ריכוז Itraconazole מופחת ומשכים מצליחים בטיפול
14 במרץ 2014
זיהום dendrobatidis Batrachochytrium בדו חיים ניתן למנוע באמצעות ריכוז מופחת (0.0025%) ומשך זמן קצר יותר (אמבטיות של חמש דקות לשישה ימים) של itraconazole מ משמשים בדרך כלל. תמותה ותופעות לוואי שלילי פחות פחות נצפו באמצעות פרוטוקול טיפול שונה זה.
המטרה הכללית של הליך זה היא לטפל בדו-מינתיים שנדבקו בפטריית ה-Kitt של הדו-מינתיים, Bera key tridium, dendro, he או BD, באמצעות כימותרפיה אנטי-פטרייתית מסוג triazole. מטרה זו מושגת תחילה על ידי גידול תרביתי של BD והדבקת בעלי חיים עם הפתוגן הפטרייתי. השלב השני הוא בדיקת בעלי החיים באמצעות הפקת DNA וביצוע QPCR על swabs של העור כדי לוודא זיהום ב-BD.
בשלב הבא, מטפלים בבעלי החיים הזוהים על ידי רחצה בתמיסת econazole בריכוז 0.0025% למשך חמש דקות ביום, במשך שישה ימים. השלב הסופי הוא ניטור מצב הזיהום של בעלי החיים המטופלים באמצעות ביצוע אנליזת QPCR מדגיסות (swaps) של העור למשך ארבעה שבועות לפחות לאחר סיום הטיפול כדי להבטיח טיפול מוצלח בבעל החיים; הליך זה מדגים כי ריכוז מופחת וזמן טיפול קצר יותר של נוגד הפטריות itraconazole יעילים לטיפול בבעלי חיים שנדבקו ב-bd. היתרון המרכזי בשימוש במשטר טיפולי זה על פני מינון הטיפול המומלץ, שהוא תמיסת itraconazole בריכוז 0.01% למשך 11 ימים, הוא שריכוז מופחת של רבע מהמינון המומלץ וקיצור זמן הטיפול לשישה ימים עדיין יעילים לריפוי זיהום BD, ובמקביל ממזערים את תופעות הלוואי השליליות הנובעות מהשימוש במינון הטיפולי המומלץ.
לאחר דגירה של ה-BD במצע צמיחה מסוג tritone broth כפי שפורט בפרוטוקול הטקסט ובדיקת תנועת נבגי ה-Zo, הצפו כל צלחת בחמישה מיליליטרים של מי ברז מיושנים והמתינו 10 דקות כדי לאפשר לנבגי ה-ZO לחדור למצע. לאחר מכן, שפכו את תגלי ה-Zo Spor לתוך מכל נייד. העריכו את ריכוז נבגי ה-ZO באמצעות המוציטומטר ודללו את התערובת לריכוז של 1×10⁶ ל-3 מיליליטרים באמצעות מי ברז מיושנים כדי להדביק בעל חיים, כגון ה-Latoria vei Alpina המוצג כאן.
החזיקו אותו מעל מכל של 50 milliliter ושפכו שלושה milliliters של תערובת האינוקולום מעל בטנו. לאחר מכן, הניחו את בעל החיים בתוך המכל יחד עם שאריות האינוקולום. סגרו את המכל עם מכסה והשאירו את בעל החיים במכל האינוקולציה למשך 24 שעות כדי להבטיח הדבקה.
כדי למנוע זיהום בפתוגן ה-BD, יש להסיר את הכפפות הישנות ולהניחן לאוטוקלאב לפני ההשלכה. לאחר חבישת זוג כפפות חדש, ניתן להמשיך להדבקת החיה הבאה.
לאחר 24 שעות מההחדרה, החזירו את בעלי החיים לטרריום המחומם והמחוטא האישי שלהם למשך שבועיים. זכרו לחטא את כל הפסולת הנוזלית לפני השלכתה על ידי הבאת התמיסה לריכוז של 10% bleach לאחר שבועיים. בדקו את הצלחת זיהום ה-BD באמצעות דגימה מהבעלי החיים בעזרת מקל צמר גפן סטרילי.
סובב בעדינות את המקלון במהלך ובין התנועות. שפשף חמש פעמים את הבטן בכל צד, כל ירך, וכל אחת מארבע הגפיים, לסך הכל 45 תנועות. אחסן את המקלונים במבחנות מיקרו של 1.5 milliliter בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.
הפיקו את ה-DNA הגנומי מהמטבשים באמצעות ערכה מסחרית לבידוד DNA ובצעו QPCR כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכינו שלושה אמבטיות טיפול, אחת לכל אחת משלושת המינונים של itraconazole, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הניחו אמפיביות בודדות במיכלים שחוטרו.
