Name: ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: למדו לנתח את שריר Transversus Abdominis בעכברים ולהשתמש בזיהוי פלואורסצנטי כדי לדמיין צמתים נוירומוסקולריים. פרוטוקול זה מאפשר חקר מחלות מוטוריות ופתולוגיה נוירומוסקולרית ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (מספר מענק MOP 38040) ל- R.K., איגוד ניוון השרירים (ארה"ב) ל- R.K., משפחות SMA ל- R.K. ו- L.M.M, קרן SMA ל- T.H.G., וקמפיין ניוון השרירים ל- T.H.G.. L.M.M הוא מקבל של אגודת טרשת נפוצה של קנדה פוסט דוקטורט מלגת, ו R.K. הוא מקבל של קתדרה לחקר הבריאות באוניברסיטה מאוניברסיטת אוטווה.

יש לבצע את כל ההליכים על פי הסטנדרטים לטיפול בבעלי חיים שנקבעו על ידי המוסד.
1. ניתוח שרירי הבטן מהעכבר
<ol><li>לפני תחילת, לפצות 4% paraformaldehyde (PFA). זהירות: יש לשמור תמיד על PFA בתוך מכסה המנוע וללבוש ציוד מגן מתאים.</li>
	<li>המתת חסד לעכבר בשיטה מאושרת. שים לב: העכבר המוצג בסרטון היה מורדם על ידי מנת יתר של CO2 ונקע בצוואר הרחם. עכבר זה הוא עכבר פראי בן 4 שבועות על רקע היברידי CD1/C57Bl6. עכבר זה גדל במתקני בעלי החיים באוניברסיטת אוטווה מעכברים שנרכשו במקור.</li>
	<li>בצע חתך ראשוני דרך העור ברמה של הירך לחתוך דרך העור כל הדרך סביב העכבר.</li>
	<li>לקלף את העור, מושך כלפי מעלה עד שתגיע לרמה של forelimb.</li>
	<li>חותכים דרך שרירי הבטן ברמה של הירך ולהמשיך את החתך עד שתגיע לעמוד החוליות.</li>
	<li>בשלב זה, להתחיל לחתוך כלפי מעלה דרך השרירים והצלעות עד שתגיע לאיבר העליון.</li>
	<li>חותכים ישר לרוחב עד שתגיע לעמוד החוליות בצד השני.</li>
	<li>חותכים כלפי מטה עד שתגיע לנקודה שבה התחלת.</li>
	<li>שחררו את הסרעפת מלמטה (מקפידים לא לפגוע בשריר ה-TVA) והניחו אותה בתמיסת מלח עם אגירה פוספטית (PBS) בצלחת ניתוח מצופה SYLGARD עם סיכות דיסקציה של 0.2 מ"מ.</li>
	<li>הצמד את כלוב הצלעות ואת השרירים הקשורים בצלחת, צד שטחי למעלה, לוודא את השריר הוא מתוח לחלוטין.</li>
	<li>יוצקים את 1x PBS ולהחליף עם 4% PFA.</li>
	<li>מכסים ומשאירים על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
	<li>לשטוף 3x ב 1x PBS בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
</ol>* בשלב זה ניתן להשאיר את השרירים הקבועים במקרר לילה לפני הניתוח הבא.
2. בידוד שריר ה- TVA
<ol><li>כדי להמשיך בבידוד של שריר ה- TVA, תחת מיקרוסקופ נתיחה, התחל על-ידי חיתוך השריר האלכסוני החיצוני ברמה של הצלעות האחרונות (ראה איור 1 לקבלת מדריך מבואר).</li>
	<li>חותכים ישר ליד אלבה לינאה (מקפיד לא לחתוך דרך TVA להלן) עד שתגיע לתחילת השריר הפנימי אלכסוני.</li>
	<li>לאחר מכן לחתוך כדי לשחרר את abdominis rectus overlying ושרירים אלכסוניים חיצוניים מהחלק העליון של TVA להלן.</li>
	<li>הסר את כלי הדם ואת כל שומן overlying משריר TVA.</li>
	<li>שחררו את השריר מהצלעות האחרונות.</li>
	<li>חותכים סביב שולי השריר ומסירים לצלחת של 24 באר המכילה PBS.</li>
