הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לבחון את יכולתם של אבות המטופויאטיים מטוהרים להוליד תאים דנדריטיים פלסמציטואידים במדבקות פיר במעי בעת העברה לאימוץ. זה מושג על ידי ביצוע תחילה של העברת גנים הידרודינמית של הפלסמיד, המקודד את גורם גדילת התא הדנדריטי. השליכו שלושה ליגנד לתוך התיקון של PI פלסמציטואיד תא דנדריטי פגום בעכברים.

בשלב השני, תאי אב דנדריטיים נפוצים מבודדים ממח עצם מסוג בר על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים ומיון זרימה. בשלב האחרון, תאי האב מועברים באופן אימוץ על ידי הזרקה תוך ורידית לעכברים פגומים בתאי פלסמציטואיד פלסמציטואידים שטופלו על ידי העברת גנים הידרודינמית. בסופו של דבר, ניתן להעריך את אוכלוסיית התאים הדנדריטיים של תאי האב ההמטופויאטיים של התורם שמקורו ב-PI על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון מהו המקור ההתפתחותי של תאי הפלזמה Cy Dendri המתמקמים בתוך כתמי הפיראטים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מקורם של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים טלאי אש. ניתן ליישם אותו גם להבנת האופן שבו תאים דנדריטיים של פלסמציטואיד משפיעים על אוכלוסיות הלימפוציטים ברקמות אלה.

יומיים לפני ההעברה לאימוץ יש להרחיב את כלי הדם של חמישה עכברים שנקלטו בקולטן אלפא CD 45 2 תחת מנורת חום למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, עבור כל עכבר, הניחו את החיה במסננת וחטאו את הזנב עם 70% אתנול. לאחר מכן, השתמש במחט בגודל 27 כדי להזריק חמישה מיקרוגרם של פלזמה וציפוי שלושה ליגנדים ושני מיליליטר של PBS סטרילי לווריד הזנב של כל חיה.

עבור קבוצת הביקורת, הזריק חמישה מיקרוגרם של וקטור ריק. לאחר ניטור העכברים במשך 15 עד 30 דקות, החזירו אותם למתקן הדיור שלהם. ביום הניסוי, הנח את עצם הירך והשוקה המנותחים מ-10 CD 45 1 חיובי C 57 שישה עכברים שחורים לתוך צלחת תרבית המכילה מדיה שלמה.

לאחר מכן הכנס מחט בגודל 27 לקצה אחד של כל עצם והשתמש במדיה שלמה כדי לשטוף את מח העצם לתוך הצלחת שלוש פעמים בכל עצם. ודא שתאי מח העצם מוסרים על ידי אישור שהמדיה שנפלטת נראית עכורה. הכינו תרחיף תא בודד על ידי פיפטינג עדין של המדיה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים בצלחת התרבית.

לאחר מכן הסר את הפסולת על ידי העברת תאי מח העצם דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר ושבש את כל גושי התאים על ידי מריחה עדינה של קצה בוכנת מזרק סטרילית. על המסננת, סובב את התאים, הסר סופרנטנטים וכינים את כדוריות הדם האדומות בשני מיליליטר של חיץ ליזה לכל ארבע עד שש פעמים 10 לתאים השביעיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר של מאגר פקס לתאי מח העצם וסובב במשך ארבע דקות ב-500 פעמים G בטמפרטורת החדר.

לאחר שאיבת עדינות של ה-sup natin, שטפו את הכדור ב-10 מיליליטר של מאגר פקס. לאחר מכן, צבעו את התאים עם סמן שושלת המטופויאטי המזהה נוגדנים לאחר צביעת נוגדנים ושטיפה. דגרו על התאים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד חולדות עזים.

במהלך הדגירה של המיקרו-חרוזים, טען עמודת LD מקסימלית על מפריד תאים מקסימלי MIDI ושטוף מראש את העמודה עם שני מיליליטר של מאגר פקס. לאחר מכן הנח צינור חרוטי של 15 מיליליטר מתחת לעמודה וטען עד חמש פעמים 10 לתאים השמיניים ב-2.5 מיליליטר של מאגר פקס לעמודה. שטפו את העמודה שלוש פעמים עם שני מיליליטר של מאגר פקס בכל שטיפה, ואספו את התאים השליליים של השושלת העוברים דרך העמודה לתוך צינור ה-15 מיליליטר.

ספור את התאים החמקמקים. לאחר מכן, לאחר צביעת התאים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים מתאימים, העבירו את הדגימה לצינור פקס למיון האבות הדנדריטים הנפוצים על בסיס פרופיל הסמן הרצוי. אסוף את התאים המטוהרים של הפקס בשפופרת של 15 מיליליטר המכילה חמישה מיליליטר של מדיה שלמה, ולאחר מכן בסוף הפעלת הפקס רשום את המספר המוחלט של התאים הממוינים.

לאחר הסיבוב, התאים מדללים אחת פי 10 עד חמישית מהאבות הדנדריטים הנפוצים המטוהרים לנפח כולל של 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לעכבר ושואבים את מתלי התאים למזרק אחד המצויד במחטים בגודל 27. לאחר מכן הזרקו את תאי האב החיוביים CD 45 1 לווריד הזנב של כל עכבר נוקאאוט קולטן אלפא חיובי CD 45 2 כפי שהודגם רק שבעה עד 10 ימים לאחר ההעברה לאימוץ. הסר את המעיים מהתא הדנדריטי הנפוץ שהזריקו עכברים והניח את הרקמות על מגבות נייר ספוגות PBS.

