Name: הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: חקור את התפתחות תאי דנדריטים פלסמציטואידים מקדמי תאי דם בעכברים באמצעות העברה מאמצת של CDPs ו-FACS. שיטה זו מאפשרת הערכה של פוטנציאל התפתחות בתאי החיסון במעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. אלכס גלברד וילם Overwijk עצה על העברת גנים הידרודינמית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIH (AI098099, מע), במרכז אנדרסון לסרטן אפיגנטיקה, מרכז MD Anderson לדלקות וסרטן (מע), וקרן RE בוב סמית החינוך (HSL).

יש לקבל את האישור מוסדי מראש לכל מניפולציות הניסוי שתוארו במסמך זה כרוך בעכברים. אלה כוללים שימוש בעכברי C57BL6 לבידוד של תאי אב במח עצם, Ifnar - / - עכברים כנמענים להעברת מאמצת של אבות hematopoietic ושימוש בHGT לביטוי יתר של ציטוקין in vivo. דיור הולם וטיפול בבעלי החיים גם חייבים להינתן על ידי החוקר או מוסד. יתר על כן, ייתכן שיידרש אישור מוסדי לפלסמידים המשמשים בהעברה הידרודינמית גן (כלומר אישור ה-DNA רקומביננטי). המחקרים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש ב UT MD Anderson Cancer Center. 1. ין העברה הידרודינמית (HGT) צעד זה צריך להתבצע 2 ימים לפני העברת המאמצת של CDPs כדי לגרום למחזור Flt3L להרחבת DC in vivo 5. יחסי ציבורepare לפחות 5 עכברים / קבוצת נמען. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג HGT יעיל, כלי השיט של הנמען Ifnar דם - / - עכברים (+ CD45.2) צריכים להיות מורחב על ידי חשיפת עכברים למנורת חימום ל5-10 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 5 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד Flt3L ב2 מיליליטר של PBS סטרילי לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27. לקבוצת הביקורת, להזריק 5 מיקרוגרם של וקטור ריק (pORF) דרך וריד הזנב כפי שצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור למשך 2 ימים. </li></ol> 2. בידוד של Hematopoietic אבות מעכבר מח עצם יש לבצע שלב זה 2 ימים לאחר HGT. השתמש CD45.1 + עכברי congenic כמקור לתאי אב במח עצם להעברת מאמצת לנמען Ifnar - /- בעלי חיים (CD45.2 +). בפרוטוקול זה, זני congenic נדרשים להבחין תורם וDCS-נגזר נמען, וכן כדי למנוע דלדול בתיווך חיסונית בשל חוסר התאמת MHC. כ 10-20 עכברים יידרשו כדי לספק כמות מספקת של תאי אבות היווצרות הדם (10 5 תאים / עכבר נמען) לניסויי ההעברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים CD45.1 congenic 10 + עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל פגר על מגש נתיחה ולעקר את הבטן ורגליים עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך באמצע הבטן וחתך את העור מהבטן לכל רגל, חיתוך עור לאורך רגלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את העור מכל רגל, ולחתוך ולהסיר את הרגליים מן הפגר במפרק הירך באמצעות מספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את השרירים מהירך ועצם השוק של כל רגל באמצעות סכין חד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסירשני הקצוות של עצם הירך ועצם שוק עם אזמל חד ולמקם את העצמות בצלחת תרבות המכילה מלא RPMI (RMPI 10% בסרום חום מומת שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ ו50 β-mercaptoethanol מיקרומטר) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מזרק המכיל 1 מיליליטר של RPMI השלם, מחובר למחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכניס את מחט 27 G לתוך קצה אחד של עצם הירך או שוקה. לשטוף את מח העצם מהירך או השוקה בעדינות על ידי הזרקת RPMI להשלים לתוך העצם. ודא שתאי מח עצם הוצאתו מהעצמות, זה יכול להתבצע על ידי בחינה ויזואלית איתור מדיה גורשה שמופיעה מעונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שטיפת כל 3x עצם ירך ועצם השוק כדי להסיר ביסודיות תאי מח עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting בעדינות תאים למעלה ולמטה 3-5x בצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר שאריות על ידי העברת תאי מח עצם דרך מסננת 40 תא מיקרומטר, הצבת התאים הקרינו לcultur חדשהצלחת דואר. לשבש כל גושי תאים המופיעים במסננת על ידי לחץ עדין עם סוף בוכנת מזרק סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאי דם האדום (RBC) הנמצאים בהשעית התא במח עצם המוחלטת עם מאגר תמוגה RBC מסחרי להוראות היצרן. השתמש 2 מיליליטר buffer/4-6 תמוגה RBC x 10 7 תאים (בדרך כלל בתאים מעכבר אחד) וזמן דגירה של 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי מח עצם על ידי pelleting תאים על ידי צנטריפוגה במשך 4 דקות בשעה XG 500, בעדינות aspirating מדיום התרבות, resuspending ב10 מיליליטר חיץ FACS (1x PBS + 2 מ&quot;מ EDTA + 1% FBS), תאי pelleting ידי צנטריפוגה ובעדינות aspirating לשטוף מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף, כמתואר בשלב 2.13, עבור סכום כולל של 2 שוטף. </li></ol> 3. סלולרי הקרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד CDPs צעד זה דורש גישה למפריד תא MidiMACS ועמודות MACS LD להליך בחירה שלילית ראשוני,כמו גם מכונה FACS עם לפחות 3 בלייזרים על מנת לטהר את קבוצת משנה אב ססגוניות לאחר צביעה עם נוגדנים מצומדות fluorescently. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף את השני בשלב 2.14, לספור את תאי מח עצם. