שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes
16 בינואר 2015
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת משקעים שונה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתכנן שיטה שונה להשקעת אקסוזומים, המהווה חלופה מהירה, ניתנת להרחבה ואפקטיבית לבידוד אקסוזומים משתן. הדבר מושג תחילה על ידי הסרת תאים מתים גדולים וששאריות תאים מדגם השתן באמצעות צנטריפוגציה, והנוזל המכיל את האקסוזומים השתניים מועבר למבחנה נקייה. בשלב השני, המשקוב מומס בתמיסת בידוד המכילה DTT כדי להסיר TAM horse fall protein.
לאחר צנטריפוגציה נוספת, מדגרירים את העלייה (supernatant) הנקיים מ-TP עם ריאגנט exo quick TC למשך לילה כדי להשקיע את האקסוזומים למחרת. את הדגימות שעובדו עם ריאגנט exo quick TC מעבירים לצנטריפוגציה אחת אחרונה כדי לקבל את משקע האקסוזומים. לבסוף, ניתן לבצע תהליכים המשכיים כגון Western blot ו-realtime QPCR על האקסוזומים כדי לזהות את הביומארקרים הרלוונטיים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סינון באולטרה-צנטריפוגה והשקעה, הוא שהשיטה אינה דורשת שלבי אולטרה-צנטריפוגה, היא קלה לביצוע ומהירה יחסית, ועדיין מספקת תנובה גבוהה וטהורה יחסית של אקסוזומים לצורך אנליזה מולקולרית המשך. לפני איסוף השתן, יש להוסיף 3.125 milliliters של תערובת מעכבי פרוטאז שהוכנה טרית לכלי סטרילי ריק, ולאחר מכן לאסוף לכלי כ-10 milliliters של שתן מההשחנה הראשונה. העבירו את הדגימה לתוך מבחנות קוניות של 15 milliliter.
שימו לב, ניתן להשתמש גם בדגימה של שתן שנאספה במשך 24 שעות לצורך בידוד אקסוזומים, על ידי אחסוןה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. סובבו את המבחנות למשך 10 דקות ב-17,000 GS ובטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להסיר או להפריד שיירי תאים מהאקסוזומים בשתן. לאחר מכן, תוך הקפדה לא להפריע למשקע, העבירו את הנוזל העליון למבחנה נקייה והמיסו מחדש את המשקע ב-500 µL של תמיסת בידוד.
דגרו את המשקע עם DTT בריכוז סופי של 200 mg/mL בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. ערבבו את הדגימה במכשיר וורטקס כל שתי דקות. לאחר שהמשקע התמוסס לחלוטין, הוסיפו לדגימה 500 µL של תמיסת בידוד וסובבו מיד את התוצאה במ centri-fuge להשקעה.
אגדו את העילאי עם העילאי שנאסף קודם לכן, ושחזרו את המשקע החדש ב-50 µL של תמיסת בידוד. לצורך ניתוח SDS page לבידוד האקסוזומים, דגרו תחילה 11 mL של העילאי המאוחד עם 3.3 mL של ריאגנט exo quick TC בטמפרטורה של 4 °C למשך 12 שעות לפחות. לאחר הדגירה, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה, העבירו את העילאי למבחנה נקייה לצורך ניתוח SDS page, ואת המשקע המכיל את האקסוזומים השפחתיים השתמשו להפקת DNA, RNA או חלבון, או אחסנו בטמפרטורה של 80- °C.
השתמשו בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי לקבוע את ריכוזי ה-DNA וה-RNA של כל מיצוי, על ידי מדידת הבליעה ב-260 ו-280 ננומטר עם שני מיקרוליטרים של דגימה. שחזור משוער של אנליזת SDS page וזיהוי סמנים ביולוגיים באמצעות אנליזת western blood מוצג בנתיבים; בשתן שלא עבר עיבוד ובמשקע השתן הראשון נצפו פסי חלבון התואמים ל-90 עד 100 קילו-דלטון, המעידים על נוכחותו של חלבון TAM horse fall והסרתו, בהתאמה, בנתיבים של העל-משקע הסופי ושל משקע האקסוזומים. פס חלבון TAM horse fall לא נצפה, מה שמעיד על הסרת חלבון TAM horse fall בשלבים מוקדמים יותר, דבר שהוביל לעלייה בתשואת משקע האקסוזומים.
בניסוי זה, הסממנים הביולוגיים Alex ו-TSG 1 0 1 זוהו גם כאשר נעשה שימוש בכמויות קטנות של דגימה, מה שמעיד על משקע אקסוזומים טהור מאוד לניתוח סממנים ביולוגיים והיעדר חלבונים ממיסים בשפע, כולל חלבון ה-TAM horse fall לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלות כליות כרוניות להשתמש באקסוזומים המבודדים משתן לצורך גילוי מוקדם ואבחנה של נפרופתיה סוכרתית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת שיקיע מודפית. שיטה זו נועדה לספק חלופה מהירה, ניתנת להרחבה ואפקטיבית לבידוד אקסוזומים.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר אקסוזומים
רקע
- אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המעורבות בתקשורת בין-תאית.
- בידוד אקסוזומים משתן יכול לספק תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים שונים.
- שיטות נוכחיות עשויות להיות גוזלות זמן ופחות יעילות.
