הזרקה מערכתית של תאי גזע / אב עצביים בעכברים עם EAE כרוני

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעביר תאי אב גזע עצביים למערכת העצבים המרכזית באמצעות הזרקה תוך ורידית בעכברים הסובלים מדלקת מוח אוטואימונית ניסיונית, מודל מחלה המחקה טרשת נפוצה. זה מושג על ידי הפקת תאי אב גזע עצביים, או NPCs מהאזור התת-חדרי של המוח מעכברים בוגרים. השלב השני הוא תיוג גנטי של NPCs בטכנולוגיית וקטור ויראלי לזיהוי ומעקב אחר תאים in vivo.

לאחר מכן, נוירוספרות מתפשטות לתרחיף תא בודד, מושעה מחדש בצפיפות הרצויה ומוזרקת לווריד הזנב של עכברי EAE בשיא המחלה. בסופו של דבר, פתולוגיה ואימונוהיסטוכימיה של איברים ורקמות לאחר המוות מבוצעות כדי לזהות ולאפיין את התפלגות ההישרדות והאינטגרציה של תאי גזע מוזרקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה זעיר פולשנית, בטוחה ויעילה להשתלת תאי גזע ואב למערכת העצבים הדלקתית.

שיטה זו מסייעת לענות על שלוש שאלות מפתח הקשורות לבטיחות ויעילות של תאי גזע המוזרקים באופן מערכתי במודלים של מחלות דלקתיות של מערכת העצבים. ההדגמה החזותית של שיטה זו שימושית במיוחד עבור מדענים צעירים מכיוון שהיא מסייעת בהבנת השלבים הניסיוניים הקריטיים מבידוד תאי גזע במוח ועד הכנה להזרקה מערכתית במודל עכבר לטרשת נפוצה, הצעד הראשון הוא לאסוף יחד את כל הפתרונות הדרושים לדיסקציה. שימוש בטכניקה סטרילית נכונה.

הניחו מוח מבודד טרי על מטריצת פורס מוח. השתמש בשני סכיני גילוח כדי לייצר חתכים עטרתיים, שני מילימטרים מהקוטב הקדמי של המוח, למעט המסלולים האופטיים ושלושה מילימטרים אחוריים לחתך הקודם. הניחו את פרוסות המוח על צלחת פטרי נקייה ועבדו תחת מיקרוסקופ מנתח כדי לבודד את רקמת האזור התת-חדרית.

לאחר טחינת הרקמה, הוסיפו אותה ל -30 מיליליטר של תמיסת עיכול שהוכנה ומסוננת בעבר. יש לנער בעדינות ולדגור במשך 30 דקות, תוך ניעור כל 15 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של צמיחה מלאה.

בינוני או CGM על ידי פיפטינג. תחילה עם P 1000, ולאחר מכן עם פיפטה P 200. לאחר שמגיעים למתלה תא בודד, הביאו אותו עד חמישה מיליליטר עם CGM והעבירו לבקבוק חדש.

הניחו את התאים באינקובטור ואפשרו לנוירוספרות להיווצר במשך חמישה עד שבעה ימים. כשהוא מוכן, אוספים את המתלה לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את החך ב -200 מיקרוליטר CGM.

נתק את הנוירוספרות באופן מכני על ידי העברתן דרך קצה פיפטה P 200 100 עד 150 פעמים. הביאו את המתלים למיליליטר אחד עם CGM. לאחר מכן, יש לדלל במדויק את המתלים.

מערבבים את הנפח המתאים עם כתם חיוני וממלאים ציטומטר המו כדי לקבוע את ספירת התאים. השעו מחדש את התאים בריכוז הנכון והעבירו לבקבוק חדש. חזור על שלבים אלה כל ארבעה עד חמישה ימים כדי לסייע בזיהוי תאים מושתלים in vivo.

NPCs מתמרים עם וקטורים ויראליים המקודדים לגנים מדווחים 72 שעות לאחר התמרת NPC. הביטוי של גנים מדווחים פלואורסצנטיים ניתן לאימות על ידי אימונופלואורסצנציה או ציטומטריית זרימה. כשהוא מוכן, קצור את ה-GFP המבטא נוירוספרות על ידי צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה מצטברת תאים ודגרו למשך 10 דקות. אחזר את התאים והשהה אותם בעדינות כדי לקבל תרחיף תא בודד. הקפדה להימנע מבועות אוויר.

