Name: בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למדו פרוטוקול לבידוד תאי T כפול שליליים מכליות עכברים באמצעות עיכול קולגנאז, הפרדת שכבת צפיפות וסלקציה שלילית. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי של תאים אלה בפציעת כליה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH PBS (R21 AI095484). אנו מודים למתקן גרעין tetramer ביטוח בריאות ממלכתי לtetramer CD1d.

1. הכנת מכשירים, תרבות מדיה וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים: הכינו את חומרים כימיים בתנאים סטריליים ולהשתמש בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מדיום תרבית רקמת RPMI, להוסיף 5% בסרום שור עוברי, 2.1 גרם של סודה לשתייה, 10 מיליליטר גלוטמט 100x, 10 מ&quot;ג HEPES, פירובט מ&quot;ג נתרן 1 ו10 מיליליטר של 100x פניצילין / סטרפטומיצין. הערה: הבינוני מומלצת רקמות התרבות, RPMI, הוא להחלפה עם DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון 5% collagenase &quot;D&quot; (5 מיליליטר של collagenase &quot;D&quot; ל9 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון Percoll בשלושה ריכוזים שונים: 100%, 80% ו40%. הריכוזים הבאים מחושבים למדגם 1. שמור על פתרונות בטמפרטורת חדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Percoll: להוסיף 9 מיליליטר של Percoll חי (מפתרון מניות); להוסיף 1 מיליליטר של PBS 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Percoll: להוסיף 8 מיליליטר של Percoll 100%; להוסיף 2 מיליליטר של PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Percoll:להוסיף 4 מיליליטר של Percoll 80%; להוסיף 4 מיליליטר של PBS 1X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 ליטר של תא הקרינה המופעל מיון חיץ (FACS); להוסיף 5 מיליליטר BSA 10% (BSA 0.1%), 1 מיליליטר 10% אזיד הנתרן (0.1%), 2 סוכן מיליליטר EDTA, לעשות עד 1,000 מיליליטר עם 1X PBS. </li></ol> 2. הכנת עיכול כליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שרכש כל אישור מוסדי צורך, להקריב ולגרום לדימום מחודש העכברים עם שיטות סטנדרטיות ובעקבות התקנות הנוכחיות והנחיות טיפול בבעלי החיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם pentobarbital (0.07 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך exsanguination. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על שולחן ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תמיסת D collagenase לצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וdecapsulate שני הכליות מכל עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל abdomimal על ידי ביצוע חתך קו האמצע דרך עור הבטן והצפק מעצם החזה ועדהערווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הכליה השמאלית על ידי הזזת המעי רוחבית לצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד בזהירות את הקפסולה נשארה עם המלקחיים. הערה: הכמוסה מופיעה כשכבת שקופה המקיפה את הכליה ומכוסה חלקית על ידי רקמת שומן perinephric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכליה השמאלית על ידי חיתוך כלי pedicle באמצעות מספריים כירורגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו התהליך עבור הכליה הימנית. הערה: הכליה הימנית היא יותר גולגולתי ויותר קרובה לקו האמצע (pedicels הם קצרים יותר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכליה לתוך צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את רקמת הכליה לחתיכות קטנות (1-2 מ&quot;מ בממד) באמצעות סכין מתכת בעיצוב רגיל ומניח את החתיכות לתוך תמיסת collagenase ל30-45 דקות בחממה ב 37 ° C (איור 1). </li></ol> 3. הכנת תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC) מעיכול הכליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבל השעיה תא של הכליהעיכול על ידי מכאני לשבש את הרקמה באמצעות מסננת (70 מיקרומטר) ו resuspend ב 25 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה ב 4 מיליליטר של 40% פתרון Percoll ועדינות שכבה על גבי 4 מיליליטר של 80% פתרון Percoll עם טפטפת פלסטיק העברה, מאוד לאט ובזהירות. זה יגרום בשני שלבים מופרדים על ידי שכבה שקופה באופן ברור. בחלק העליון תהיה שכבה צהובה המתאימה לשומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 1,500 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר עם צנטריפוגות בבלם ממצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר על ידי שאיפה לשכבה הצהובה ועבה העליונה (כ 1-2 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השכבה הקלה בלבד לבנבן השקופה מהממשק של שני השלבים עם טפטפת העברה. להעביר בזהירות השעיה זו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של מדיום תרבית רקמה ולאחר מכן להוסיף 13 מיליליטר של מדיום כדי להפוך את הנפח כולל של15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הדגימות ב 1 מיליליטר של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר KMNC באמצעות הרחקת trypan הכחולה על hemocytometer ולבטא אותן התוצאות כמו מספרים של KMNC למ&quot;ל לכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם כאמור לעיל. </li></ol> 4. תאי בידוד של hematopoietic (+ CD45) מKMNC (שלב I) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עד 10 7 ל90 μl של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של microbeads CD45 ודגירה של 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של החיץ פועל כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות ב 4 ° C ו resuspend ב 500 μl של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העמודה המגנטית על ידי הצבת במגנט ולשטוף עם 3 מיליליטר של הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את ההשעיה התא דרך העמודה המגנטית ולאסוף את התאים ללא תווית שעוברים דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 3 מיליליטר של running חיץ. ואז לאסוף את השפכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמפריד ופיפטה 5 מיליליטר של חיץ פועל על גבי העמודים ולשטוף את החלק שכותרתו באופן מיידי. חלק זה מכיל את CD45 + התאים. ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את המספר המוחלט של תת קבוצות תאי T שונות לתוך הכליות להכפיל את המספר הכולל של KMNC ידי אחוז התאים החיוביים שנקבע על ידי cytometry זרימה (איור 2). </li></ol> 5. בידוד של תא T מDN CD45 + ההכנה על ידי סלקציה שלילית (שלב II) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר, מיקרוגרם 1.25) של כל אחד מנוגדני biotinylated הבאים: אנטי CD4, אנטי CD8, קולט אנטי-FC (CD16/32), אנטי-MHC הכיתה השני (IA ב), אנטי tetramer CD1d PBS-57 לכל 10 תאים 7 hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 30 דקות בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 microbeads אנטי ביוטין מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בחדר קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בtהוא המגנט ולהמשיך לדלדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי קיימא כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי DN T בחלק השלילי באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק טוהר תאי DN T עם cytometry זרימה על ידי ביצוע אסטרטגית gating זה: + CD45 השער ראשון, שער השני TCRαβ +. תכלול CD1d + תאים. עלילה מסוג CD4 + CD8 + לעומת לזהות תאי DN T (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של אחוז שנקבע בטהרה. הערה: שימוש בתוצאות פרוטוקול זה באוכלוסייה של תאי DN T יותר מ 90% טהורים. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

