שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes
January 16th, 2015
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת משקעים שונה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתכנן שיטת משקעים אקסוזומית שונה המציעה אלטרנטיבה מהירה, ניתנת להרחבה ויעילה לבידוד אקסוזומים מהשתן. זה מושג על ידי הסרת תאים מתים גדולים ופסולת תאים מדגימת השתן על ידי צנטריפוגה, והחטט המכיל את אקסוזומי השתן מועבר לצינור טרי. בשלב השני, הגלולה מומסת בתמיסת בידוד המכילה DTT כדי להסיר חלבון נפילת סוס TAM.
לאחר צנטריפוגה נוספת, הסופרנטנט נטול ה-TP מודגר עם מגיב TC מהיר אקסו למשך הלילה כדי לזרז את האקסוזומים למחרת. הדגימות שטופלו במגיב TC המהיר של אקסו עוברות צנטריפוגה בפעם האחרונה כדי להשיג את גלולת האקסוזום. בסופו של דבר, ניתן לבצע תהליכים במורד הזרם כגון כתם מערבי ו-QPCR בזמן אמת על האקסוזומים כדי לזהות את הסמנים הביולוגיים המעניינים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו סינון אולטרה צנטריפיקציה ומשקעים הוא ששיטת הזרוע אינה דורשת שלבי הסמכה אולטרה, קלה לביצוע מהירה יחסית, תוך מתן תפוקת אקסוזום גבוהה וטהורה יחסית לניתוח מולקולרי לאחר מכן לפני איסוף השתן. ב -3.125 מיליליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז טרי שהוכן לכלי קיבול סטרילי ריק, ולאחר מכן לאסוף כ -10 מיליליטר של שתן ריק ראשון בכלי הקיבול. העבירו את הדגימה לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר.
שימו לב, דגימת שתן של 24 שעות שנאספה יכולה לשמש גם לבידוד אקסוזום על ידי אחסון בארבע מעלות צלזיוס. סובב את הצינורות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 17,000 GS ו-37 מעלות צלזיוס כדי להסיר או להפריד פסולת תאית מאקסוזומים בשתן. לאחר מכן, הקפד לא להפריע לגלולה, העביר את הסופרנטנט לצינור טרי והשהה מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של תמיסת בידוד.
דגרו את הגלולה עם DTT בריכוז סופי של 200 מיליגרם למיליליטר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבולת הדגימה כל שתי דקות. לאחר מכן, כאשר הגלולה מומסת לחלוטין, הוסף לדגימה 500 מיקרוליטר של תמיסת בידוד וסובב מיד את המתלה שהתקבל.
אסוף את הסופרנטנט עם הסופרנטנט שנאסף בעבר והשהה מחדש, את הגלולה החדשה ב-50 מיקרוליטר של תמיסת בידוד. כדי שניתוח דף SDS יבודד את האקסוזומים, דגרו תחילה 11 מיליליטר של הסופרנטנט המאוגד עם 3.3 מיליליטר של מגיב TC מהיר אקסו בארבע מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפחות. לאחר צנטריפוגת הדגירה, הדגימה, ולאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי לניתוח דף SDS והגלולה המכילה את האקסוזומים בשתן משמשת למיצוי D-N-A-R-N-A או חלבון, או מאוחסנת במינוס 80 מעלות צלזיוס.
השתמש בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי לקבוע את ריכוזי ה-DNA וה-RNA של כל מיצוי על ידי מדידת הספיגה ב-260 ו-280 ננומטר עם שני מיקרוליטרים של דגימה כאן. שחזור שונה של ניתוח דף SDS וזיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות ניתוח דם מערבי מוצג בנתיבים עם שתן לא מעובד ונצפו איסורי חלבון כדורי השתן הראשונים המתאימים ל-90 עד 100 קילודלטון המצביעים על נוכחות והסרה של חלבון נפילת הסוסים TAM בהתאמה בנתיבי הכדורים הסופיים של הסופרנטנט והאקסוזום. רצועת חלבון נפילת הסוסים TAM לא נצפתה המצביעה על הסרה של חלבון נפילת הסוסים TAM בשלבים המוקדמים יותר וכתוצאה מכך תפוקת כדורי אקסוזום מוגברת.
