Name: שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: למד שיטות כמותיות לאיתור הפעלת משלים על ידי נוגדנים בתאי דם אדומים באמצעות ציטומטריית זרימה וספקטרומטריה. השיטות מאפשרות זיהוי רגיש של שינויים תת-מיטביים בהפעלת המשלים לשיפור האבחנה הקלינית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SZ וDW לקבל מענק בלתי מוגבל של ViroPharma.

1. הכנה של תאי דם אדומים שטופלו ברומלין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דם אדומים לשטוף 0 הקלידו-3x עם 1x PBS (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 נפח של תאי דם אדומים צפופים עם שני כרכים של פתרון ברומלין 0.5% עבור 10 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3x עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לאחסן את התאים כפתרון 3% ב 4 ° C ב1x PBS למשך שבוע אחד לפחות. </li></ol> 2. C3 ו-C4 הפקדת ניתוח על פני כדוריות דם אדומים על ידי FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום להשבית את הכמות הנדרשת של סרום מטופל (או במקור נוגדן אנטי RBC אחר) על ידי חימום הדגימה ל30 דקות ב56 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו RBCs טופלו ברומלין שלוש פעמים בVBG - (5 מ&quot;מ ורונל, 150 mM NaCl, 0.05% pH ג&#39;לטין 7.4) ו resuspend אותם בVBG + + (VBG - + 2 מ&quot;מ MgCl 2 + 10 מ&quot;מ CaCl 2) לתת פתרון 0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את המרכיבים הבאים לתוך צלחת מסביב לתחתית עם פנינת זכוכית (ואו ערבוב נכון): 25 μl RBCs 0.5%, 37.5 סרום μl טרי AB (מקור משלים) ו37.5 μl אנטי C5 200 מיקרוגרם / מיליליטר. Anti-C5 הוא יקר ועלול להיות קשה להשגה. אפשר לשקול שימוש בסרום C5-/C6-/C7- או C8 לקוי במקום סרום AB ואנטי-C5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סרום מטופל בכל טוב לריכוז סופי של 0.1-33%. נכון להבדלים בריכוז בסרום לכל גם בשל שימוש בסרום AB חום מומת. הוספת VBG + + כדי לקבל נפח סופי של 150 μl / טוב. צלחת לסגור בנייר ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1.5-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בזמן טלטולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמים RBCs שלוש עם PBS + BSA 0.5% (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כותרתו fluorescently אנטי C3 ונוגדנים חד שבטיים אנטי C4 או שברי Fab שלהם (כדי להפחית את התלכדות) בארגון ה-BSA + 0.5% PBS לריכוז סופי של מיקרוגרם / מיליליטר 1. כאן התפתח מנהג אנטי C3-Alexa פלואוריד 488 ו647 נוגדנים חד שבטיים אנטי C4-Alexa פלואוריד משמשים; הבחירה של thesדואר תוויות ניאון מאפשרת זיהוי בו זמני של C3 ו-C4 על ידי FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30-45 דקות בטמפרטורת חדר עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBCs 3x לשטוף עם BSA + 0.5% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend RBCs 150 μl בBSA +0.5% PBS ו פיפטה אותם לצלחת חדשה (להיפטר מפניני הזכוכית לפני ניתוח FACS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח FACS. תאים בודדים נפרדים מכפילויות בFSC-זומם פיזור; להגדיר את השער על פני כדוריות הדם האדום אחת; בחר את הערוץ המתאים לזיהוי אותות הקרינה (למשל FITC וAPC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תוצאות שימוש בעוצמת הקרינה החציונית. </li></ol> הערה: אפשר להשתמש בשליטת אלוטיפ (שכותרת למשל fluorescently אנטי IL6 העכבר IgG1). עם זאת, מומלץ לכלול ביקורת שלילית אמיתית למשל על ידי דוגרים RBCs ללא סרום מטופל (רק בסרום א.ב.) או ללא מקור משלים (סרום AB חום מומת וסרום חולה חום מומת),ד אז כתם אלה עם אותו אנטי-C3-Alexa פלואוריד 488 ואנטי C4-Alexa פלואוריד 647 נוגדנים. זה נותן שליטה תקפה יותר מאשר שליטת אלוטיפ במקרה של תאי דם אדומים 12, למרות פקדים השונים אלה בדרך כלל לתת את אותה תוצאה, שלילית. 3. Assay המוליטית כמותיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום להשבית את הכמות הנדרשת של סרה מטופל (או במקור נוגדן אנטי RBC אחר) על ידי חימום דקות המדגם 30 ב56 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBCs 3x לשטוף עם VBG - ופעם אחת עם VBG + +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את המרכיבים הבאים לתוך צלחת מסביב לתחתית עם פנינת זכוכית (לערבוב נכון): תאי דם אדום 35 μl 3%, 25 μl סרום טרי AB (מקור משלים) ו1-50% בסרום חולה. נכון להבדלים בריכוז בסרום באמצעות סרום AB חום מומת. הוספת VBG + + כדי לקבל נפח סופי של 150 μl / טוב. צלחת לסגור בנייר ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.5-2 עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cצלחת entrifuge ב664 XG במשך 5 דקות עם האטה מופחתת (למשל האטה לעצירה מלאה ב2-3 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות פיפטה 90 supernatant μl בצלחת microtiter חדש. חשוב בשלב זה כדי למנוע בועות אוויר ולמניעת לקחת יחד תאים שלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד A414/690 בספקטרופוטומטר מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביע תמוגה כאחוז מתמוגה של RBCs מדגם עם מים טהורים. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מבחני לעיל הם שחזור וחזקים. הם קלים לביצוע וניתן לבצע אותם עם דגימות רבות באותו הזמן (בצלחת 96 היטב). לפיכך, גישה זו תהיה גם מתאימה למערכת אוטומטית לחלוטין, כגון: מערכת רובוט ELISA. בניגוד לטכניקות המשמשות כיום, מבחני האלה הם כמוני וזה יעזור לדוגמא: במחקר של ההשפעה של מעכבי משלים. יתר על כן, הפרשנות היא אובייקטיבית, אשר מהווה שיפור של מבחני המשמשים כיום. לשניהם יש מבחני שלב אחד קריטי. חשוב בניתו...

נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להיגרם על ידי עירוי של תאי דם אדומים מבטאים אנטיגן שאינו נמצא בתאי דם אדומים נמען. הלו, נוגדנים אלו יכולים לגרום לתגובות קשות חריפות המוליטית עירוי עקב להשלים הפעלה על העירוי 5 הבא. באנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA), חולים נוגדנים עצמיים כנגד תאי הדם האדום שלהם. זה מוביל לאישור מואץ של התאים באמצעות האינטראקציה של IgG חייבת RBCs עם Fcγ-קולטנים על phagocytes בטחול ו / או במקרה של נוגדנים עצמיים מסוגלים להפעיל משלימים באמצעות קולטנים משלימים בכבד 6,7. הפעלת השלמה המוחלטת של תפקוד וכתוצאה מכך המוליזה intravascular היא נדירה אך לעתים קרובות קטלנית. מואץ, משלים הרס RBC בתיווך הנגרם על ידי או תוצאותיו הלו או נוגדנים עצמיים באנמיה חריפה וחוסר חמצן ברקמות ומכאן שעלול להיות קטלני. הנוגדנים העצמיים בAIHA מסווגים בנוגדנים חמים וקרים, תלויg על הטמפרטורה האופטימלית הם נקשרים לתאי דם אדומים (37 מעלות צלזיוס או נמוכה, בהתאמה). הנוגדנים הם בדרך כלל החמים של אלוטיפ IgG והנוגדנים הקרים של IgM אלוטיפ 8,9. AIHA יכולה להיות משנית לדוגמא lymphoprolyferative הפרעות, מחלות רקמת חיבור, גידולים מוצקים, זיהומים או סמים, אבל ב50% מהמקרים AIHA היא אידיופטית 9. איתור של gammaglobulins (למשל. IgG או IgM) ומשלים כבול לRBCs של המטופל מתבצע באמצעות antiglobulin הישיר semiquantitative מבחן (קומבס) (DAT). בDAT RBCs מטופל מודגרת עם אנטי IgG או אנטי C3d. מופע של התלכדות RBC מדגים את נוכחותם של רכיבים משלימים מצורפים או IgG מחייב. זיהוי שלו הלו או נוגדנים עצמיים בסרום של המטופל מתבצע באמצעות הבדיקה העקיפה antiglobulin (IAT). בIAT, RBCs המבחן טופלו ברומלין מודגרת עם סרום מטופל, נשטף ולאחר מכן הודגרו עם אנטי-hאומן IgG. במקרה RBCs כבר רגיש עם הווה נגד RBC IgG בהתלכדות סרום המטופל יתרחש. נוגדני IgM לRBCs ישירות יובילו להתלכדות על דגירה של RBCs מבחן טופלו ברומלין עם סרום מטופל. התלכדות RBC בבדיקת קומבס הישירה או בIAT מוערך מבחינה ויזואלית או על ידי העין במבחנה או על ידי טעינת המדגם על עמודת Sephadex קטנה מפרידה RBCs agglutinated ואחת לפי גודל 1. טכניקה משמשת לעתים קרובות אחרת למדוד הפעלה משלים על פני כדוריות דם אדום היא assay המוליטית 1, שבו היכולת של סרום מטופל כדי לגרום להמוליזה (משלים בתיווך) של תאי דם אדומים שטופלה ברומלין 10 מוערכת. המבחן הוא כאמור חיובי כאשר את supernatant לאחר צנטריפוגה מוכתם אדום בשל המוגלובין שוחרר ונחשב לשלילי אם הוא נשאר חסר צבע. שתי מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם semiquantitative, מאז Seru הגבוה ביותרהדילול מ &#39;הוא כונה שבמבחן הוא עדיין חיובי. מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם מבחני חזקים המשמשים באופן שיגרתי באבחון. מאז מבחני אלה הם semiquantitative ותלויים בניסיונו של טכנאי ביצוע assay הם אינם מתאימים ללמוד להבדלים של הפעלת משלים על פני כדוריות דם אדומים, במידת צורך בעת הערכת היעילות של מעכבי משלים. לכן, פיתחנו שני מבחני כמותיים כדי לקבוע הפעלת ההשלמה על ידי נוגדנים (אוטומטי) לתאי דם אדומים, שנתאר במאמר