תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג חלבונים על פני השטח של נוירונים חיים ולאחר מכן להבחין בין חלבון פני השטח לחלבונים מופנמים באמצעות תיוג נוגדנים משניים דיפרנציאליים. לשם כך, נוירונים ראשוניים שגודלו על זכוכית כיסוי מודגרים עם נוגדן המכוון כנגד אפיטופ פני השטח ומודגרים כדי לאפשר הפנמה. לאחר הדגירה, נוגדן משני המסומן פלואורסצנטי מוחל כדי לזהות חלבונים חשופים על פני השטח.

לאחר מכן מוחל עודף נוגדן משני ללא תווית כדי לחסום את כל קומפלקסי הנוגדנים הראשוניים של חלבון פני השטח שנותרו. לאחר מכן הנוירונים המתורבתים עוברים סלסול ונוגדנים משניים בצבע אחר מוחל כדי לזהות חלבון מופנם. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הרמות היחסיות של חלבון מופנם לעומת פני השטח באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

בעקבות הליך זה, ניתן לקבל מהלך זמן של הפנמת חלבון פני המקור המניב מידע על שיעורי סחר החלבון בתנאים של בזיליקום וגירוי. התחל בהליך זה על ידי הכנת פתקי כיסוי לשטיפת תרבית תאים שטיפת פוליליזין 18 מילימטר כיסוי זכוכית בולית שהוכנו יום קודם לכן על ידי טבילתם בשלוש צלחות שטיפה נפרדות המכילות PBS הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת למינציה לבארות של צלחת 12 בארות, ולאחר מכן בעזרת מלקחיים, הנח את החלקות הכיסוי לכל אחת מהן. לחץ היטב על כל תלוש כיסוי כדי לוודא שהוא יושב שטוח בבסיס הדגירה של הבאר למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ניתן לבצע פרוטוקול זה באמצעות קליפת עכבר E 15 או היפופוטם עכברוש E 18 קמפי.

בהדגמה זו משתמשים בקליפות עכבר. הניחו את קליפות המוח מחצי המלטה או המלטה אחת של עוברים על קרח באיינור של מיליליטר אחד המכיל PBS עם סידן ומגנזיום והניחו על קרח. לאחר מכן, בעזרת מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד, הסר את ה- PBS מרקמת קליפת המוח.

לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסה אחת של DNA של פאפה לרקמת קליפת המוח מחצי המלטה של עוברים. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. פעמיים במהלך תקופת הדגירה, החלק בעדינות את הצינור כדי לערבב את התוכן לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה פסטר סיליקון מלוטשת להבה כדי להחזיר בעדינות את הרקמה 10 עד 15 פעמים עד לקבלת פיזור תאים.

מעטים, אם נותרו גושי רקמה לא מנותקת, הימנעו מיצירת בועות. שכב בזהירות את תרחיף התאים המנותק על כרית של שלושה מיליליטר של 4% BS, A ב-BSS של האנק עם תוספים. ואז בצנטריפוגה ספסל עם צנטריפוגת רוטור מתנדנדת החוצה ב 100 פעמים G למשך שבע דקות.

לאחר הסיבוב, הסר בזהירות את הסופרנטנט תוך הקפדה לא לשאוב את כדור התא. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיום נוירו-בסיסי שלם, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את התאים הגלולים. לאחר מכן, השתמש בציטומטר המו כדי לקבוע את ריכוז התאים החיים.

רק תאים בהירים בשלב צריכים להיחשב חיים מיד לפני הציפוי. שאפו את תמיסת סרום הלמינציה העודפת מהחלקות הכיסוי בבארות והחליפו אותה במדיום תרבית נוירונים ראשוני. לאחר מכן הוסף 75,000 עד 100,000 נוירונים ראשוניים לכל באר.

תרבית הנוירונים עד 21 יום בתווך נוירו-בסיסי ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ביום השביעי, ובכל שבוע לאחר מכן, הוסף פלואורו אנטי-מיטוטי, דאוקסי אורידין אורידין כדי למנוע צמיחת יתר של גליה ולבצע שינוי חצי בינוני. במהלך השבוע הראשון בתרבית, נוירונים פיתחו סוכות דנדריטיות כפי שמוצג בתמונה זו של תרבית בת יומיים. בשבוע השני עד השלישי, הם התבגרו ויעברו סינפטוגנזה.

רשת נרחבת של תחזיות מודגמת באיור זה שצולם ב-14 יום במבחנה כדי לסמן חלבונים חשופים על פני השטח מעניינים, להוסיף את הנוגדן הראשוני ישירות למדיום המותנה בריכוז המתאים. יש לבדוק כל מצב בשלושה עותקים ניתן להשתמש בארבעה בקרות, סרום קדם חיסוני או נוגדנים המזהים אזורים תוך-תאיים של החלבון שאינם נחשפים במהלך אקסוציטוזיס באותו דילול כמו הנוגדן הראשוני של הבדיקה. החזירו את התאים לאינקובטור התרבית למשך שעה, שעתיים או ארבע לאחר הדגירה שאפו את המדיום המכיל נוגדנים, שטפו את הבארות פעם אחת בעדינות אך במהירות עם PBS.