לאחר מכן השתמש בזוג מלקחיים עדינים ומספריים כדי לאסוף את כל כתמי המדורות הגלויים לאורך דופן המעי הדק. שימו לב שכתאי האש לרוב נבדלים מבחינה מבנית אפילו בתוך עכבר יחיד, לכן הקפידו לוודא שכל כתמי ה-P'S מזוהים ומנותחים. שטפו את מדבקות ה-P המבודדות שלוש פעמים בצלחת פטרי המכילה PBS באמצעות מלקחיים להסרת הצואה.

לאחר מכן עכל את מדבקות ה-P'S עם מיליגרם אחד למיליליטר, קולגנאז ארבעה מתוך 10 מיליליטר של HBSS בבקבוק של 50 מיליליטר תוך ערבוב נמרץ ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שעה, שפכו את מדבקות ה-PIs המעוכלות למסננת תאים של 40 מיקרומטר והשתמשו בבוכנת מזרק סטרילית כדי לאלץ את התאים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר סיבוב מתלה התא המסונן, השעו מחדש את הגלולה בשישה מיליליטר של 37% לכל תמיסת שיחה והעבירו אותה לצינור של 15 מיליליטר.

לאחר מכן הנח בעדינות שישה מיליליטר של 70% לכל תמיסה לשיחה מתחתיה כדי ליצור שיפוע צעד לכל שיחה. כעת הפרד את התאים למשך 20 דקות ב 800 פעמים G בטמפרטורת החדר עם הניתוק. לאחר מכן אסוף את אוכלוסיית התאים החד-גרעיניים בממשק.

לאחר גלולת התאים שנאספו, יש לשטוף אותם פעמיים ב -50 מיליליטר של מדיה שלמה. לאחר מכן צבעו אותם בנוגדנים המתאימים כדי לזהות את מדבקת ה-PYS החיובית CD 45 1. תאים דנדריטיים פלסמציטואידים הנובעים מאבות חיוביים CD 41 שהועברו באימוץ.

נתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. ניתן לזהות את התאים הדנדריטים של הפלסמציטואידים על ידי CD 11 C חיובי ל-PDCA חיובי H PDCA אחד חיובי B שניים 20 חיוביים CD 11 B פנוטיפ שלילי. לבסוף, קבע את המספר המוחלט של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים באמצעות משוואה זו.

תרשימי נקודות אלה מצביעים על אסטרטגיית השער לבידוד של אבות דנדריטים נפוצים. עבור תאי מח עצם של עכברים, כפי שהוכח זה עתה, אבות דנדריטים נפוצים מהווים כ-0.1% מכלל תאי מח העצם ובערך ארבע עד שש פעמים 10 עד הרביעית. מבין התאים הללו ניתן לבודד מעכבר אחד כדי לזהות תאים דנדריטיים פלסמציטואידים של PI על ידי ציטומטריית זרימה.

נעשה שימוש באסטרטגיית שער פיזור ראשונית קדימה וצדדית ואחריה שער עבור תאים חיוביים ל-CD 11 C חיובי ל-H. עכברי נוקאאוט של קולטן אלפא אינטרפרון מציגים ירידה משמעותית בתאים דנדריטיים של פלסמציטואיד תיקון pys בהשוואה לעכברים מסוג בר. תאי אב דנדריטיים נפוצים מתמיינים גם לתאים דנדריטיים קונבנציונליים.

בניגוד לתאים דנדריטיים של פלסמציטואיד, CD 11 C חיובי, קלק H שלילי, תאים דנדריטיים קונבנציונליים נצפים בכמויות דומות הן בעכברים מסוג בר והן בעכברי נוק-אאוט. מכאן שעכברי נוקאאוט של קולטן אלפא אינטרפרון מספקים הזדמנות לבחון בנייה מחדש של תאים דנדריטיים של פלסמציטואיד מדבקת PS ללא השפעות של קרינה קטלנית. ההעברה המאמצת של אבות דנדריטיים נפוצים מסוג פרא לעכברי נוקאאוט של קולטן אלפא אינטרפרון כפי שהודגם זה עתה מעוררת עלייה בתאים דנדריטיים של PIs.

יתר על כן, טיפול מקדים בהעברת גנים הידרודינמיים של FL שלושה ליגנד משפר עוד יותר את התרחבות התאים הדנדריטים של פלסמציטואיד במדבקות PIs, מה שמרמז על כך שאבות דנדריטיים משותפים שהועברו ואולי שלושה אבות חיוביים אנדוגניים של FL מגיבים ל-FL שלושה ליגנד על ידי השראת תאים דנדריטיים של פלסמציטואיד תיקון פירוס. שני המצבים גם מעוררים ייצור תאים דנדריטיים קונבנציונליים חיוביים ל-CD 11 C שלילי התואם את המקור ההתפתחותי של תאים דנדריטיים קונבנציונליים. תאים דנדריטיים פלסמציטואידים של תיקון PYS ביטאו סמני תאים דנדריטיים פלסמציטואידים מסורתיים כולל clec H, PDCA אחד ו-B שניים 20 ו-LAC CD 11 B.In בנוסף, ניתוח מדבקות PYS מעכברי נוקאאוט של קולטן אלפא אינטרפרון המקבלים גם העברת גנים הידרודינמיים FL שלושה ליגנד וגם אבות דנדריטיים נפוצים שהועברו מראה שכ-70% מהתאים הדנדריטיים הפלסמוציטואידים נגזרים מאבות דנדריטיים נפוצים חיוביים CD 45 1

באופן קולקטיבי, נתונים אלה מדגימים כי העברה מאמצת של אבות דנדריטיים נפוצים גורמת לאוכלוסיית התאים הדנדריטיים של פלסמציטואיד תיקון PIs בתגובה לאותות מתווכים FL שלושה ליגנד in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולזהות תאי פלסמציטואיד D של תיקון pars.