זה. ראשית, פיתחנו assay כדי למדוד את התצהיר של שברי הפעלה של משלים C3 ו-C4 על פני כדוריות דם אדומים (איור 1 א). ב assay זה, מסוג 0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC), סרום טרי AB (מקור משלים) ונוגדנים חד שבטיים אנטי C5 (Eculizumab). במהלך inc זהubation, בתצהיר C3 ו-C4 יתרחש אם הסרום מכיל המטופל להשלים הפעלת נוגדנים נגד RBC. על מנת למנוע תמוגה RBC על ידי הפעלת משלים במורד הזרם נוגדן חד שבטי אנטי C5 חסימה הוא הוסיף. בשלב בא, בתצהיר C3 ו-C4 על פני כדוריות הדם האדום הוא זוהה על ידי FACS באמצעות נוגדנים חד שבטיים או שכותרתו fluorescently Fab-ברים מגיבים עם C3 ו-C4, בהתאמה. Gating על פני כדוריות דם אדום בודדות הוא חשוב כדי להבטיח את אמינות התוצאות. יתרונות של שיטה זו כוללים שנפח קטן של חומר מטופל נדרש, תשלים את ההפעלה בשלב מוקדם של המפל מוערך והשיטה לשחזור וכמותיים. יתרון נוסף של התבוננות בשני C3 ו-C4 הוא שניתן להבחין בין ההפעלה הקלסית וקטיני המסלול (גם C3 ו-C4 בתצהיר) וההפעלה החלופית מסלול (רק בתצהיר C3). השימוש בתאי הדם אדום שטופלה ברומלין במקום RBCs מטופל מגביר את הרגישות של כאומר. Assay השני מתבסס על assay משמש כיום המוליטית (איור 1). סוג-0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC) וסרום טרי AB (מקור משלים). אם משלימים מופעל על ידי נוגדנים נגד RBC מטופל, תמוגה RBC תלויה המינון תתרחש, מה שמוביל לשחרור של המוגלובין. כמות ההמוגלובין שפורסם היא לכימות על ידי מדידת הספיגה שלה ב414 ננומטר בsupernatant לאחר שצנח RBCs השלמה ומקוטע. הספיגה בקורלציה עם הכמות של המוליזה התרחשה. בניגוד לassay משמש כיום, פרוטוקול זה מאפשר לאובייקטיבי, ערכם הכמותי של המוליזה כי הוא מאוד לשחזור ואינו תלוי באדם לפרש את assay. יישום של שיטות אלה תואר ב11, שבם השימוש הפוטנציאלי של C1-מעכב כמעכב משלים בAIHA היה שלtudied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>פרסניוס קאבי</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ברביטל</td><td>פגרון</td><td>0261</td><td>כימיקל זה כפוף לתקנות תרופות.</td></tr><tr><td>נתרן ברביטל</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>כימיקל זה כפוף לתקנת התרופות.</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>מרק</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 אמין צבע תגובתי</td><td>פירס</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 אמין צבע תגובתי</td><td>פירס</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ואלפא; C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל FACS עם הלייזרים המתאימים.</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר (למשל ספקטרום מולטיסקאן)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>ניתן להשתמש בכל ספקטרופוטומטר עם טווח אורכי הגל הנכון</td></tr> BD <tr><td>FACSDiva תוכנה v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>ניתן להשתמש בכל תוכנת ניתוח FACS תואמת</td></tr><tr><td>Bromelain&nbsp;</td><td>סנקווין</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-induced נוגדן בתאי דם אדומים