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS כדי להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 7 תאים לכל 30 μl של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את התאים לFACS, תאי שושלת שלילית מועשרים ראשון על ידי טכניקת סלקציה שלילית שמסירה תאי שושלת חיובית מתערובת מח עצם באמצעות כרומטוגרפיה עמודת חרוז מגנטי. להליך הבחירה השלילי, להוסיף 1 מיקרוגרם של כל אחד מהנוגדנים הבאים החולדה מסחרית אנטי עכבר (שרירי בטן) שמזהים סמני שושלת hematopoietic: CD3, CD19, CD11c, CD11b, וטר-119 אבס. שרירי הבטן יש להוסיף בנפח של 2 μl / Ab להשעית תא 30 μl בחיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה התא על 4 מעלות צלזיוס במשך 30דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 7 cells/40 μl של חיץ FACS. הוסף 20 μl של עז אנטי עכברוש microbeads המגנטי IgG לכל 40 μl של השעיה תא. מערבבים בעדינות ולדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטוף תאים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend עד 10 תאי מח עצם ב8 500 μl של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עמודת LD MACS על מפריד תא MidiMACS להוראות היצרן וprerinse הטור עם חיץ FACS 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ההשעיה התא במח עצם לעמודה, טעינה עד 5 x 10 8 תאים ב2.5 מיליליטר של חיץ FACS. ודא צינור איסוף (צינור חרוטי 15 מיליליטר) ממוקם מתחת לעמודה. לשטוף את עמודת 3x עם 2 מיליליטר של חיץ FACS / לשטוף, ולאסוף את התאים שעוברים דרך העמודה, שיהיה מועשרת עבורתאי שושלת שלילית. ספירת התאים בחומר eluted (לשטוף דרך) מהטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע סלקציה חיובית של תת אב hematopoietic על ידי FACS, תאי כתם עם שרירי הבטן הבאים fluorescently מצומדות:-IL-7R (פסיפיק בלו), FLT3 (PE), SCA-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit שרירי בטן (APC.Cy7), בתוספת תערובת של אבס סמן השושלת מכוון נגד CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 וTer119 (כל כותרתו עם PerCP Cy5.5). השתמש 0.5-1 μl של כל Ab בנפח כולל של 100 μl. דגירה השעיה תא על 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS בריכוז של 2-3 x 10 7 תאים / מיליליטר. סנן תאים דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר כדי להסיר גושי תא. השלב אחרון זה הוא חיוני כדי למנוע סתימה במכונה FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההשעיה התא בצינור FACS על הבמה FACS ולמיין CDPs (לין - c-kit והנה CD115 + FLT3 +) עלבסיס פרופיל הסמן המצוין. איסוף תאים מטוהרים בצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של RPMI המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף ריצת FACS. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend ב סטרילית PBS לניסויי העברת מאמצת. </li></ol> 4. העברת מאמצת של CDPs צעד זה נעשה בדרך כלל במתקן בעלי החיים שבו עכברי הנמען הם שוכנו. בהתאם למיקום של המכונה FACS, זה עשוי להיות כרוך בהובלה של אוכלוסיות תאים ובתאים המטוהרים למתקן בעלי החיים לפני העברת מאמצת. צריכה להיות כל הזמן השעיות תא אב סטריליים ומועברות על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא להזרקה על ידי דילול 10 5 CDPs מטוהר בהיקף כולל של 100 סטרילי PBS μl. הנח השעיה תא במזרק המצורף למחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הנמען Ifnar - / - </sup&gt; עכברים (CD45.2 +) למנורת חימום ל5-10 דקות כדי להשיג זריקה יעילה דרך וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 10 CDPs 5 מטוהר FACS-ב100 μl PBS לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור. </li></ol> 5. בידוד של PP ומדידה של PDC סכומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב7-10 ימים לאחר העברת מאמצת, להרדים עכברי הנמען. בעדינות לפתוח את העכבר על ידי לנתיחה ולחשוף את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל המעי ולמקם אותו במגבות נייר ספוגות PBS. לאסוף את כל PPS הגלוי לאורך הקיר של המעי הדק באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר. יש עכברים בדרך כלל 5-10 PP / עכבר, שהם שונים מזקיקי הלימפה מבודדים מצאו - C57BL6 וIfnar - /לאורך המעי הדק 18. שים לב שPPS הוא לעתים קרובות מבני ברור אפילו בתוך עכבר אחת, להבטיח כל כך בזהירות את כל PPS מזוהים וגזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח PPS בצלחת פטרי המכילה PBS, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את צואה. חזור על תהליך זה פעמיים כדי לנקות PPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Digest PPS עם מ&quot;ג / IV collagenase מיליליטר 1 ב10 פתרון מיליליטר של 1x האנק מאוזן מלח (HBSS) ב50 מיליליטר בקבוקון עם ערבוב נמרץ במשך שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את PP מתעכל בתא העליון של תאי מסננת תא וכוח 40 מיקרומטר דרך מסננת עם בוכנת מזרק סטרילי. אסוף את ההשעיה תא PP בצינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאי PP מתוחים על ידי צנטריפוגה ב XG 500 לדקות 5 ו resuspend ב 6 מיליליטר של 37% פתרון Percoll (37% Percoll בRPMI בינוני). מניח בעדינות 6 מיליליטר של 70% פתרון Percoll (70% Percoll במדיום RPMI) מתחת להשעית התא, כדי ליצור שיפוע צעד Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ל20 דקותt XG 800 עם צנטריפוגה לנתק. תאים חד גרעיניים יעברו לממשק 37/70%. לאחר צנטריפוגה, אוכלוסיית התאים חד הגרעיניים צריכה להיות שנאספו על ידי pipetting זהיר באזור הממשק. גלולה שנאספו תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעמיים ב50 מיליליטר של RPMI / לשטוף מלא. נפח גדול משמש כדי להבטיח הסרת Percoll מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאי PP נאספו עם הנוגדנים הבאים כדי לזהות pDCs העכברי הנובעים מהאבות העבירו adoptively (CD45.1 +), או עכברי נמען (CD45.2 +): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (פסיפיק בלו), CD11b (Cy5.5 PerCP), B220 (APC), Siglec-H (PE) וPDCA-1 (ABS FITC). לבצע ניתוח cytometry זרימה של תאי PP כפי שצוין בצעדים 3.9 ו3.10. לזהות pDCs ידי CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + פנוטיפ. מספרי PDC מוחלטים ניתן לקבוע על ידי המשוואה הבאה:% pDCs x למספר תא tal PP = PP pDCs. </li></ol>