מיכלי פחקים בנפח 50 milliliter המכילים 35 milliliters של תמיסת הטיפול. תוך הקפדה על החלפת כפפות בין בעל חי לבעל חי, סובבו בעדינות את המיכל מדי פעם כדי להבטיח שהבעלי חיים מכוסים לחלוטין למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, החזירו את בעלי החיים לאזור החיטוי שלהם.
חזרו על הטיפול בן חמש הדקות מדי יום למשך חמישה ימים נוספים. בדקו שוב את בעלי החיים לזיהום BD שבוע לאחר סיום הטיפול, ולאחר מכן פעם בשבוע במשך ארבעה שבועות כדי לוודא שהזיהום חלף. שימו לב כי גם לאחר השלמת הטיפול, יש להתייחס לבעלי החיים כאילו הם עדיין מהווים סיכון לזיהום.
יש להחזיק את בעלי החיים באזור נפרד למשך חודש אחד לפחות לאחר ההדבקה. במידה והטיפול אינו מצליח, יש לחזור עליו. מינים שונים ושלבי חיים שונים מגיבים באופן שונה להדבקה ולמשטרי טיפול, ולכן יש לבחון את הטיפול בניסוי לפני יישומו באופן נרחב.
מכיוון ש-BD מהווה סיכון ביולוגי, יש לחטא כל טריום מדי שבוע על ידי טבילה של הטריום ומכלי הטיפול בתמיסת אקונומיקה בריכוז 10%. השרו למשך 30 שניות לפחות, שטפו את האקונומיקה בשני שטיפות מים והניחו למכלים להתייבש במשך 24 שעות לפני השימוש החוזר להישרדות צפרדעים. כאן מוצגים תוצאות לאחר 11 ימי טיפול ב-BD או שישה ימי טיפול ב-BD.
החצים השחורים מציינים את היום האחרון של הטיפול. הקווים הרצופים מציינים את שיעור ההישרדות של קבוצות הביקורת. הקווים השחורים הרצופים מייצגים בעלי חיים שהיו BD חיוביים אך לא קיבלו טיפול ב-BD.
והקווים האפורים הרציפים מייצגים בעלי חיים שהיו שליליים ל-BD ולא קיבלו טיפול ב-BD. הקווים המקווקוים מראים את שיעור ההישרדות של קבוצות הטיפול שקיבלו את ריכוז ה-econazole המצוין. כל בעלי החיים שטופלו ב-0.0025% באמצעות נבולייזר למשך שישה ימים היו שליליים ל-BD ארבעה שבועות לאחר סיום הטיפול, ולכן טיפול זה נחשב להצלחה.
בנוסף, מינון זה של טיפול ב-econazole לא הראה הבדל מובהק בשיעור התמותה בהשוואה לבקרי ה-BD החיוביים. שימו לב כי טיפולים ב-0.01% ו-0.005% econazole למשך 11 ימים הובילו לעלייה מובהקת בתמותה בהשוואה לבקרי ה-BD החיוביים. זכרו כי הפתוגן הפטרייתי BD מהווה סיכון ביולוגי, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון חבישה והחלפה של כפפות, אוטוקלאב לכל הפסולת המוצקה וחיטוי.
יש לבצע סילוק של כל הפסולת הנוזלית בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן פרוטוקול טיפול שונה עבור זיהום של Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) בדו-מינתיים באמצעות itraconazole. הממצאים מצביעים על כך שריכוז מופחת ומשך טיפול קצר יותר יכולים להעלים את הזיהום ביעילות תוך מזעור תופעות הלוואי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקולוגיה
- בריאות דו-חיים
- טיפול במחלות זיהומיות
רקע
- Batrachochytrium dendrobatidis הוא פטרייה פתוגנית המשפיעה על דו-חיים.
- טיפול מסורתי כולל ריכוזים גבוהים יותר ומשך זמן ממושך יותר של חומרים אנטי-פטרייתיים.
- הפחתת ריכוז הטיפול ומשכו עשויה לשפר את רווחת בעלי החיים.
- ניטור מצב הזיהום לאחר הטיפול הוא קריטי להערכת היעילות.
מטרת המחקר
- להערכת היעילות של ריכוז נמוך יותר של itraconazole לטיפול בזיהום Bd.
- לצמצום תופעות לוואי שליליות הקשורות לפרוטוקולי טיפול מסורתיים.
- לקביעת משטר טיפולי הומני יותר עבור דו-מינמיים נגועים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- החדרה של תרביעי Bd לדו-מסלוליות.
