלפי מעלה. יישר את קצה הרקמה ותקן אותו עם דבק רקמות. לאחר מכן התאימו בזהירות את שאר העור האנושי למיטת השתל, והניחו כמויות קטנות של דבק רקמות סביב כל קצה.

חתוך תמיד את עור האדם לגודל במקום להגדיל את מיטת השתל. לאחר שווידאתם שכל פינה קבועה, נקו את האזור בתמיסת יוד והניחו פלסטר בחוזקה אך לא בחוזקה עם צד הכרית מעל השתל, דאגו שהנשימה של החיה לא תיפגע, ואז תקנו את הפלסטר עם סרט חבישה ואפשרו לבעל החיים להתאושש על משטח חם. לאחר התעוררות, החזירו את החיה לכלוב שלה עד להזרקת החיידקים, חיסנו מחדש תרבית צלחת לילה לתרבית נוזלית.

בבוקר ההדבקה, כאשר החיידקים מגיעים לריכוז הרצוי, יש לדלל את התאים לאחת פי 10 עד למושבה השביעית היוצרת יחידות למיליליטר. לאחר מכן לאחר ההרדמה, אשר הרגעה של העכברים המושתלים על ידי הבוהן. צובטים ומניחים את החיות על כרית חום.

הניחו משחת עיניים על עיני החיה, ולאחר מכן ip. הזריקו לכל עכבר שמונה מיליגרם של העברה אנושית במי מלח. לאחר מכן, עבור כל בעל חיים, חתכו את קצה הזנב ופזרו טיפת דם קטנה מהזנב על צלחת אגר כדי לוודא שהדם סטרילי לפני ההדבקה.

לאחר מכן יש להזריק 100 מיקרוליטר מתרבית החיידקים לווריד באמצעות הזרקה רטרואורביטלית. לאחר מספר דקות, גזור שוב את קצה הזנב ופזר את דגימת הדם הזו גם על צלחות אגר טריות. כדי לבסס את היחידות היוצרות מושבת דם מיד לאחר ההדבקה, אטמו את הזנב בדבק רקמות ולאחר מכן דללו את החיסון החיידקי ופזרו אותו על צלחות אגר עם האנטיביוטיקה המתאימה.

כדי לבסס את היחידות היוצרות את מושבת החיסון בשש שעות לאחר ההדבקה, שאבו כמות קטנה נוספת של דם מכל אחד מזנבות העכברים, ולאחר מכן דללו וצלחו את טיפות הדם כפי שהודגם זה עתה כדי לבסס את היחידות היוצרות מושבה לאחר שש שעות. לאחר מכן דגרו על כל הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך הלילה כדי לבצע יצירת מושבת איברים. ספירת יחידות של בעלי החיים הנגועים.

התחל בביצוע חתך בקו האמצע בכל עכבר שהורדם. ואז לכל חיה, חותכים את הצלע ומבצעים חתך בלב. השתמש במזרק סטרילי כדי להוציא כמה שיותר דם מחלל הלב ובית החזה, והוציא אותו לצינורות סטריליים בודדים עבור כל דגימה.

לאחר מכן, הסר את האיברים המעניינים ולאחר מכן העביר את שתלי העור וחלקי עור העכבר הנלווים לצלחת סטרילית אחת לכל חיה. אפשר לדם שנאסף להיקרש במשך 15 דקות, ואז סובב אותו. לאחר מכן הוציאו את הפלזמה מהדם ואחסנו אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר.

לאחר מכן, שקלו צינורות הומוגניזציה המכילים 500 מיקרוליטר PBS כל אחד. ואז השתמש באגרוף ביופסיה סטרילי כדי לקחת דגימות ביופסיה של ארבעה מילימטר מכל רקמה שנותחה. הנח את הביופסיות בנפרד לתוך הצינורות ההומוגניזציה עם חרוז אחד של שני מילימטר בכל צינור המכיל דגימת עור.