<ol><li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+monocytes+migrate+to+inflamed+lymph+nodes+and+produce+large+amounts+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon.</a> Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.</li>
<li>Siegal, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+principal+type+1+interferon-producing+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood.</a> Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.</li>
<li>Asselin-Paturel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.</li>
<li>Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Peyer%27s+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+%28pDCs%29+produce+low+levels+of+type+I+interferons%3A+possible+role+for+IL-10%2C+TGFbeta%2C+and+prostaglandin+E2+in+conditioning+a+unique+mucosal+pDC+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype.</a> J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-intrinsic+role+for+IFN-alpha-STAT1+signals+in+regulating+murine+Peyer+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+and+conditioning+an+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response.</a> Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+dendritic+cell+development+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.</li>
<li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPbeta+is+required+for+%27emergency%27+granulopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis.</a> Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+antitumor+effects+of+IL-23+as+a+cancer+vaccine+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant.</a> J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).</li>
<li>Cervantes-Barragan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+control+T-cell+response+to+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).</li>
<li>Goubier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+mediate+oral+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance.</a> Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).</li>
<li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent%2C+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li>
<li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+synthesis%3A+regulation+of+front-line+body+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Blasius, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+antigen+2+is+a+specific+marker+of+type+I+IFN-producing+cells+in+the+naive+mouse%2C+but+a+promiscuous+cell+surface+antigen+following+IFN+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation.</a> J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).</li>
<li>Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Th17+cells+in+the+gut+pathogenic+or+protective%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective.</a> Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

טכניקת העברת המאמצת המתוארת כאן העריכה תרומת CDPs באוכלוסיית PP PDC עכברים נמען כי חסרים PP pDCs (למשל Ifnar - / - עכברים). בניסויים עתידיים, זה יהיה חשוב להעריך את הפוטנציאל של תת אב אחר ביצירת pDCs PP, בפרט אם pDCs PP נובע מFLT3 + CLPs. על שאלה זו הינה משמעותית שכן עדיין לא ברור מדוע pDCs PP הם ייחודי רגיש לאותות IFNAR-STAT1 לצבירת PP 5, ואם pDCs PP לעקוב רמזים התפתחותיים דומים כמו pDCs באיברים אחרים. <p class="jove_content" style=";...

הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול להעריך האם אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs) מסוגלים לתת עלייה לתאים דנדריטים plasmacytoid אוכלוסייה (PDC) בתיקון של Peyer (PP). המטרה הכללית של שימוש בשיטה זו הייתה להעריך את הרגולציה ההתפתחותי של pDCs בתיקון של Peyer (PP PDC). מהסיבה זו חשובה היא שpDCs PP שונה מpDCs נמצא ברקמות אחרות, כוללים מח עצם, דם וטחול, ולכן לא ברור אם pDCs PP ואוכלוסיות PDC אחרות הן מבחינה התפתחותית ו / או תפקודי בנושא. באופן ספציפי, pDCs ידוע נרחב על היותו הסוג העיקרי אני אינטרפרון מפיקים (IFN) בתוך מערכת hematopoietic, בתגובה לחיוג כמו קולטן 7 ו 9 גירוי (TLR7 / 9) על ידי מהיר IFN ההפרשה 1-3. יחד עם זאת, pDCs PP חסר בייצור הסוג אני IFN בתגובה לגירוי 4,5 אגוניסט TLR. זאת ועוד, PP pDCs גם שונה מpDCs נמצא במח עצם וטחול בהדורש אותות מהסוג אני אינטרפרון רצפטור (IFN) (IFNAR1) או IFN איתות STAT1 מולקולה לפיתוח ו / או ההצטברות 5 שלהם. נתונים אלה הציעו את האפשרות שמנגנוני פיקוח שונים לשלוט pDCs PP לעומת pDCs באיברים אחרים (למשל מח עצם, טחול) 5. הרציונל שהוביל לפיתוחה של שיטה זו היה מבוסס על ההתקדמות בהבנת ביולוגיה של תאים דנדריטים (DC). רוב, אם לא כולם, תת DC נובעים מאבות hematopoietic המבטאים את FMS-כמו טירוזין קינאז 3 קולט (FLT3) 6-10, עם זאת, פיתוח DC אינו מוגבל למיאלואידית הקלאסית ומסלולי הלימפה. לדוגמא, + אבות FLT3 נפוצים מיאלואידית (CMPs, לין - IL-7R - SCA-1 - c-kit + CD34 + FcγR lo / -) להצמיח CDPs (לין - c-kit lo CD115 + FLT3 +), אשרשעות נוספות להבדיל לpDCs וDCs הקונבנציונלי (cDCs) 9,10. לעומת זאת, FLT3 + אבות הלימפה נפוצים (CLPs, לין - והנה + SCA-1 lo c-kit IL-7R) לפתח בעיקר לpDCs 11. לכן, מחקרים קודמים מצביעים על pDCs לנבוע מלפחות 2 אוכלוסיות אבות היווצרות הדם נפרדות לפי תקנה של Flt3L, אם כי הניתוח הטיפוסי הוגבל למח עצם, הטחול ו / או תת PDC הדם. לכן, אוכלוסיית האב (ים) שיוצרת PP pDCs נדרשת חקירה. הבנת מקורותיה של PP pDCs תשפוך אור על השאלה האם הם חולקים מסלולים התפתחותיים משותפים עם אוכלוסיות PDC אחרות, או לנצל את המנגנונים שונים בדורם בPP. יתרון ייחודי של הגישה המתוארת כאן הוא השימוש בעכברים מראים כי מחסור חמור בPP pDCs כנמענים להעברת המאמצת של אבות היווצרות הדם. עכברים עם גןמחיקת טיק בגן המקודד IFNAR1 (Ifnar - / - עכברים) או STAT1 (Stat1 - / -) גילתה דלדול בולט בPP pDCs 5. לכן, זנים אלה מספקים סביבה שבה pDCs PP מופחתים, המאפשרים לימודי העברת מאמצת שיש לבצע בהיעדר משטרי אבלציה הסלולרי חזקים כמו קרינה קטלנית. כוח נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש בהעברת גנים הידרודינמית (HGT) כדי לעורר את הכמויות במחזור גבוהות של Flt3L. זה מספק גישה יעילה עלות לגרום Flt3L in vivo, לעומת הזרקה של חלבון רקומביננטי. מחקרים רבים, כוללים אלה במעבדה שלנו, יש מועסקי HGT לגרום כמויות ציטוקינים במגוון רחב של תנאי ניסוי 5,12,13. חלוקת העבודה ותפקידים חיסוניים מדויקים לDCS היא עניין המרכזי באימונולוגיה. בפרט, pDCs הם מתווכים חשובים של סובלנות אוראלית ואנטי ויראלית המערכתיתתשובות, ובכל זאת הם מופיעים גם לתרום לפיתוח וההתמדה של אוטואימוניות והסרטן 14-17. הפרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר למנגנוני התפתחות ויסות PP pDCs כדי להיחקר באופן מלא יותר. בנוסף, גישה זו עשויה לאפשר מחקרים כדי להעריך את תפקוד PP PDC, וניתן להארכה להבנת הוויסות והתפקוד של אוכלוסיות אחרות של מערכת חיסון בתוך PPS.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL</td><td>JAX</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה</td><td></td><td></td><td></td>כירורגית</tr><tr><td>סטרילית מספריים</td><td></td><td></td><td></td>זוג קטן סטרילי</tr> מספריים סטריליים <tr><td>מספריים זוג גדול סטרילי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסננת תאים</td><td>m BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m צינורות מכסה מסננת תאים</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליסינג RBC</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>FACS מאגר</td><td></td><td></td><td>PBS, 2 מ"מ EDTA, 1% FCS, מסנן</td></tr><tr><td>מעוקר Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089102</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד חולדות מיקרו-חרוזי IgG</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-048-501</td><td></td></tr><tr><td>LD column</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד D3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553783</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>553799 עכברוש אנטי-טר119</td><td>BD ביוסיינסס</td><td>553671</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD3 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0031</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD19 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0193</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD11b (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD11c (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0114</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-F4/80 ( PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-4801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-5921</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCA-1 (PE. Cy7)</td><td>eBiosciences</td><td>25-5981</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>17-1152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-kit (APC. Cy7)&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>47-1171</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-1271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flt3 (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-1351</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.1 (APC. Cy7)</td><td>BD Biosciences</td><td>560579</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 (PE. Cy7)</td><td>Biolegend</td><td>109830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-B220 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>25-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-0333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDCA-1 (FITC)</td><td>eBiosciences</td><td>Nov-72</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>למשל BD מנורת</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>חום</td></tr> פורטסה <tr><td>מסנן</td><td></td><td></td><td></td>עכבר</tr><tr><td>1 מ"ל מזרקים</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; מחטי G (סטריליות)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת התפתחותם של תאי murine plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות hematopoietic