</ol>3. תיוג חיסוני ומיקרוסקופיה של שריר TVA
עבור כל השלבים הבאים, להסיר נוזל באמצעות פיפטה עדין הטה ולהשאיר את הצלחת על פלטפורמת נדנדה. אלא אם צוין אחרת, כל השלבים הבאים מבוצעים בטמפרטורת החדר.
<ol><li>דגירה ב PBS המכיל 1:1,000 פלואורסצנטי מתויגים bungarotoxin במשך 30 דקות כדי לתייג את NMJs. זה יכול להיעשות בחדר חשוך או תחת רדיד אלומיניום.</li>
	<li>לחלחל שריר על ידי הוספת 300 μl לכל באר של 2% טריטון X-100 ב PBS ולהשאיר על פלטפורמת נדנדה במשך 30 דקות.</li>
	<li>דגירה בחסימת ריאגנט (4% BSA, 1% טריטון ב PBS) במשך 30 דקות.</li>
	<li>דגירה בחסימת ריאגנט המכיל נוגדנים ראשוניים (neurofilament 1:100; חלבון vesicle סינפטית 2, 1:250) ב 4 מעלות צלזיוס לילה.</li>
	<li>לשטוף 3x ב 1x PBS.</li>
	<li>דגירה ב PBS המכיל 1:250 נוגדן משני במשך 2-4 שעות.</li>
	<li>לשטוף 3x ב 1x PBS.</li>
	<li>הר את השרירים על מגלשות זכוכית באמצעות מספיק מדיה הרכבה פלואורסצנטית ו coverslip.</li>
	<li>שקופיות מוצגות בצורה הטובה ביותר באמצעות מסנן מעבר פס כפול במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי סטנדרטי.</li>
	<li>NMJs הם בתמונה הטובה ביותר באמצעות הקרנת סדרת z על מיקרוסקופ confocal מצויד לפחות 40x מטרה.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+insights+from+transgenic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li>
<li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li>
<li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li>
<li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+peripheral+nerve%2C+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+%28SMARD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li>
<li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li>
<li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li>
<li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+translation+elongation+factor+%28eEF1A2%29+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li>
<li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li>
<li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בסרטון זה, יש לנו פרוטוקול לניתוח של שריר TVA מן העכבר עבור תיוג immunofluorescent כל ההר של NMJs בתוך השריר. אנו מציגים גם נתונים המראים כי שריר זה יכול לשמש לניתוח פתולוגיה צומת neuromuscular במודל העכבר של SMA.
הצלחה בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. חלק מהבעיות הנפוצות ביותר מפורטות להלן. ראשית: כתמים אימונוהיסטוכימיים ירודים. יכולות להיות מספר סיבות לכך, אחת הסיבות הנפוצות ביותר להיות שימוש ריאגנטים שונים לאלה המפורטים בפרוטוקול זה. PFA באיכות גבוהה מיקרוסקופיה אלקטרונים חשוב מאוד כדי להבטיח כתמים טובים, כמו גם הבחירה של נוגדנים המפורטים בפרוטוקול זה. בנוסף, בבעלי חיים מבוגרים(כלומר> 3 חודשים), מקבל כתמים באיכות טובה יכול להיות