- מיצוי DNA ובדיקת QPCR לאישור הזיהום.
- טבילה של בעלי חיים נגועים בתמיסת itraconazole בריכוז 0.0025% למשך חמש דקות מדי יום לאורך שישה ימים.
- ניטור לאחר טיפול באמצעות אנליזת QPCR של שפשופי עור למשך ארבעה שבועות.
תוצאות עיקריות
- פרוטוקול טיפול שונה ביטל ביעילות את הזיהום ב-Bd.
- ריכוז ומשך זמן מופחתים הובילו לתמותה נמוכה יותר.
- נצפו פחות תופעות לוואי שליליות בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- הטיפול המוצלח אומת באמצעות אנליזת QPCR.
מסקנות
- ריכוז נמוך יותר ומשך טיפול קצר יותר של itraconazole יעילים נגד Bd.
- גישה זו יכולה לשפר את רווחתם של דו-מינתיים המטופלים.
- מחקרים נוספים עשויים למטב את פרוטוקולי הטיפול עבור פתוגנים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מחקר זה מדגים כי הפחתת ריכוז חומרים נוגדי פטריות ומשך הטיפול יכולה לשמר את היעילות תוך שיפור פרופילי הבטיחות במודלים של דו-מינית. עבור מו"פ בביופארמה, תוצאה זו תומכת באסטרטגיות לאופטימיזציה של המינון המאזנות בין האינדקס הטיפולי לבין הסבילות בפיתוח פרה-קליני של תרופות נוגדות פטריות. גישה זו מדגישה כיצד זיקוק איטרטיבי של פרמטרי המשטר הטיפולי יכול להפחית סיכונים עבור מועמדים מובילים לפני מחקרים המאפשרים הגשת IND.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של קשרי תגובה-מינון עבור מנגנונים נוגדי פטריות במודל של זיהום באורגניזם שלם.
- ערך תפעולי: מספק מערכת ניתנת להרחבה להערכת מעורבות המטרה וסילוק הפתוגן תחת תנאי חשיפה מופחתים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: קובע קריאה סטנדרטית מבוססת QPCR לכימות העומס הפטרייתי לאחר טיפול.
- ערך תפעולי: תומך בחזרת תוצאות הבדיקה באמצעות פרוטוקולי רחצה מוגדרים ובקרות סביבתיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מציע מערכת רלוונטית למחלה להערכת שולי בטיחות של תרכובות נוגדות פטריות לאורך שלבי חיים שונים.
- ערך תפעולי: מקל על השוואה בין מינים על ידי הגדרת פרמטרים לכישלון טיפולי וקריטריונים להצלחה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה נכללת במסגרת אופטימיזציה של תרכיבים מובילים (lead optimization) נגד פטריות, במסגרתה מוערכים הפשרות בין יעילות ובטיחות לפני בחירת המועמדים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור בין חשיפה מופחתת לתרופה לבין שמירה על סלקרה של הפתוגן.
- סריקה: מאפשרת הערכה סטנדרטית של יעילות התרכובת באמצעות הגדרה של משך החשיפה ומטריצות ריכוז.
- אנליזה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות QPCR כדי להשוות את העומס הפטרייתי בין קבוצות הטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי קביעת חלונות ניטור לאחר טיפול כדי לאשר סלקרה ממושכת.
- שימוש חוזר ארגוני: מספקת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להערכת מועמדים לאנטי-פטרייתיים עם נטל משאבים מופחת לכל תנאי בדיקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות קורלציה בין חשיפה נמוכה ליעילות מתמשכת.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של השראת הזיהום, מתן הטיפול ודה-קונטמינציה סביבתית.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות של המשך/עצירה (go/no-go) על ידי זיהוי משטרי טיפול יעילים עם אותות רעילות מופחתים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המפגינות יעילות בריכוזים נמוכים יותר.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול דו-מינתיים, טיפול בפתוגנים פטרייתיים ואבחון מולקולרי.
- דרישות הציוד כוללות מערכות QPCR, המוציטומטרים לאומדן כמות נבגים ותאי סביבה מבוקרים.
- סטנדרטיזציה בין צוותים דורשת התאמה של ספי השגת אישוש זיהום וניטור היצמדות לטיפול.
- שיקולי התאמה כוללים סבילות ספציפית למין להליכי רחצה ומטבוליזם של תרופות התלוי בשלב החיים.
- מגבלות מעשיות כוללות דרישות הכלה של סיכונים ביולוגיים עבור Bd ושונות בין-מינית בתגובה לטיפול.