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

פרוטוקול זה מפרט שיטה לנתח את היכולת של אבות היווצרות הדם מטוהרים כדי ליצור תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) בתיקון של Peyer מעיים (PP). אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs, לין - c-kit lo CD115 + FLT3 +) היו מטוהרים ממח העצם של עכברי C57BL6 ידי FACS והועברו לעכברי נמען שאין אוכלוסיית PDC משמעותית בPP, במקרה זה, Ifnar - / - עכברים שימשו כמקבלי העברה. בחלק מהעכברים, ביטוי יתר של גורם גדילה ליגנד תאים דנדריטים FLT3 (Flt3L) נאכף לפני מאמצי העברת CDPs, באמצעות העברת גנים הידרודינמית (HGT) של פלסמיד Flt3L הקידוד. ביטוי יתר Flt3L מרחיב אוכלוסיות DC מקורם אבות הועברו (או אנדוגני) hematopoietic. ב7-10 ימים לאחר העברת אב, pDCs שעולה מהאבות העבירו adoptively נבדלו מתאי נמען עלבסיס של ביטוי סמן CD45, עם pDCs מCDPs הועבר להיות CD45.1 + ומקבלי להיות + CD45.2. היכולת של CDPs הועבר לתרום לאוכלוסיית PDC בPP ולהגיב לFlt3L הוערכה על ידי cytometry זרימה של השעיות תא בודדות PP מעכברי נמען. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק אם אוכלוסיות אב אחרות הן מסוגלים לייצר PP pDCs. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התפקיד של גורמים שהם חזו להשפיע על התפתחות PDC בPP, על ידי העברה תת אב עם מציאה מתאימה, נוקאאוט או ביטוי יתר של הגורם ו / או התפתחותי המשוערת על ידי מניפולציה ציטוקינים במחזור באמצעות HGT . שיטה זו גם עשויה לאפשר ניתוח של כמה pDCs PP משפיע על התדירות או פונקציה של תת חיסון אחר בPPS. תכונה ייחודית של שיטה זו היא השימוש בIfnar - / - עכברים, אשר מראה מדולדל קשות ביחס PP pDCs לבעלי חיים מסוג בר, ובכך allowiהכינון מחדש ng של PP pDCs בהעדר תופעות של בלבול מקרינה קטלנית.