קשה יותר. הסיבה לכך היא עובי מוגבר של fascia המקיף את השריר ואת הגידול בצבירת השומן בין אלכסון חיצוני טרנוורוס abdominis. חשוב להסיר את השומן, לפני שתמשיך לכשל חיסוני. ייתכן גם שיהיה צורך להסיר חלק fascia מכסה את השריר, אשר יכול להיות מעובה. לפעמים קשה להפשיט את fascia ושומן מן השריר מבלי לגרום נזק כלשהו סיבי השריר הפרעה דפוס innervation. עם זאת, אם טכניקה זו מבוצעת בקפידה, כתמים באיכות טובה ניתן לרכוש מעכברים עד גיל שנה לפחות. בעכברים צעירים יותר(כלומרפחות מ 3 חודשים של גיל) זה לא צריך להיות נחוץ כדי לבצע כל מתגרה או הפרדה של סיבי שריר. שנית: קשה למצוא NMJs בעקבות ניתוח וכתמים. הסיבה לכך היא לעתים קרובות כי הניתוח לא השתרע מתחת לצלעות האחרונות. רוב NMJs ממוקמים ממש מתחת לצלע האחרונה ולכן יש להקפיד כדי להבטיח חלק זה של השריר כלול ניתוח. שלישית: דבקות בשריר ה-EO בשריר ה-TVA. זוהי לעתים קרובות תלונה כאשר אנשים מנסים להאריך את הניתוח מתחת לרמה של השריר הפנימי אלכסוני (IO). האזור של שריר TVA שבו IO הוא גם נוכח קשה יותר לנתח כפי שהוא יכול להיות קשה להבחין איזה שריר הוא אשר. מסיבה זו, אנחנו באופן שגרתי רק לנתח את החלק העליון ביותר של שריר TVA. ברמה זו, אין דבקות בין שרירי EO ו TVA, ולכן זה לא צריך להיות בעיה משמעותית.
מכשול משמעותי אחד לשימוש בשריר TVA, בהשוואה לשרירי התוספתן, הוא נגישות למניפולציות כירורגיות או להזרקת חומרים. סוגים אלה של ניסויים יכולים להיות חיוניים כדי לחקור את הפיזיולוגיה של NMJ בשריר נתון. למרות TVA הוא בהחלט פחות נגיש בקלות מאשר שרירים נפוצים יותר כגון tibialis anterior או gastrocnemius, עבודה קודמת הוכיחה שניתן denervate TVA על ידי פציעה כירורגית של העצבים הבין צלעיים18. לאחרונה השתמשנו גם שריר זה לניהול מקומי של חומרים תחת הרדמה כללית (נתונים שלא פורסמו). למרות ניסויים אלה יכולים לייצג אתגר טכני מתון, עבודה זו מראה כי הם אפשריים ובכך להרחיב את התועלת של שריר זה לניתוח של NMJs תחת מניפולציה פתולוגית ופיזיולוגית כאחד.
שריר TVA הוא אחד ממספר שרירים שטוחים דקים הממוקמים בכל הגוף שניתן להשתמש בהם לניתוח הרכבה שלם של דפוסי innervation. שרירים אחרים כוללים קבוצה של שרירי גולגולת פנימיים על ידי נוירונים מוטוריים שמקורם גרעין הפנים של גזע המוח, מקיף levator auris longus, auricularis מעולה, ו adductor auris longus, את הניתוחים אשר תוארו בעבר14,19. יתר על כן, השרירים המקיפים את שריר TVA, כולל EO, IO, ו rectus abdominis, ניתן גם לתייג ולהשתמש לניתוח NMJ. לניתוח מקיף של פתולוגיה NMJ במודל העכבר, חשוב לשקול מספר שרירים הממוקמים בכל הגוף ולא להגביל את הניתוח לשריר אחד. זה בא לידי ביטוי במודלים העכבר של מחלות נוירון מוטורי שבו יש הטרוגניות משמעותית ברמות של פתולוגיה NMJ בין השרירים השונים20. שונות בין שרירית כזו היא כלי בעל ערך רב כאשר חוקרים את המנגנון של פגיעות נוירון מוטורי ולכן הגבלת ניתוח לשריר יחיד יכול להפחית באופן משמעותי את הפוטנציאל של המחקר.

