שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את הפעלת המשלים על ידי נוגדנים כנגד כדוריות דם אדומות או RBCs בסרום המטופל. זה מושג על ידי דגירה של כדוריות דם אדומות עם סרום המטופל בנוכחות נוגדן חוסם נגד C 5 כדי לגרום לתצהיר C ארבע ו-C3 על פני ה-RBC. לאחר מכן, ה-RBCs מוכתמים בנוגדנים נגד C 4 ו-Anti C3 המסומנים פלואורסצנטית, ולאחר מכן ניתן לנתח את כמות שקיעת המשלים על ה-RBCs על ידי זרימה ציטומטרית בשיטה חלופית.

תאי הדם האדומים מודגרים בסרום המטופל בהיעדר אנטי C חמש כדי לגרום לליזה מתווכת משלים. לאחר מכן ניתן לקבוע את אחוז ה-RBCs שעברו ליזה על ידי מדידת כמות ההמוגלובין המשתחרר על ידי התאים על ידי ספקטרומטריה. היתרון העיקרי של טכניקה חדשה זו על פני שיטות קיימות כמו המוליזה או בדיקת אנטיגלובולין המשמשת באבחון שגרתי הוא שהיא כמותית באופייה ואנו יכולים לזהות הבדלים לא אופטימליים בהפעלת המשלים.

אליזבת ברוק, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלנו, תדגים נהלים: התחל בשטיפת תאי דם אדומים מסוג אפס שלוש פעמים עם PBS, ולאחר מכן דגר את הגלולה בתמיסת נתיב רומא של 0.5% ביחס של אחד לשניים למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים נוספות, אחסן אותם כתמיסה של 3% ב-PBS טרי בארבע מעלות צלזיוס כדי לנתח את שקיעת המשלים על ה-RBCs על ידי זרימה ציטומטרית. ראשית, יש לנטרל את הכמות הרצויה של סרום המטופל למשך 30 דקות בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס בזמן שהסרום מטופל בחום. שטפו את כדוריות הדם האדומות שטופלו בברולה שלוש פעמים במאגר רואל לאחר השטיפה האחרונה.

Resus השעו את הגלולה ב-vbg פלוס פלוס בדילול של 0.5%. לאחר מכן בפנינת זכוכית 25 מיקרוליטר של 0.5% RBCs, 37.5 מיקרוליטר של סרום AB טרי ו-37.5 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם למיליליטר, אנטי C חמישה לכל באר של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר מכן הוסף את סרום המטופל המומת בחום לכל באר בריכוז המתאים, השלם עם סרום AB מומת בחום לפי הצורך וכולל גם בקרה שלילית.

השתמש ב-VBG plus plus כדי להביא כל באר לנפח סופי של 150 מיקרוליטר ולאחר מכן דגר את הצלחת המכוסה בנייר כסף E IA למשך שעה וחצי עד שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS בתוספת 0.5% BSA, ולאחר מכן תייגו את התאים במיקרוגרם אחד למיליליטר. ארבעה נוגדנים חד-שבטיים המסומנים בפלואורסצנט נגד C3 ואנטי C דוגרים על התאים למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, ולאחר מכן לאחר שטיפת הצלחת שלוש פעמים, משהים מחדש את תאי הדם האדומים ב-150 מיקרוליטר PBS בתוספת 0.5% BSA לכל אחד.

ובכן העבירו את מתלי התאים לצלחת תחתונה עגולה חדשה של 96 באר, ואז העמיסו את הצלחת על ציטומטר הזרימה, הפרידו את התאים הבודדים מהכפולות באמצעות עלילת פיזור קדימה. הגדר את השער על ה-RBCs הבודדים ולאחר מכן בחר את ערוץ הזיהוי המתאים עבור האותות הפלואורסצנטיים. כמת את התוצאות באמצעות עוצמת הקרינה החציונית לניתוח המוליטי כמותני, חמם והפעל את סרום המטופל ושטוף את ה-RBCs שטופלו ברומיין כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן לאחר הדגירה של תאי הדם האדומים עם משלים וסרום מטופל כפי שהודגם זה עתה, אך ללא האנטי C 5, סובב את התאים למשך חמש דקות ב-664 GS עם האטה מופחתת. לאחר מכן, העבירו בזהירות 90 מיקרוליטר של סופרנטנט ללוחית מיקרוטיטר חדשה, הקפידו לא להעביר את התאים השלמים ולהימנע מיצירת בועות אוויר, ולאחר מכן מדדו את הספיגה בארבע 14 עד שש 90 באקספרס ספקטרופוטומטר. ההמוליזה כאחוז מהליזה של דגימה של תאי דם אדומים שהודגרו במים טהורים.

באיור ראשון זה, ניתן לראות כאן תרשימי פיזור מייצגים עבור RBCs שטופלו בברולה שער מתאים ל-RBCs בודדים. בדרך כלל, כ-95% מה-RBCs נופלים בתוך שער התא היחיד הזה. בהיסטוגרמות אלה תוצאות מייצגות את ההשפעה של אנמיה המוליטית אוטואימונית או AHA.

סרום המטופל בתצהיר C 4 ו-C3 מוצג כצפוי, יותר סרום מטופל מוביל ליותר שקיעה משלימה. באופן מוזר, שקיעת המשלים מתרחשת בשתי פסגות חיוביות נפרדות. זה כנראה לא נגרם על ידי הטרוגניות באוכלוסיית ה-RBC מכיוון שה-RBCs נלקחים מתורם יחיד, למרות שהגורם לתופעה עדיין נחקר, עוצמות הקרינה החציונית של הדגימות משורטטות בגרפים קוויים אלה כדי להראות את יכולת השחזור של מבחני התצהיר C four ו-C3.

שימו לב לשונות הרחבה בתצהיר של דגימות חולי AH H השונות. לבסוף, ניתן לראות נתונים מבדיקה המוליטית של דגימת סרום של מטופל ahha המכילה נוגדנים עצמיים ל-RBCs בגרפים אלה. טיטרציה עם דגימת הסרום מניבה עקומה ברורה הניתנת לשחזור עם מעכב משלים מתאים כגון אנטי C five.

ניתן לטטר את האות המוליטי כפי שמודגם בגרף זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את הפעלת המשלים על ידי נוגדנים ספציפיים לתאי דם אדומים, בין אם על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי של תצהיר C3 או C ארבע או על ידי בדיקה המוליטית כמותית.