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להוביל להשלמת הפעלה וכתוצאה מכך אישור מואץ באמצעות קולטנים משלימים בכבד (המוליזה extravascular) או מוביל לתמוגה intravascular של RBCs. Alloantibodies (למשל ABO) או נוגדנים עצמיים לאנטיגנים RBC (כפי שניתן לראות באנמיה המוליטית אוטואימונית, AIHA) המוביל כדי להשלים את ההפעלה הם מזיקים ויכול להיות - במיוחד כאשר מובילים לתמוגה intravascular - 1 קטלני. נכון לעכשיו, להשלים את ההפעלה בשל (אוטומטי)-נוגדנים על פני כדוריות דם אדום נבחנת במבחנה על ידי שימוש בבדיקת קומבס משקפת בתצהיר משלים בRBC או על ידי assay המוליטית nonquantitative משקף RBC תמוגה 1-4. עם זאת, כדי להעריך את היעילות של מעכבי משלים, הוא חובה שיש טכניקות כמותיות. כאן אנו מתארים שתי טכניקות כאלה. ראשית, assay כדי לזהות C3 ו-C4 בתצהיר על תאי דם אדומים הנגרמים על ידי נוגדנים בסרום חולה מראשsented. לשם כך, ניתוח FACS משמש עם נוגדנים נגד C3 או אנטי-C4 שכותרתו fluorescently. בשלב הבא, assay המוליטית כמותית מתואר. המוליזה ב assay זה, להשלים בתיווך הנגרמת על ידי סרום מטופל נמדדת שימוש ביצוע של זיהוי spectrophotometric של המוגלובין שפורסם. שני מבחני האלה הם מאוד לשחזור וכמותיים, בהנחיית מחקרים של הפעלת משלים-Induced נוגדן.