- טכניקת שיקוע משופרת עשויה להגביר את השחזור של אקסוזומים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה לבידוד אקסוזומים משתן.
- שיפור השליפה והיעילות של הפקת האקסוזומים.
- הספקת יישומים המשך, כגון זיהוי סמנים ביולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנטריפוגציה להסרת תאים גדולים ושאריות מדגימות שתן.
- המסה של המשקע בתמיסת בידוד המכילה DTT.
- דגירה של הנוזל העליון עם ריאגנט exo quick TC למשך לילה.
- צנטריפוגיה סופית לקבלת משקע האקסוזומים.
תוצאות עיקריות
- השיטה המשופרת מבודדת בהצלחה אקסוזומים משתן.
- ניתן להשתמש באקסוזומים לניתוחים המשכיים כגון Western blot ו-qPCR.
- הסרה יעילה של מזהמים משפרת את טוהר האקסוזומים המבודדים.
- הפרוטוקול ניתן להרחבה עבור גדלי דגימות גדולים יותר.
מסקנות
- טכניקת השקיעה המשופרת היא שיטה יעילה לבידוד אקסוזומים.
- גישה זו יכולה לייעל את המחקר על אקסוזומים במגוון מחקרים ביולוגיים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון יישומים נוספים של אקסוזומים מבודדים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד אקסוזומים משתן מאפשר גילוי לא-פולשני של סמנים ביולוגיים למחלות כליות, ובכך תומך בזיהוי מוקדם ובצמצום סיכונים מכניסטיים בפיתוח טיפולים רנליים. שיטת השקיעה המודגשת מציעה חלופה ניתנת להרחבה ובעלת תפוקה גבוהה לאולטרה-צנטריפוגציה, ובכך משפרת את השחזוריות ואת קיבולת העיבוד עבור תהליכי תיקוף של מטרות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי סמנים ביולוגיים על ידי הפחתת זיהומים והגברת טוהר האקסוזומים עבור פרופילינג מולקולרי המשכי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד אקסוזומים המשקפים מטען ספציפי לסוג התא ממקטעי נפרון.
- ערך תפעולי: מספק שיטה מהירה וניתנת להרחבה לבידוד אקסוזומים ללא צורך באולטרה-צנטריפוגציה, ובכך מפחית את השונות הטכנית.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון בזיהוי של סמני ביולוגיים (biomarkers) על ידי הפקת משקעי אקסוזומים בטוהר גבוה, המועשירים miRNA ו-mRNA לצורך פרופיל.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת דגימות אקסוזומים שעברו תיקוף לבדיקות המשך, כגון Western blot ו-qPCR, לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים למחלה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בידוד אקסוזומים באמצעות תהליך עבודה מבוסס שיקוע, התואם עיבוד דגימות בהספק גבוה.
- מוכנות לבדיקה: הפקת תנובות אקסוזומים עקביות המתאימות לחילוץ RNA וניתוח חלבונים, התומכות בסריקה הדירה של סמנים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: תומך במעבר מגילוי סמנים ביולוגיים בשתן לוולידציה פרה-קלינית, על ידי אספקת מטען אקסוזומלי רלוונטי למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר זיהוי של תוכן אקסוזומלי משונה תחת תפקוד כלייתי לקוי, ובכך מבהיר נתיבים פתופיזיולוגיים.
- ביטחון חיזוי: מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון, על ידי קישור סממנים ביולוגיים אקסוזומליים לסימנים מוקדמים של נפריה סוכרתית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים, ומאפשרת בידוד לא פולשני של סמנים ביולוגיים המנחים את בחירת המטרה ואת ההמשכיות הפרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי בידוד אקסוזומים המשקפים מטען ספציפי למקור התא מתאי דרכי השתן.
- סריקה: מספק תפוקות אקסוזומית כמותיות וניתנות לשחזור, המתאימות לפיתוח בדיקות לסממנים ביולוגיים ולסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של רמות חלבון ו-RNA הקשורים לאקסוזומים באמצעות qPCR ו-Western blot לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין סממנים ביולוגיים של אקסוזומים משתן לבין מודלים פרה-קליניים של מחלות כליות, באמצעות זיהוי מטען רלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת בידוד סטנדרטית וניתנת להרחבה, הישימה על סוגי דגימות שתן מרובים ותוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את תיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות בידוד אקסוזומים טהורים לצורך פרופיל של סמני ביולוגים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) על ידי ביטול שלבי אלטרה-צנטריפוגציה ופישוט זרימת העבודה.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטאות יעילות יותר לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי הגברת הביטחון בגילוי מוקדם של סמנים ביולוגים למחלות כליה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפולים כלייתיים בהתבסס על נתונים חסונים של סממני ביולוגים של אקסוזומים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה של אקסוזומים ובטכניקות מולקולריות כגון מיצוי RNA ו-qPCR.
- נדרשת גישה לציוד צנטריפוגה, לרכיב ExoQuick TC ולכלים ספקטרופוטומטריים לכימות RNA/DNA.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין הצוותים כדי להבטיח זמני דגירה, טמפרטורות וטיפול ברכיבים עקביים.
- נדרש שקלול של התאמות בעת יישום השיטה לפרוטוקולי איסוף שתן או לתנאי אחסון שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בדגירה למשך הלילה וטיפול זהיר למניעת אובדן אקסוזומים במהלך העברות.