צמתים נוירומוסקולריים (NMJs) הם הקשר הסינפטי בין נוירון מוטורי נמוך יותר לבין סיבי שריר השלד. הם נחשבים באופן מסורתי סינפסה משולשת, המורכב נוירון (מסוף presynaptic), סיבי שריר (מסוף סינפטית פוסט), ותא מסוף שוואן1. NMJs נראה מטרות מוקדמות ומשמעותיות בפתולוגיה במגוון של מחלות נוירון מוטורי ומודלים העכבר2,3. תסמינים אופייניים כוללים denervation, שבו endplate המנוע הופך נטול innervation presynaptic, נפיחות של הטרמינל presynaptic, וירידה במורכבות של מורפולוגיה NMJ4-11. ניתן גם לציין תגובות מפצות, הכוללות נבטים סופניים ונודאליים, שבהם תהליכים אקסונליים נמשכים ממסופים סינפטיים או מתמחים שנותרו ועד לוחות קצה מנוריםמחדש 12,13. בשל המתאם ההדוק בין פעילות סינפטית מורפולוגיה NMJ, הרבה מידע ניתן להשיג על המצב התפקודי של נוירונים מוטוריים מניתוח של מורפולוגיה NMJ. כמו אובדן של NMJs לעתים קרובות מייצג את אחד ההיבטים הראשונים של פתולוגיה neuromuscular4,10, כימות ברמה של innervation יכול לתת מידע חשוב על התקדמות הפתולוגיה ואת ההשפעה הפוטנציאלית של התערבות טיפולית. יתר על כן, כמו הפסד NMJ מייצג צעד משמעותי בהתקדמות פתולוגית, הפיתוח של טיפולים שיכולים לייצב קשרים ולעודד התחדשות עשוי להניב תועלת משמעותית.
בעת ניתוח מורפולוגיה NMJ, בחירת שרירים היא בעלת חשיבות רבה. חלק מהשיקולים העיקריים עשויים לכלול סוג סיבי שריר, מיקום הגוף, וניתוח השוואתי למצבים אנושיים. בנוסף, כאשר נדרשות מניפולציות כגון הזרקת חומרים או פגיעה עצבית טראומטית, חשוב גם לשקול נגישות ניסיונית. באופן כללי, עדיף לנתח מגוון של שרירים הממוקמים בכל הגוף המשקפים מגוון של תת-סוגים של יחידות מוטוריות. לעתים קרובות, עם זאת, בחירת שרירים מושפעת על ידי קלות של ניתוח. כתוצאה מכך, ניתוח NMJ מבוצע לעתים קרובות אך ורק על שרירי נספח גדולים כגון gastrocnemius. כדי להשיג כתמי NMJ טובים בשרירים כאלה, חתך או הפרעה מכנית של סיבי שריר נדרש לעתים קרובות. כתוצאה מכך, דפוס innervation עלול להיות משובש וניתוח מקיף ואיכותי של דפוסי innervation, נבטים ו denervation נפגע לעתים קרובות. גישה חלופית היא להשתמש בשרירים שטוחים דקים שאינם דורשים חתך וניתן להכתים ולהרכיב ללא פגע, המאפשר סקירה מקיפה של כל innervation של השריר. ישנם מספר שרירים אשר ניתן להשתמש בהם לניתוח כזה, כולל קבוצה של שרירי הגולגולת, (מקיף levator auris longus, auricularis מעולה, ו adductor auris longus)14, שרירי בית החזה (למשל. טריאנגולריס סטרני) 15, ובטן (למשל transversus abdominis (TVA)) השרירים. המכשול העיקרי בשימוש בשרירים כאלה הוא המומחיות הטכנית הנדרשת כדי לנתח אותם ללא נזק.
בסרטון זה, אנו מספקים פרוטוקול לנתח ולבצע תיוג immunofluorescent של שריר TVA מן העכבר כדי לאפשר ניתוח מקיף של דפוס innervation ומורפולוגיה NMJ. שריר TVA הוא שריר עווית איטי בעיקר הכולל את השכבה העמוקה ביותר של שריר הבטן והוא innervated על ידי העצבים הבין צלעיים התחתון. עבודה קודמת הוכיחה את זה להיות פגיע מאוד באופן עקבי פתולוגיה במספר מודלים של העכבר של מחלת נוירון מוטורי בילדות ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA) ובמודלים אחרים של העכבר של ניוון נוירון מוטורי תחילת מוקדם4,16. לכן אנו מציעים כי TVA הוא שריר שימושי עבור ביצוע ניתוח NMJ נוירופתיות היקפיות.