התוצאות שלנו מראות אסטרטגית gating לבידודה של CDPs מתאי מח עצם של עכבר (איור 1), כמפורט בפרוטוקולים 2 ו -3. CDPs יהווה כ 0.1% בסך הכל תאי מח עצם, ויכול להיות מבודד בערך 4-6 x 10 4 CDPs מעכבר אחד. עם העברת מאמצת, CDPs להתמיין pDCs וcDCs 10. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51189/51189fig1highres.jpg" src="...

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא לבחון את יכולתם של תאי אב המטופויטיים מנוקים להוביל להיווצרות של תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים בתוך לוחות פייר (Peyer's patches) במעי לאחר העברה אדופטיבית. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע העברה גנטית הידרודינמית של פלסמיד, המקודד לגורם צמיחה לתאים דנדריטיים, FLT3 ligand, לעכברי פלסמציטואיד דנדריטיים פגומים בלוחות פייר.בשלב השני, תאי פרוגניטור דנדריטיים נפוצים מבודלים ממח עצם של עכברים מסוג בר (wild type) באמצעות הפרדה בחרוזי מגנט ומיון בזרימה (flow sorting). בשלב הסופי, תאי הפרוגניטור מועברים באופן אדופטיבי באמצעות הזרקה תוך-ורידית לעכברים עם ליקוי בתאי דנדריטיים פלסמציטואידיים בטלאי pyres, אשר טופלו באמצעות העברה גנטית הידרודינמית. לבסוף, ניתן להעריך את אוכלוסיית התאים הדנדריטיים הפלסמציטואידיים בטלאי ה-PI, שנגזרו מתאי הפרוגניטור ההמטופויטיים של התורם, באמצעות ציטומטריית זרימה.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהו מקורם ההתפתחותי של תאי ה-plasmacytoid dendritic הממוקמים בתוך ה-pyres patches. מעבר לכך ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מקורם של תאי ה-plasmacytoid dendritic ב-pyres patch, ניתן ליישמה גם כדי להבין כיצד תאי ה-plasmacytoid dendritic משפיעים על אוכלוסיות הלימפוציטים בתוך רקמות אלו.יומיים לפני ההעברה האימונית (adoptive transfer), הרחב את כלי הדם של חמישה עכברי מקבל knockout לרצפטור של interferon alpha חיוביים ל-CD 45 2 באמצעות חשיפה למנורת חימום למשך 5 עד 10 דקות. לאחר מכן, עבור כל עכבר, הנח את בעל החיים במכשיר קיבוע וחטא את הזנב באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, השתמש במחט בכיל 27 gauge כדי להזריק לווריד הזנב של כל בעל חיים חמישה מיקרוגרם של plasma and coating flit three ligands ושני מיליליטר של PBS סטרילי.עבור קבוצת הביקורת, הזרקו חמישה מיקרוגרם של וקטור ריק. לאחר מעקב אחר העכברים במשך 15 עד 30 דקות, החזירו אותם למתקן הגידול שלהם. ביום הניסוי, הניחו את ה-femur וה-tibia שנשלו מ-10 עכברי C 57 black six קונגניים חיוביים ל-CD 45 1 לתוך צלחת תרבית המכילה מצע גידול מלא.לאחר מכן, הכניסו מחט בכיול 27 gauge לקצה אחד של כל עצם והשתמשו במצע מלא כדי לשטוף את מח העצם אל תוך הצלחת, שלוש פעמים עבור כל עצם. ודאו שתאי מח העצם נשלפים על ידי אישור שהמצע שיוצא נראה עכור. הכינו סספנסיות של תאים בודדים על ידי פיפוט עדין של המצע מעלה ומטה שלוש עד חמש פעמים בתוך צלחת התרבית.לאחר מכן, הסר את השאריות על ידי העברת תאי מח העצם דרך מסננת תאים של 40 micrometer, ופרוק גושי תאים על ידי לחיצה עדינה עם קצה של בוכנת מזרק סטרילית. על גבי המסננת, סבב את התאים במערכת צנטריפוגה, הסר את העלייה (supernatants) ובצע ליזיס לתאי הדם האדומים ב-2 mL של תמיסת ליזיס לכל 4-6 × 10⁷ תאים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף 10 mL של FACS buffer לתאי מח העצם וסבב במערכת צנטריפוגה למשך ארבע דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר.לאחר שאיבה עדינה של הנוזל העליון, שטפו את המשקע ב-10 milliliters של fax buffer. לאחר מכן, צבעו את התאים באמצעות נוגדנים המזהים סמני שושלת המטופויטית, בהתאם להנחיות לצביעה ושטיפה של נוגדנים. דגרו את התאים עם חרוזי מיקרו מגנטיים מסוג goat anti rat.במהלך דגירת המיקרו-בידס, טענו עמודת max LD למפריד תאים מסוג MIDI max ושטפו מראש את העמודה עם שני מיליליטר של באפר fax. לאחר מכן, הניחו מבחנה קונית של 15 מיליליטר מתחת לעמודה וטענו לעמודה עד חמישה כפול 10 בחזקת 8 תאים ב-2.5 מיליליטר של באפר fax. שטפו את העמודה שלוש פעמים עם שני מיליליטר של באפר fax בכל שטיפה, תוך איסוף התאים השליליים לשושלת (lineage negative cells) העוברים דרך העמודה אל תוך המבחנה של 15 מיליליטר.ספרו את התאים שהופרשו. לאחר מכן, לאחר צביעת התאים עם הנוגדנים המתאימים המצומדים לפלואורופור, העבירו את הדגימה לנבובת FACS לצורך מיון של פרוגניטורים דנדריטיים נפוצים על בסיס פרופיל הסמנים הרצוי. אספו את התאים שפוייו ב-FACS לנבובת 15 milliliter המכילה חמישה milliliters של מצע גידול מלא, ובסיום ריצת ה-FACS רשמו את המספר המוחלט של התאים שמוינו.