איור 2 א מראה עלילת פיזור נציג לRBCs. gating המתאים לRBCs היחיד שניתן לראות בדה FSC-W - FSC-עלילה (P1). בדרך כלל סביב 95% מתאי הדם האדומים ליפול בתוך השער הזה P1 (תאים בודדים), אבל כאשר אחוז גבוה של סרום חולה משמש, זה יכול לרדת ל 70-80%, במיוחד כאשר אנטי RBC IgM נמצא בסרום החולה. נציג תוצאות להשפעת סרום מטופל AIHA על תצהיר C4 מוצגות באיור 2 ועל תצהיר C3 באיור 2C....

כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את הפעלת המשלים על ידי נוגדנים נגד תאי דם אדומים (RBCs) בסרום של מטופל. דבר זה מושג על ידי דגירה של תאי דם אדומים עם סרום של מטופל בנוכחות נוגדן חוסם ל-C5 כדי להשרות שיקוע של C4 ו-C3 על פני השטח של תאי הדם האדומים. לאחר מכן, צובעים את תאי הדם האדומים בעזרת נוגדנים ל-C4 ול-C3 המסומנים פלואורסצנטית, ואת כמות שיקוע המשלים על תאי הדם האדומים ניתן לנתח בשיטה חלופית באמצעות ציטומטריה זרימתית.תאי הדם האדומים (RBCs) מדוגרים עם סרום של המטופל בהיעדר anti C five כדי להשרות ליזיס בתיווך המשלים. ניתן לקבוע את אחוז תאי הדם האדומים שעברו ליזיס על ידי מדידת כמות ההמוגלובין ששוחררה מהתאים באמצעות ספקטרומטריה. היתרון המרכזי של טכניקה חדשה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת המוליזה או בדיקת אנטי-גלובולין המשמשות באבחון שגרתי, הוא אופיה הכמותי, המאפשר לנו לזהות הבדלים סוב-אופטימליים בהפעלת המשלים.אליזבת ברוק, פוסט-דוקטורנטית במעבדה שלנו, תדגים את הפרוצדורות. התחילו בשטיפה של תאי דם אדומים מסוג 0 שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן הדגרירו את המשקע בתמיסת Roma lane בריכוז 0.5% ביחס של 1:2 למשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים נוספות, אחסנו אותם כתמיסה בריכוז 3% ב-PBS טרי ב-4 °C לצורך ניתוח של שיקוע קומפלימנט על תאי הדם האדומים באמצעות ציטומטריה זרימה. ראשית, בצעו אינאקטיבציה תרמית לכמות הרצויה של סרום מטופל למשך 30 דקות ב-56 °C. בזמן שהסרום עובר טיפול תרמי, שטפו את תאי הדם האדומים שעובדו ב-brola שלוש פעמים בבופר Roal לאחר השטיפה האחרונה.שחזר את המשקע ב-vbg plus plus בדילול של 0.5%. לאחר מכן, הוסף לכל באר בלוח בעל 96 באערים עם תחתית עגולה: 25 µL של RBCs בריכוז 0.5%, 37.5 µL של סרום AB טרי ו-37.5 µL של anti C five בריכוז 200 µg/mL. לאחר מכן, הוסף לכל באר את סרום המטופל שעבר אינאקטיבציה בחום בריכוז המתאים, תוך השלמה עם סרום AB שעבר אינאקטיבציה בחום במידת הצורך, והכלל גם בקרה שלילית.השתמשו ב-VBG plus plus כדי להביא כל באר לנפח סופי של 150 µL, ולאחר מכן דגרו את הפלטה כשהיא מכוסה בנייר אלומיניום מסוג E IA למשך שעה וחצי עד שעתיים ב-37 °C עם ניעור. לאחר הדגירה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS המועשר ב-0.5% BSA, ולאחר מכן סמנו את התאים עם נוגדנים מונוקלונליים מסומנים פלואורסצנטית נגד C3 ונגד C4 בריכוז של 1 µg/mL. דגרו את התאים למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, ולאחר שטיפת הפלטה שלוש פעמים, השעיקו שוב את ה-RBCs ב-150 µL של PBS פלוס 0.5% BSA לכל באר.נעביר את תרחיפי התאים לפלטת 96 בארות חדשה בעלת תחתית עגולה, ולאחר מכן נטען את הפלטה לציטומטר הזרימה, ונפריד את התאים הבודדים מהדובלטים באמצעות תרשים פיזור קדמי (forward scatter plot). נגדיר את השער (gate) עבור תאי RBC בודדים ולאחר מכן נבחר את ערוץ הגילוי המתאים עבור האותות הפלואורסצנטיים. נכמת את התוצאות באמצעות עוצמת הפלואורסצנציה החציונית לצורך ניתוח המוליטי כמותי, נחמם ונפעיל את סרום המטופל ונשטוף את תאי ה-RBC שעובדו ברומיין כפי שהודגם זה עתה.לאחר דגירה של ה-RBCs עם משלים וסרום של המטופל כפי שהודגם, אך ללא ה-anti C five, סובבו את התאים למשך חמש דקות ב-664 GS עם האטה מופחתת. לאחר מכן, העבירו בזהירות 90 microliters של על-מילי (supernatant) ללוח מיקרוטיטר חדש, תוך הקפדה לא להעביר את התאים השלמים ולהימנע מיצירת בועות אוויר, ומדדו את הבליעה ב-414 עד 690 בספקטרופוטומטר. חשבו את ההמוליזה כאחוז מהליזה של דגימת RBCs שדוגרה במים מזוקקים.באיור ראשון זה מוצגים תרשימי פיזור מייצגים עבור תאי דם אדומים (RBCs) שטופלו ב-brola; ניתן לראות כאן בחירה מתאימה של שער (gating) עבור תאי RBCs בודדים. בדרך כלל, כ-95% מתאי ה-RBCs נופלים בתוך שער תא בודד זה. בהיסטוגרמות אלו מוצגים תוצאות מייצגות להשפעה של אנמיה המוליטית אוטואימונית או aha.שקיעת C4 ו-C3 בסרום של המטופל מוצגת כצפוי, כאשר כמות גדולה יותר של סרום מהמטופל מובילה לשקיעת קומפלימנט מרובה יותר. באופן מעניין, שקיעת הקומפלימנט מתרחשת בשני שיאים חיוביים נבדלים. סביר להניח שדבר זה אינו נגרם מהטרוגניות באוכלוסיית ה-RBC מכיוון שה-RBCs נלקחו מתורם יחיד, אם כי הגורם לתופעה זו עדיין נחקר. עוצמות הפלואורסצנציה החציוניות של הדגימות מוצגות בגרפים קוויים אלו כדי להראות את ההדירות של בדיקות שקיעת C4 ו-C3.שימו לב לשונות הרחבה בשיקוע של דגימות החולים השונות עם AH H. לבסוף, ניתן להבחין בגרפים אלו בנתונים מניסוי המוליזה של דגימת סרום של חולה ahha המכילה נוגדנים עצמיים לכדוריות דם אדומות (RBCs). טיטרציה עם דגימת הסרום מניבה עקומה ברורה הניתנת לשחזור עם מעכב קומפלימנט מתאים, כגון anti C five.ניתן לבצע טיטרציה להפסקת האות ההמוליטי, כפי שמוצג בגרף זה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן המדידה של הפעלת המשלים על ידי נוגדנים ספציפיים לתאי דם אדומים, בין אם באמצעות ניתוח ציטומטריה של זרימה של שקיעת C3 או C4, ובין אם באמצעות בדיקה המוליטית כמותית.