<table><tbody><tr><td>תמיסה מימית פרפורמלדהיד (16%)</td> <td>מדעי מיקרופסקופיה אלקטרונית</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיצים זוויתיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>תלוי בספק המקומי</td><td>השתמש בזה כדי להכין צלחת דיסקציה להצמדת שריר</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני נוירופילמנט (2H3),</td><td>Supernatant Developmental מחקרים Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SV2 נוגדן ראשוני (SV2),</td><td>מחקרי התפתחות</td> סופרנטנטים בנק היברידומה <td></td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצנטי הרכבה בינונית</td><td>שקופיות Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>(Superfrost Plus; לבן)</td> <td>פישר</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים</td><td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>CD1/C57Bl6</td><td>עכבר מעבדות</td><td></td><td></td> ג'קסון</tr></tbody></table>

ניתוח של השריר transversus abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

ניתוח של מורפולוגיה צומת neuromuscular יכול לתת תובנה חשובה על המצב הפיזיולוגי של נוירון מוטורי נתון. ניתוח של שרירים שטוחים דקים יכול להציע יתרון משמעותי על פני שרירים עבים המשמשים באופן מסורתי, כגון אלה של האיבר האחורי (למשל. גסטרוקנמיוס). שרירים דקים מאפשרים סקירה מקיפה של כל תבנית innervation לשריר נתון, אשר בתורו מאפשר זיהוי של בריכות פגיעות באופן סלקטיבי של נוירונים מוטוריים. שרירים אלה מאפשרים גם ניתוח של פרמטרים כגון גודל יחידה מוטורית, הסתעפות אקסונלית ונבטים סופניים/נודאליים. מכשול נפוץ בשימוש בשרירים כאלה הוא השגת המומחיות הטכנית לנתח אותם. בסרטון זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול לנתח את השריר transversus abdominis (TVA) מעכברים צעירים וביצוע immunofluorescence לדמיין אקסונים וצמתים neuromuscular (NMJs). אנו מראים כי טכניקה זו נותנת סקירה מלאה של דפוס innervation של שריר TVA והוא יכול לשמש כדי לחקור פתולוגיה NMJ במודל העכבר של מחלת נוירון מוטורי בילדות, ניוון שרירים בעמוד השדרה.

הפרוטוקול לעיל מנחה את הבידוד והכתמים של שריר TVA לניתוח NMJ. זה מאפשר ניתוח הרכבה שלם של דפוסי innervation שרירים, כמו גם ניתוח ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה NMJ (איור 2). טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בהצלחה כדי לחשוף פתולוגיה NMJ במודלים העכבר של מחלת נוירון מוטורי, כגון SMA4,17(איור 3). במודלים העכבר של SMA יש שונות תוך שרירית משמעותית בפתולוגיה, אולם שריר TVA מושפע באופן עקבי מאוד. עדות לכך היא דנרוויציה של לוחות מוטוריים, הצטברות של נוירופילמנטים בטרמינל הפרסינפטי ונבטים סופניים(איור 3). התוצאות המוצגות כאן מראות אפוא כי הטכניקה המתוארת לעיל יכולה להיות שיטה רבת עוצמה לספק סקירה מקיפה של innervation וניתוח של פתולוגיה NMJ במודלים העכבר.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> איור 1. סקירה כללית של שרירי הבטן של העכבר. (A) התמונה מראה את כלוב בית החזה עם שרירי בטן מחוברים, אשר הוסר מעכבר שהורדם לאחרונה והוצמד בצד שטחי צלחת ניתוח למעלה (A). (B) ניתוח ב- A כבר ביאורים כדי לסמן את הגבולות המשוערים של שרירי הבטן. שרירי הבטן השטחיים ניתן לראות בצד שמאל של הניתוח, וכוללים אלכסוני חיצוני (מתואר בכחול) ורקטוס abdominis (מתואר באדום). בצד ימין של הניתוח, השרירים השטחיים הוסרו מותר הדמיה של שריר abdominis transversus (מתואר בירוק) ואת השריר האלכסוני הפנימי (מתואר בצהוב). מטרת פרוטוקול זה היא לכוון את הניתוח של החלק העליון של שריר TVA, המוצג כאן כמשולש ירוק מוצק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> איור 2. סקירה שלמה של צמתים עצביים בשריר TVA. תמונות המציגות NMJs לדוגמה משריר ה- TVA דמיינו עם כתמים אימונופלואורסצנטיים לפילוח עצבי (NF; ירוק), חלבון בסינפטיקה 2 (SV2; ירוק) ובונגרוטוקסין (BTX; אדום). תמונות הן מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מונטאז'ים המציגים את כל השריר (A) או תמונות קונפוקל המציגות קבוצות (B) או בודדים (C) NMJs. סרגל קנה מידה = 800 מיקרומטר (A), 70 מיקרומטר (B), 25 מיקרומטר (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> איור 3. נוירומוסקולרי צומת פתולוגיה בשריר TVA ממודל העכבר של SMA. מיקרוגרפים קונפוקלים המציגים NMJs משריר ה- TVA דמיינו עם כתמים אימונופלואורסצנטיים לפילוח עצבי (NF; ירוק), חלבון סינפטי 2 (SV2; ירוק) ובונגרוטוקסין (BTX; אדום) משליטה אחת (Smn2B /+) או מדגם העכבר SMA (Smn2B /-). שים לב כי בעוד מורפולוגיה NMJ נורמלי ניתן לראות עכברי בקרה, בשרירי TVA מ Smn2B /- עכברים יש ראיות של denervation מלא (ראש חץ לבן), denervation חלקית (ראש חץ סגול) נבטי מסוף (ראש חץ כחול) ונפיחות presynaptic (ראש חץ צהוב). לוחות הסיום הפוסט-סינפטיים גם פחות מורכבים ומשקפים פנוטיפ שככל הנראה פחות בוגר. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.