לאחר סבב ספינינג, לדללו את התאים בריכוז של 1×10⁵ של תאי אב דנדריטיים נפוצים מומחצים ל-100 µL נפח כולל של PBS סטרילי לכל עכבר, ושאבו את תוסיקי התאים למזרקים המצוידים במחטים בכיול 27 gauge. לאחר מכן, הזריקו את תאי האב חיוביים ל-CD45.1 לווריד הזנב של כל עכבר מקבל חיובי ל-CD45.2 עם נוקאאוט לרצפטור של interferon alpha, כפי שהודגם זה עתה. שבעה עד 10 ימים לאחר ההעברה האדופטיבית, הוציאו את המעיים מהעכברים שהוזרקו להם תאי אב דנדריטיים נפוצים והניחו את הרקמות על נייר סופג ספוג ב-PBS.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה ובמספריים כדי לאסוף את כל בלוטות פיירי (pyres patches) הנראות לאורך דפנות המעי הדק. שימו לב שבלוטות פיירי הן לעיתים שונות מבנית אפילו בתוך עכבר בודד, לכן יש להקפיד שכל בלוטות ה-P'S יזוהו ויבודדו. שטפו את בלוטות ה-P'S המבודדות שלוש פעמים בצלחת פטרי המכילה PBS, והשתמשו בפינצטה להסרת הצואה.לאחר מכן, בצעו עיכול של פיסות ה-P'S באמצעות collagenase four בריכוז 1 mg/mL ב-10 mL של HBSS בתוך בקבוק של 50 mL, תוך ערבוב נמרץ בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שעה, שפכו את פיסות ה-PIs שעברו עיכול למסנן תאים של 40 µm והשתמשו בבוכנה של מזרק סטרילי כדי לדחוף את התאים לשפופרת קונית של 15 mL. לאחר סבוב (centrifugation) של תרחיף התאים המסונן, השעיו מחדש את המשקע ב-6 mL של תמיסת 37% per call והעבירו אותו לשפופרת של 15 mL.לאחר מכן, מקטירים בעדינות ששה מיליליטרים של תמיסת Percoll 70% מתחת לשכבה כדי ליצור גרדיאנט מדורג של Percoll. כעת מפרידים את התאים במשך 20 דקות ב-800 ×g בטמפרטורת החדר ללא בלימה (break off). לאחר מכן אוספים את אוכלוסיית התאים החד-גרעיניים מהממשק.לאחר הצמדת התאים שנאספו (pelleting), שטפו אותם פעמיים ב-50 milliliters של מצע גידול מלא. לאחר מכן, צבעו אותם בנוגדנים המתאימים כדי לזהות את ה-PYS patch החיובי ל-CD 45 1. תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים הנובעים מפרוגניטורים חיוביים ל-CD 41 שהועברו באופן אדופטיבי.נתחו את התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה. ניתן לזהות את התאים הדנדריטיים הפלזמציטואידיים על פי הפנוטיפ שלהם: CD 11 C חיובי, clec H חיובי, PDCA one חיובי, B two 20 חיובי ו-CD 11 B שלילי. לבסוף, קבעו את המספר המוחלט של התאים הדנדריטיים הפלזמציטואידיים באמצעות משוואה זו.תרשימי נקודות אלו מראים את אסטרטגיית ה-gating לבידוד של פרוגניטורים דנדריטיים נפוצים. עבור תאי מח עצם של עכבר, כפי שהודגם כעת, פרוגניטורים דנדריטיים נפוצים מהווים כ-0.1% מסך תאי מח העצם, וניתן לבודד בערך ארבעה עד שישה כפול 10⁴ מתאים אלו מעכבר אחד כדי לזהות תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים בשיטת flow cytometry.נעשה שימוש באסטרטגיית gating ראשונית של פיזור קדימה ופיזור צדי, ולאחריה gating לתאים חיוביים ל-CD 11 C וחיוביים ל-clec H. עכברים עם נוק-אאוט של קולטן אינטרפרון אלפא מראים הפחתה משמעותית של תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים ב-pys patch בהשוואה לעכברי wild type. תאים פרוגניטוריים דנדריטיים נפוצים מתמיינים גם לתאים דנדריטיים קונבנציונליים.בניגוד לתאים דנדריטיים פלסמציטואידיים, תאים דנדריטיים קונבנציונליים CD 11 C חיוביים ו-clec H שליליים נצפים בכמויות דומות הן בעכברים מסוג wild type והן בעכברי knockout. לפיכך, עכברי knockout של רספטור לאינטרפרון אלפא מספקים הזדמנות לבחון שחזור של תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים ב-PS patch ללא ההשפעות של הקרנה קטלנית. העברה אדופטיבית של פרוגניטורים דנדריטיים משותפים מסוג wild type לעכברי knockout של רספטור לאינטרפרון אלפא, כפי שהודגם זה עתה, מעוררת עלייה בתאים דנדריטיים פלסמציטואידיים ב-PIs patch.יתרה מכך, טיפול מקדים באמצעות העברה גנטית הידרודינמית של ליגנד FL3 מגביר עוד יותר את התרחבות התאים הדנדריטיים הפלזמציטואידיים בטלאי ה-PIs, מה שמרמז כי פרוגניטורים דנדריטיים משותפים שהועברו, ואולי פרוגניטורים אנדוגניים חיוביים ל-FL3, מגיבים לליגנד FL3 על ידי השראת תאים דנדריטיים פלזמציטואידיים בטלאי pyrus. שני התנאים מעבבים גם ייצור של תאים דנדריטיים קונבנציונליים חיוביים ל-CD11C ושליליים ל-clecH, באופן העולה עם המקור ההתפתחותי של תאים דנדריטיים קונבנציונליים. תאים דנדריטיים פלזמציטואידיים בטלאי PYS ביטאו סממנים מסורתיים של תאים דנדריטיים פלזמציטואידיים, כולל clecH, PDCA1 ו-B220, והיו שליליים ל-CD11B. בנוסף, ניתוח של טלאי PYS מעכברי knockout לרצפטור של אינטרפרון אלפא, שקיבלו הן העברה גנטית הידרודינמית של ליגנד FL3 והן פרוגניטורים דנדריטיים משותפים שהועברו, מראה כי כ-70% מהתאים הדנדריטיים הפלזמציטואידיים נגזרים מפרוגניטורים דנדריטיים משותפים חיוביים ל-CD45.1 מהתורם.בסך הכל, נתונים אלו מדגימים כי העברה אדופטיבית של פרוגניטורים דנדריטיים נפוצים משרה את אוכלוסיית התאים הדנדריטיים הפלסמציטואידים ב-PIs patch בתגובה לאותים המתווכים על ידי FL three ligand in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד ולזהות תאי D פלסמציטואידים ב-pars patch.