לאחר ספירה ודילול התאים, שמור את תרחיף התאים על קרח עד שהוא מוכן לשימוש. ברגע שהנוירוספרות מוכנות, אחזר עכברים שהוכנו בעבר לשמש כמודל עכבר למערכת העצבים המרכזית. טיפול בנזק צריך להתרחש בשיא ביטוי המחלה.

התחל בהנחת העכברים בקופסת חימום למשך כ-10 דקות כדי לאפשר לווריד הזנב להתרחב. כשהוא מוכן, העבר עכבר אחד מתיבת החימום למסננת עכבר. סגור את המסנן כדי להגביל את התנועה ולבודד את הזנב.

עקר את אזור ההזרקה על הזנב בתמיסה מקומית מתאימה. מלאו מזרק אינסולין של מיליליטר אחד ב-150 מיקרוליטר של תרחיף תאים והקפידו להסיר את כל הבועות. מקם את הווריד על פני השטח הגביים של הזנב ומקם את המחט במקביל לווריד בחלק התחתון האמצעי של הזנב.

כאן הווריד קרוב יותר לפני העור. ובכך מקל על ההליך. הכנס בעדינות את המחט לווריד והבטיח את מיקומה הנכון על ידי משיכת כמה מיקרוליטרים של דם.

לאחר מכן יש להזריק לאט את התמיסה לווריד הזנב לאחר ההזרקה, הסר את המחט והפעל לחץ למשך מספר שניות כדי להאט את הדימום. הנח את העכבר בכלוב טרי ופקח עד להתאוששות. חזור על אותו הליך עבור כל העכברים בנקודות זמן ניסוי שנקבעו מראש.

דגימות נאספות מבעלי חיים מטופלים ומבוקרים ומנותחות כדי לקבוע חדירה ושילוב של NPCs למערכת העצבים המרכזית ולרקמות אחרות כאשר הם מתרבים כנוירוספרות NPCs מבטאים סמנים של פעילות מיטוטית כגון פוספו היסון H 3 המוצג בירוק ושל תאים עצביים לא ממוינים כמו קן ב מוצג באדום כאשר מצופים בתנאי התמיינות מתאימים, NPCs מבטאים סמנים האופייניים לשלוש השושלות העצביות כגון סמן אסטרוליה, GFAP, הסמן העצבי, חלבון הקשור למיקרו צינורי 2, וסמני גליה אוליגו דיל O ארבע וגרעיני החלבון הבסיסיים של המיאלין מוכתמים נגדית ב-MPCs לא מובחנים dpi שאמורים להיות יעילים מבחינה טיפולית לאחר ההשתלה חייבים לבטא מולקולות הידבקות פני התא הכוללות CD 44 ותת-יחידת אלפא ארבע של האנטיגן המאוחר מאוד ארבע. דוגמאות אלה מראות כי NPCs מתמרים מבטאים GFP, הן כנוירוספרות מתפשטות והן בעת התמיינות במבחנה בעת נסיגת גורם גדילה. NPCs סינגניים המוזרקים באופן מערכתי בעכברי EAE נמצאים כמעט אך ורק באזורים פריוסקולריים של נזק למערכת העצבים המרכזית המסומן על ידי החצים הן במוח והן בחוט השדרה עד 45 יום לאחר ההשתלה.

שלב מפתח בהליך זה הוא דיסוציאציה של תאים. למעשה, הכנת תרחיף תא בודד היא בסיסית כדי למנוע מלחציים או אגרגטים שעלולים להוביל לחסימת כלי דם לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים ברפואה רגנרטיבית שחקרו פרוטוקולים זעיר פולשניים להעברה יעילה של תאי גזע לא מחזוריים למוחם של חיות מעבדה קטנות, ובפרספקטיבה קרובה לבני אדם שנפגעו ממחלות נוירולוגיות דלקתיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, יש לקוות שתהיה לך הבנה ברורה של הבעיות הקשורות לבידוד, הכנה והזרקה מערכתית של עמדות ספציפיות לרקמות בחיות מעבדה עם מחלות מוח.