שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את הפעלת המשלים על ידי נוגדנים נגד תאי דם אדומים (RBCs) בסרום של מטופל. דבר זה מושג על ידי דגירה של תאי דם אדומים עם סרום של מטופל בנוכחות נוגדן חוסם ל-C5 כדי להשרות שיקוע של C4 ו-C3 על פני השטח של תאי הדם האדומים. לאחר מכן, צובעים את תאי הדם האדומים בעזרת נוגדנים ל-C4 ול-C3 המסומנים פלואורסצנטית, ואת כמות שיקוע המשלים על תאי הדם האדומים ניתן לנתח בשיטה חלופית באמצעות ציטומטריה זרימתית.

תאי הדם האדומים (RBCs) מדוגרים עם סרום של המטופל בהיעדר anti C five כדי להשרות ליזיס בתיווך המשלים. ניתן לקבוע את אחוז תאי הדם האדומים שעברו ליזיס על ידי מדידת כמות ההמוגלובין ששוחררה מהתאים באמצעות ספקטרומטריה. היתרון המרכזי של טכניקה חדשה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת המוליזה או בדיקת אנטי-גלובולין המשמשות באבחון שגרתי, הוא אופיה הכמותי, המאפשר לנו לזהות הבדלים סוב-אופטימליים בהפעלת המשלים.

אליזבת ברוק, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלנו, תדגים את הפרוצדורות. התחילו בשטיפה של תאי דם אדומים מסוג 0 שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן הדגרירו את המשקע בתמיסת Roma lane בריכוז 0.5% ביחס של 1:2 למשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים נוספות, אחסנו אותם כתמיסה בריכוז 3% ב-PBS טרי ב-4 °C לצורך ניתוח של שיקוע קומפלימנט על תאי הדם האדומים באמצעות ציטומטריה זרימה. ראשית, בצעו אינאקטיבציה תרמית לכמות הרצויה של סרום מטופל למשך 30 דקות ב-56 °C. בזמן שהסרום עובר טיפול תרמי, שטפו את תאי הדם האדומים שעובדו ב-brola שלוש פעמים בבופר Roal לאחר השטיפה האחרונה.

שחזר את המשקע ב-vbg plus plus בדילול של 0.5%. לאחר מכן, הוסף לכל באר בלוח בעל 96 באערים עם תחתית עגולה: 25 µL של RBCs בריכוז 0.5%, 37.5 µL של סרום AB טרי ו-37.5 µL של anti C five בריכוז 200 µg/mL. לאחר מכן, הוסף לכל באר את סרום המטופל שעבר אינאקטיבציה בחום בריכוז המתאים, תוך השלמה עם סרום AB שעבר אינאקטיבציה בחום במידת הצורך, והכלל גם בקרה שלילית.

השתמשו ב-VBG plus plus כדי להביא כל באר לנפח סופי של 150 µL, ולאחר מכן דגרו את הפלטה כשהיא מכוסה בנייר אלומיניום מסוג E IA למשך שעה וחצי עד שעתיים ב-37 °C עם ניעור. לאחר הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS המועשר ב-0.5% BSA, ולאחר מכן סמנו את התאים עם נוגדנים מונוקלונליים מסומנים פלואורסצנטית נגד C3 ונגד C4 בריכוז של 1 µg/mL. דגרו את התאים למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, ולאחר שטיפת הפלטה שלוש פעמים, השעיקו שוב את ה-RBCs ב-150 µL של PBS פלוס 0.5% BSA לכל באר.

נעביר את תרחיפי התאים לפלטת 96 בארות חדשה בעלת תחתית עגולה, ולאחר מכן נטען את הפלטה לציטומטר הזרימה, ונפריד את התאים הבודדים מהדובלטים באמצעות תרשים פיזור קדמי (forward scatter plot). נגדיר את השער (gate) עבור תאי RBC בודדים ולאחר מכן נבחר את ערוץ הגילוי המתאים עבור האותות הפלואורסצנטיים. נכמת את התוצאות באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה החציונית לצורך ניתוח המוליטי כמותי, נחמם ונפעיל את סרום המטופל ונשטוף את תאי ה-RBC שעובדו ברומיין כפי שהודגם זה עתה.

לאחר דגירה של ה-RBCs עם משלים וסרום של המטופל כפי שהודגם, אך ללא ה-anti C five, סובבו את התאים למשך חמש דקות ב-664 GS עם האטה מופחתת. לאחר מכן, העבירו בזהירות 90 microliters של על-מילי (supernatant) ללוח מיקרוטיטר חדש, תוך הקפדה לא להעביר את התאים השלמים ולהימנע מיצירת בועות אוויר, ומדדו את הבליעה ב-414 עד 690 בספקטרופוטומטר. חשבו את ההמוליזה כאחוז מהליזה של דגימת RBCs שדוגרה במים מזוקקים.

באיור ראשון זה מוצגים תרשימי פיזור מייצגים עבור תאי דם אדומים (RBCs) שטופלו ב-brola; ניתן לראות כאן בחירה מתאימה של שער (gating) עבור תאי RBCs בודדים. בדרך כלל, כ-95% מתאי ה-RBCs נופלים בתוך שער תא בודד זה. בהיסטוגרמות אלו מוצגים תוצאות מייצגות להשפעה של אנמיה המוליטית אוטואימונית או aha.

שקיעת C4 ו-C3 בסרום של המטופל מוצגת כצפוי, כאשר כמות גדולה יותר של סרום מהמטופל מובילה לשקיעת קומפלימנט מרובה יותר. באופן מעניין, שקיעת הקומפלימנט מתרחשת בשני שיאים חיוביים נבדלים. סביר להניח שדבר זה אינו נגרם מהטרוגניות באוכלוסיית ה-RBC מכיוון שה-RBCs נלקחו מתורם יחיד, אם כי הגורם לתופעה זו עדיין נחקר. עוצמות הפלואורסצנציה החציוניות של הדגימות מוצגות בגרפים קוויים אלו כדי להראות את ההדירות של בדיקות שקיעת C4 ו-C3.

שימו לב לשונות הרחבה בשיקוע של דגימות החולים השונות עם AH H. לבסוף, ניתן להבחין בגרפים אלו בנתונים מניסוי המוליזה של דגימת סרום של חולה ahha המכילה נוגדנים עצמיים לכדוריות דם אדומות (RBCs). טיטרציה עם דגימת הסרום מניבה עקומה ברורה הניתנת לשחזור עם מעכב קומפלימנט מתאים, כגון anti C five.

ניתן לבצע טיטרציה להפסקת האות ההמוליטי, כפי שמוצג בגרף זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן המדידה של הפעלת המשלים על ידי נוגדנים ספציפיים לתאי דם אדומים, בין אם באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה של שקיעת C3 או C4, ובין אם באמצעות בדיקה המוליטית כמותית.