methods-for-quantitative-detection-antibody-induced-complement

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מסלול קלאסי מופעל על ידי נוגדן ו לשיאו תמוגה תא היעד.

מדידת משלים Haemolytic 50% (CH 50) פעילות של סרום

מקור: נגרה, נ., ואחרים. פגוציטוזה של מקרופאגים אלוואולריים ופינוי חיידקים בעכברים. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את ההערכה של פגוציטוזיס המתווך על ידי קולטני המשלים באמצעות תאי דם אדומים של כבשים שזוהרו ב-IgM ומשלים, ולאחר מכן את קליטם על ידי מקרופאגים של עכברים. היקף הפגוציטוזה נמדד על ידי מדידת תוצר כרומוגני כחול שנוצר מחמצון דיאמינופלואורן שנוצר על ידי המוגלובין.

מידול פגוציטוזיס מתווך משלים באמצעות תאי דם אדומים אופסוניים במבחנה

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת הפעילות החיידקית בתיווך משלים של נוגדנים הנמצאים בסרום. גישה זו משלבת סרום מבודד עם חיידקים פתוגניים וחלבוני השלמה אקסוגניים. עם הדגירה, החיידקים גדלים על צלחת אגר, ואת המושבות המיוצרות מכומתים כדי למדוד את titer bactricidal בסרום.