בסרטון זה אנו מדגימים פרוטוקול לניתוח שריר העבדות של העכבר ומשתמשים בכשל חיסוני ובמיקרוסקופיה כדי לדמיין צמתים נוירומוסקולריים.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

שריר ה-ADOS הרוחבי הוא שריר דק ושטוח המהווה את השכבה העמוקה ביותר של שרירי הבטן. הוא מחובר לקו האמצע באמצעות ה-linear alpha ולמשטח העמוק של כלוב הצלעות. בסרטון זה, נבצע נתיחה של החלק העליון של שריר זה ונשתמש באימונופלואורסצנציה כדי להדגים דפוסי עיצבוב ומבנה של הצומת העצבית-שרירית.עבור נתיחה זו, תזדקקו לכלים אלה, המפורטים בנפרד בפרוטוקול המצורף. לאחר קריאת העכברים בשיטה מתאימה, רססו אותם ב-70% ethanol כדי למזער את פיזור הפרווה. הניחו את העכבר על גבו ובצעו חתך בעור בגובה הירך.יש להיזהר לא לחתוך דרך שרירי הבטן. המשיכו בחתך זה מסביב לעכבר. לאחר השלמת החתך, משכו את העור כלפי מעלה מעל ראשו של העכבר.שוב, יש להיזהר לא לקרוע את שרירי הבטן. חתכו דרך שרירי הבטן והמשיכו בחיתוך עד שתגיעו לעמוד השדרה. בשלב זה, חתכו כלפי מעלה דרך הצלעות עד שתגיעו מעל העצם הסטרנום (sternum), והקפידו לשחרר את הסרעפת מכלוב הצלעות.חזור על תהליך זה בצדו השני של העכבר. בנקודה זו, חתוך דרך הצלעות ועצם החזה והעבר את הצלעות יחד עם השרירים המחוברים אליהן לצלחת ניתוח מצופה באלגאר. מקבע את השריר באמצעות סיכות ניתוח לחרקים.קבעו את הרקמה ב-4% PFA והשאירו אותה על פלטפורמת נדנוד למשך 15 דקות. להלן דוגמה לאופן שבו השריר המנוקוד צריך להיראות. בצד שמאל של התמונה ניתן לראות את השרירים השטחיים, הכוללים את ה-external oblique המסומן בכחול ואת ה-rectus abdominis המסומן באדום.שכבה זו קולפה בצדו הימני של התמונה כדי לחשוף את השריר האלכסוני הפנימי (internal oblique) המסומן בצהוב ואת השריר הרוחבי של הבטן (transverses abdominis) המסומן בירוק. מטרתנו היא לנצח את החלק העליון של השריר הרוחבי של הבטן. כפי שמוצג כאן במשולש הירוק המלא תחת מיקרוסקופ ניתוח, חתכו דרך השריר האלכסוני החיצוני (external oblique) בנקודה שבה הוא מכסה את הצלעות, ולאחר מכן חתכו מטה דרך האלכסוני החיצוני, אך מעל הרוחבי של הבטן. חתכו מטה עד שתראו את תחילתו של השריר האלכסוני הפנימי, הנראה כאן כסיבי שריר משיקיים בצדה השמאלי של התמונה.הסר את כלי הדם על ידי קילוף עדין מפני השריר. לאחר מכן, השתמש בדיסקציה קהה כדי להפריד את השריר הרוחבי של הבטן (transverse abdominis) מהצלע שמעליו. גזור סביב שולי השריר, תוך הקפדה לכלול את החלק שנמצא מתחת לצלע.הסיר את הצלע והעבר את השריר לפלטה בעלת 24 בארות לצורך אימונופלואורסצנציה. בצע את כל הליכי האימונופלואורסצנציה בפלטה בעלת 24 בארות. השתמש בפיפט בעל קצה דק ופעל לפי הפרוטוקול המופיע במאמר זה.ודאו כי אתם משתמשים בריאגנטים המפורטים בפרוטוקול זה. לאחר צביעה אימונופלורסצנטית, מקבעו את השרירים על slides מזכוכית ובתוכ ה-Mounting media פלואורסצנטי; השתמשו בפינצטה כדי לפרוש בעדינות את השריר, וודאו שהוא שטוח לפני הנחת ה-coverslip. הקפידו ללחוץ בחוזקה כדי לשטח את השריר במהלך הקיבוע. כפי שמוצג בתמונה זו, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לביצוע צביעת whole mount של שריר ה-transversus abdominis כדי להדמיות של צומת עצב-שריר (neuromuscular junctions) ותבניות עצבוב.בתמונה זו, אקסונים וטרמינליים סינפטיים מוצגים בירוק, מסומנים בנוגדנים נגד SB two ונוירופילמנט, ותאי עצב מוטוריים מוצגים באדום, מסומנים ב-alpha bunger toxin. ניתן להשתמש כעת בסדרת Z של מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיית הצומת העצבית-שרירית. ניתן ליישם פרוטוקול זה כדי לחקור פתולוגיות של הצומת העצבית-שרירית במודלים של עכברים.לדוגמה, תמונות אלו מציגות פתולוגיה של הצומת העצבית-שרירית במודל עכבר של ניוון שרירים ספינלי. שימו לב כי קיימות ראיות לדנרבציה מלאה או חלקית, המסומנות בחצים לבנים או סגולים בהתאמה, ניבצויות טרמינליות המוצגות בחצים כחולים ונפיחות פרה-סינפטית המסומנת בחצים צהובים. ניתוח כזה יכול לספק תובנות חשובות לגבי התהליך הפתולוגי במחלות של נוירונים מוטוריים.