הוסף את טמפרטורת החדר על ידי הוספת תמיסה לבארות, ואז שאיפה. לאחר מכן מוסיפים 4%para פורמלדהיד טרי ומדגרים למשך חמש דקות. הוסף את טמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים לאחר הקיבוע.

הסר את תמיסת הפרה פורמלדהיד מהבארות והשליך אותה למיכל פסולת נוזלית במכסה האדים. לאחר מכן שטפו במהירות את התאים שלוש פעמים עם PBS כמו קודם. השאירו את הכביסה השלישית במקומה כך שניתן יהיה להסיר את החלקת הכיסוי בקלות.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את החלקות הכיסוי מהצלחת ולהניח אותם עם צד התא כלפי מעלה על דף פרם על הבסיס או המכסה של צלחת תרבית חד פעמית. שאר פרוטוקול הצביעה יבוצע על משטח זה בעדינות תמיסת חסימת פיפטה של PBS 5% BSA על התאים כדי לגרום לטיפה מעוגלת בצורת בועה על הכיסוי להחליק כך שלא תתייבש. דגירה למשך 30 דקות.

חשוב לזכור לא להוסיף חומר ניקוי לתמיסת החסימה. בשלב זה, אין לחדור לתאים כאשר יש לסמן רק חלבונים על פני התא. לאחר החסימה, שאפו את התמיסה החוסמת, ולאחר מכן כדי לסמן חלבונים חשופים על פני השטח, מרחו נוגדן משני עם תווית פלואורסצנטית, ולאחר מכן דגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, שאפו את הנוגדן המשני ושטפו את החלקות הכיסוי פעמיים עם PBS למשך חמש דקות בכל פעם כדי לחסום כל חלבון על פני התא שאינו קשור לנוגדנים המשני המסומן.

דגרו על הנוירונים הבלתי חדירים עם ריכוז גבוה של נוגדנים משניים לא מסומנים בן לילה. בטמפרטורת החדר. הדגירה של הלילה היא קריטית.

תקופות דגירה קצרות יותר לא יחסמו לחלוטין אף נוגדן ראשוני שאינו קשור במלואו על ידי הנוגדן המשני המסומן. למחרת, שטפו את החלקות הכיסוי פעמיים למשך חמש דקות כל אחת עם PBS כמו קודם. לאחר מכן יש לתקן את התאים עם פורמלדהיד 4%para במאגר פוספט למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לאחר הסרת הקיבוע.

שוטפים במהירות את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן לתיוג תוך-תאי, סלסל וחסום את התאים עם PBS המכיל 5% BSA ו- 0.1% טריטון X 100 בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר החדירה, הסר את פתרון החסימה.

דואגים שהחלקות הכיסוי לא יתייבשו. הוסיפו נוגדן משני עם תיוג שונה ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הנוגדן המשני השני, שטפו את הכיסוי שלוש פעמים למשך חמש דקות עם PBS.

לאחר מכן שטפו אותם בקצרה עם תושבת מים דה-יונים. הכיסוי מחליק על מגלשות זכוכית עם מדיום הרכבה מימי המכיל חומר נגד דהייה ומאפשר להם לאחסן את המגלשות בחושך בארבע מעלות צלזיוס לשימור אופטימלי של האות הפלואורסצנטי. דמיין את תאי הכתם החיסוני במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מסנני העירור והפליטה המתאימים.

השתמש באותם פרמטרים של רכישת הדמיה עבור כל השכפולים והתנאים שלאחר ההדמיה. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית כגון Fiji Image J או Metamorph כדי לקבוע את הצפיפות המשולבת של אזורי עניין סטנדרטיים או תכונות פונטה, כגון מספר וגודל כדי לקבוע אם גן שש הקשור להתקף או אומר שש היה נוכח על פני השטח של הנוירון והופנם ממנו. תיוג צבע כפול של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות מתורבתים בוצע כמתואר בסרטון זה.

בתמונה זו חלבון פני התא מסומן מוצג בציאן וחלבון מופנם מוצג בירוק. צביעה כפולה המצוינת על ידי ראש החץ נצפתה רק בתא שנראה לא בריא כדי לקבוע אם חלבון שהופנם במהלך הדגירה של הזנת הנוגדנים הממוקם בנוירונים של אנדוזומים המבטאים את סמן האנדוזום המוקדם טרנספרין mCherry היו מוכתמים חיסונית לאחר חדירה כפי שמוצג באזור זה של הסוכה הדנדריטית, הייתה חפיפה נרחבת של צביעת הנקב עם טרנספרין המאשרת כי החלבון המופנם ממוקם באנדוזומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שניתן להשתמש בנוגדנים בודדים כדי להבחין בין פני התא לבין מאגרי חלבון מופנמים.