בניסוי זה זוהו סמנים ביולוגיים אלכס ו-TSG 1 0 1 גם כאשר נעשה שימוש בכמויות נמוכות של דגימה המצביעות על כדור אקסוזום טהור מאוד לניתוח סמנים ביולוגיים והיעדר חלבונים מסיסים בשפע, כולל חלבון נפילת הסוסים TAM לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלת כליות כרונית להשתמש באקסוזומים מבודדים בשתן לגילוי ואבחון מוקדם של נפרופתיה סוכרתית.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
כתב היד הזה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת משקעים משודרגת. השיטה שואפת לספק חלופה מהירה, ניתנת להרחבה ויעילה לבידוד אקסוזומים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה
- מחקר אקסוזומים
רקע
- אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המעורבות בתקשורת בין-תאית.
- בידוד אקסוזומים משתן יכול לספק תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים שונים.
- שיטות עכשוויות עשויות להיות ארוכות ופחות יעילות.
- טכניקת משקעים משודרגת יכולה לשפר את התאוששות האקסוזומים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה מהירה לבידוד אקסוזומים משתן.
- לשפר את יכולת ההרחבה והיעילות של מיצוי אקסוזומים.
- להקל על יישומי משך כמו זיהוי סמני ביומרקר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- צנטריפוגה להסרת תאים גדולים ופסולת מדגימות שתן.
- המסת הגלולה בתמיסת בידוד המכילה DTT.
- דגירה של העל-תמיסה עם ריאגנט exo quick TC למשך הלילה.
- צנטריפוגה סופית כדי להשיג את גלוחת האקסוזומים.
תוצאות עיקריות
- השיטה המשופרת מצליחה לבודד אקסוזומים משתן.
- ניתן להשתמש באקסוזומים לניתוחים עוקבים כמו מעבר מערבי ו-qPCR.
- הסרה יעילה של מזהמים משפרת את טוהר האקסוזומים המבודדים.
- הפרוטוקול ניתן להרחבה לגודל דגימות גדול יותר.
מסקנות
- טכניקת המשקעים המשופרת היא שיטה מעשית לבידוד אקסוזומים.
- גישה זו יכולה לייעל מחקר אקסוזומים במחקרים ביולוגיים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים לחקור יישומים נוספים של אקסוזומים מבודדים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolating urinary exosomes enables non-invasive biomarker discovery for kidney disease, supporting early detection and mechanistic de-risking in renal therapeutic development. The modified precipitation method offers a scalable, high-yield alternative to ultracentrifugation, improving reproducibility and throughput for target validation workflows. This approach enhances predictive confidence in biomarker identification by reducing contamination and increasing exosome purity for downstream molecular profiling.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating exosomes that reflect cell-type-specific cargo from nephron segments.
- Operational Value: Provides a quick, scalable method for isolating exosomes without ultracentrifugation, reducing technical variability.
- Predictive Value: Increases confidence in biomarker detection by yielding high-purity exosome pellets enriched in miRNA and mRNA for profiling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated exosome samples for downstream assays such as Western blot and qPCR to detect disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Standardizes exosome isolation through a precipitation-based workflow compatible with high-throughput sample processing.
- Assay Readiness: Generates consistent exosome yields suitable for RNA extraction and protein analysis, supporting reproducible biomarker screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from biomarker discovery in urine to preclinical validation by providing disease-relevant exosome cargo.
- Mechanistic De-risking: Enables detection of altered exosome content under renal dysfunction, clarifying pathophysiological pathways.
- Predictive Confidence: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking exosome biomarkers to early signs of diabetic nephropathy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling non-invasive biomarker isolation that informs target selection and preclinical continuity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating exosomes that reflect cell-origin-specific cargo from urinary tract cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative exosome outputs suitable for biomarker assay development and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of exosome-associated RNA and protein levels via qPCR and Western blot for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects urinary exosome biomarkers to preclinical models of kidney disease through disease-relevant cargo detection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized isolation platform applicable across multiple urine sample types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by reducing mechanistic ambiguity through pure exosome isolation for biomarker profiling.
- Operational Value: Improves standardization and scalability by eliminating ultracentrifugation steps and simplifying workflow.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by increasing confidence in early biomarker detection for kidney disease.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of renal therapeutic candidates based on robust exosome biomarker data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in exosome biology and molecular techniques such as RNA extraction and qPCR.
- Needs access to centrifugation equipment, ExoQuick TC reagent, and spectrophotometric tools for RNA/DNA quantification.
- Demands standardization across teams to ensure consistent incubation times, temperatures, and reagent handling.
- Requires adaptation considerations when applying the method to different urine collection protocols or storage conditions.
- Practical limitations include the need for overnight incubation and careful handling to avoid exosome loss during transfers.