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

יישום electrophysiology כדי סינפסות נגיש מספק מדד לכימות הפעילות הסינפטית, שימושי בניתוח מוטנטים הסינפטי. מאמר זה מתאר שיטה לנתיחה נהג לחשוף את בצמתים neuromuscular (NMJ)...

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

Visualizing תאים בודדים ברקמות דחוסות, כגון תאים סופניים שוואן (SCS) בneuromuscular צמתים (NMJs), מאתגר. "משכית תמונת הלבנה-" מאפשר תיחום SCS מסוף היחיד, למשל בexplant triangularis sterni השריר, הכנה נוחה עצבי שרירים, שם ניתן לשלב הלבנה רציפה עם הדמית זמן לשגות...

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת השלמות המבנית של צמתים עצביים-שריריים בשרירי האורך הגביים של דרוזופילה. ההליך כולל צביעת נוירונים ושרירים בשני נוגדנים נפרדים והשוואת דפוסי פלואורסצנטיות בין זבובים מוטנטיים לזבובי בר. הפחתה בכתמים עצביים בזבובים מוטנטיים מצביעה על ניוון עצבי, בעוד מבנה השריר נשאר שלם.

הערכת השלמות המבנית של הצמתים העצביים-שריריים האורכיים הגביים בדרוזופילה

הצומת העצבי-שרירי (NMJ) משתנה במגוון מצבים שיכולים לפעמים להגיע לשיאם בכשל סינפטי. דוח זה מתאר שיטות מבוססות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכימות שינויים מבניים כאלה.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

היעילות של ספיגה תוך שרירית והובלה לאחור של מולקולות לנוירונים מוטוריים מתאימים תלויה במיקום אתרי ההזרקה ביחס ללוחות הקצה המוטוריים (MEPs). כאן, אנו מתארים כיצד לאתר MEPs על שרירי השלד כדי לייעל את ההובלה לאחור של עוקבים לנוירונים מוטוריים.

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

הפרוטוקול מראה שיטה לבחינת קורלציה מרחבית בין ההדקים הקדם-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים ותאי שוואן הפרי-סינפטיים בשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית עם סמנים ביולוגיים שונים, כלומר נוירופילמנט 200, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי, אלפא-בונגארוטוקסין ו-S100.

הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

למדו לנתח את שריר Transversus Abdominis בעכברים ולהשתמש בזיהוי פלואורסצנטי כדי לדמיין צמתים נוירומוסקולריים. פרוטוקול זה מאפשר חקר מחלות מוטוריות ופתולוגיה נוירומוסקולרית ברזולוציה גבוהה.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

גלה סרטונים נוספים