בדיקה חיידקית בסרום לפעילות חיידקית בתיווך משלים של נוגדנים

הסרטון מדגים בדיקת עיכוב hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגנים ספציפיים. אישור של עיכוב המגלוטיציה בבאר הבדיקה והמגלוטינציה בבאר הבקרה מושג באמצעות דפוסים חזותיים ברורים. בדיקה זו ממלאת תפקיד מכריע בהערכת התגובה החיסונית, יעילות החיסון וחקר זיהומים נגיפיים בווירולוגיה ובאימונולוגיה.

בדיקת עיכוב Hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגן מטרה

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת את ההפעלה בתיווך נוגדנים של פונקציות השפעה של תאי T. הוספת נוגדן חד-שבטי ספציפי לנגיף השפעת המגלוטינין (HA) לתאי יונקים נגועים המבטאים חומצה היאלורונית גורמת להיווצרות קומפלקסים חיסוניים עם חומצה היאלורונית (HA). עם החדרת תאי T מהונדסים המבטאים קולטני Fc וכתב לוציפראז, תאי T מופעלים על ידי קומפלקסים נוגדנים-HA, והפעלה זו מזוהה על ידי הוספת מצע לוציפראז ומדידת הביולומינסנציה המיוצרת.

מדידת ההפעלה של פונקציות אפקט בתיווך Fc על ידי נוגדנים HA

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים (ADCP) על ידי פגוציטים של חלב אם. מיקרוספרות עם תווית פלואורסצנטית מצומדות לקומפלקס נוגדנים אנטיגן, משולבות עם תרחיף תאים שבודד מחלב אם כדי לגרום לפאגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים על ידי לויקוציטים פגוציטים. עם תיוג התאים עם נוגדנים נגד אנטיגן לויקוציטים נפוץ (CD45), ציטומטריית זרימה משמשת למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות של לויקוציטים פגוציטיים חיוביים במיקרוספירה המציינת את רמת פעילות ADCP.

בדיקת מבחנה למדידת פגוציטוזה תאית תלוית נוגדנים על ידי פגוציטים

בדיקת המונוציטים החד-שכבתית (MMA) היא בדיקה במבחנה המשתמשת במונוציטים ראשוניים מבודדים המתקבלים מדם מלא היקפי של יונקים כדי להעריך פגוציטוזיס בתיווך קולטן Fcγ (FcγR).

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

מטרת שיטה זו היא לקבוע את צפיפות CR1 ב אריתרופוציטים של כל נושא על ידי השוואת עם שלושה נושאים שצפיפות הCR1 של erythrocyte ידועה. השיטה משתמשת cy, לאחר כתמים חיסוני של הנבדקים ' אריתרופוציטים על ידי נוגדן אנטי CR1 שבטיים מצמידים למערכת מוגברת באמצעות phycoארימתרין (PE).

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

לכידת שינויים דינמיים בהפעלת החלבונים של תאי דם אדומים מעוררים אתגרים מתודולוגיים, כמו שימור שינויים דינמיים לגירויים חריפים לצורך הערכה מאוחרת יותר. הפרוטוקול המוצג מתאר טכניקות הכנת דגימה וצביעה המאפשרות שימור וניתוח של שינויי חלבון רלוונטיים וזיהוי לאחר מכן.

זיהוי מבוסס חיסונים של שינויים דינמיים בחלבוני תאי דם אדומים

פיתחנו שיפורים ושיטות מעודכנות לבדיקת מונוציטים-חד-שכבתיים (MMA) הקיימת, שבה נעשה שימוש במקרופאגים כדי לעזור לחזות טוב יותר את הרלוונטיות הקלינית של נוגדנים של כדוריות אדומות ברפואת עירוי ואימונולוגיה. בדיקה זו נקראת בדיקת מונוציטים-מקרופאגים (M-MA).

חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים

למד שיטות כמותיות לאיתור הפעלת משלים על ידי נוגדנים בתאי דם אדומים באמצעות ציטומטריית זרימה וספקטרומטריה. השיטות מאפשרות זיהוי רגיש של שינויים תת-מיטביים בהפעלת המשלים לשיפור האבחנה הקלינית.

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

גלה סרטונים נוספים