אחסן את הרקמות הנותרות ב-4%para formaldehyde ב-4 מעלות צלזיוס למיקרוסקופיה, ושקול את הצינורות ההומוגניזציה כדי לקבוע את משקל הביופסיה. לאחר מכן הומוגניזציה של הדגימות ב-6,000 סל"ד למשך 30 שניות, וחוזרים על הומוגניזציה של העור עד שההומוגנאט מתבוסס. לבסוף, מורחים את תמיסות התאים מכל צינור על צלחות אגר טריות ומגדלים את התרביות בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

כדי לקבוע את היחידות היוצרות מושבת איברים נחשב בתוצאות מייצגות אלה. זן חיובי ל-GFP של דלקת קרום המוח N. נעשה שימוש בקבוצה C.

ספירת דם הראתה שחמש דקות לאחר הזרקה לווריד של אחת כפול 10 לשש יחידות יוצרות מושבה של חיידקים, הייתה בממוצע 1.5 כפול 10 למושבה החמישית יוצרת יחידות למיליליטר במחזור הדם. לאחר שש שעות, הספירה הממוצעת היא 4.8 כפול 10 עד למושבה הרביעית היוצרת יחידות למיליליטר ב-24 שעות. הספירה הממוצעת הייתה 2.4 כפול 10 למושבה הרביעית שיוצרת יחידות למיליליטר.

אבל בקבוצה זו של 10 עכברים, לחמישה לא היו חיידקים ניתנים לזיהוי, בעוד שלחמשת האחרים היו ספירה גבוהה יחסית. עמודות אלה בגרפים אלה מציגות את הערכים החציוניים עבור כל קבוצה של ספירות CFU שנלקחו מהעור. הדגימות מראות שלרוב העכברים יש ספירות ניכרות בעור האדם, בממוצע 2.1 כפול 10 ל-CFU הרביעי למיליגרם רקמה בשש שעות, ו-4.4 פעמים 10 ל-CFU השני למיליגרם רקמה ב-24 שעות.

דגימות העור של העכבר הנגדי לא הראו ספירת חיידקים לאחר 24 שעות ורק מספר נמוך מאוד לאחר שש שעות, מה שמדגים את ההעדפה החזקה לדלקת קרום המוח הסופית על פני כלי הדם האנושיים ברקמה המושתלת. באופן כללי, ספירת החיידקים הייתה נמוכה מאוד עד בלתי ניתנת לזיהוי באיבר השני שנדגם, אם כי שני בעלי חיים הראו ספירה, שעשויה להיות בקורלציה עם מספרי חיידקים גבוהים במחזור הדם. מודל זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את תפקידם של גורמי אלימות in vivo.

לדוגמה, בניסוי זה, זני חיידקים חסרי גלולה מסוג 4 פונקציונלית השתמשו בעכברים שנדבקו בזנים מוטנטיים אלה לא הראו הידבקות חיידקית בשתלי העור האנושיים, מה שאישר את התפקיד המכריע של גלולה מסוג 4 I בהדבקה in vivo. בתמונות קונפוקליות אלה של השתלת עור, שעתיים לאחר ההדבקה, ניתן להבחין בכלי דם אנושיים מוכתמים בלקטין UEA מצומד. ניתן לזהות בבירור את גבול העור האפידרמיס של העור וניתן לראות בבירור את ה- GFP המזהם ודלקת קרום המוח בכל כלי הדם.

שתל עור אנושי מוכתם h ו-e מדגים דלקת ודליפות כלי דם, כמו גם פקקת המרוכזת בכלי הדם הקרובים לגבול העור האפידרמלי. 24 שעות לאחר ההדבקה בכ-30% מהזיהומים, הידבקויות חיידקים בעור הובילו להתפתחות פורפורה הניתנת לזיהוי מקרוסקופי. לכן הפיתוח של הטכניקה הזו סולל את הדרך לחוקרים העוסקים במחקר ובאינטראקציות של פתוגנים מארחים לחקור את מנגנוני המחלה בהקשר של כלי דם אנושיים.