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה ליצירת תאים דנדריטיים פלסמקיטואידים (pDCs) מתאי אב לימפואידים נפוצים (CLPs). לאחר תרבית משותפת של CLPs מטוהרים עם תאי הזנה מוקרנים γ בנוכחות ליגנד טירוזין קינאז-3 דמוי FMS (FL), CLPs מתמיינים ל-pDCs שאינם דבקים, שנוכחותם מאושרת באמצעות ציטומטריית זרימה.

דור חוץ גופי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מאבות לימפואידים נפוצים

יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

במחקר זה אנו מציגים מערכת תרבית במבחנה שיכולה לייצר ביעילות pDCs על ידי תרבית משותפת של אבות לימפואידים נפוצים עם תאי הזנה AC-6 בנוכחות ליגנד Flt3.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.

בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

כאן אנו מספקים פרוטוקול לסינון גורמי שעתוק פוטנציאליים המעורבים בפיתוח של תא דנדריטי (DC) באמצעות transduction lentiviral של shRNA כדי להשיג קווי תא נוק-אאוט יציבים עבור בידול במבחנה DC.

מחקר של התפתחות תאים דנדריטיים על ידי קצר סיכות ראש RNA מתווך RNA נוקאאוט גזע הגבעול Hematopoietic וקו תא האב הקדמה במבחנה

חקור את התפתחות תאי דנדריטים פלסמציטואידים מקדמי תאי דם בעכברים באמצעות העברה מאמצת של CDPs ו-FACS. שיטה זו מאפשרת הערכה של פוטנציאל התפתחות בתאי החיסון במעי.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

גלה סרטונים נוספים