יש עניין גובר בתאי T DN שכן הם נמצאים מעורבים בתנאים פתולוגיים שונים כגון הפרעות אוטואימוניות, סרטן, סובלנות שתל, ומחלות עיקריות של הכליות כולל פציעת כליות חריפה (AKI), גלומרולונפריטיס 8, 13. לכן, יש צורך להבין טוב יותר ולאפיין את פונקציות pathophysiologic של תאי T DN. עם זאת, כיום יש חוסר בהבנה של התפקוד של התאים אלה בהשוואה לתאי CD4 ו CD8 T. סיבה העיקרית היא מחסור בתאי T DN באיברי הלימפה משניים ומכאן קושי בהשגת תאים מספיקים לניתוח במבחנה וניסויים העברת מאמצת....

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

ההיקפית αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - כפולה שלילי תאים (DN) T מחולקים לקבוצות משנה שונות שיש להם פנוטיפים ופונקציות 1-4 מובחנים. תאי T DN גרוע הם הבינו, אבל יותר ויותר להיות מעורבים בתגובות חיסונית pathophysiological במודלים של מחלות שונות 4-6. תאי T DN הם סוג תא חיסון ייחודי כי הוא מעורב יותר ויותר ברגולציה של תגובות חיסוניים ומחלות אוטואימוניות שונות והאפנון של סובלנות allotransplant. 4-6, 9 הם נדירים בדם ההיקפי ואיברי הלימפה משניים (בלוטות לימפה וטחול ). עם זאת, הם תושבים עיקריים של האפיתל בכליות ומעיים הנורמלי 10-12. מעט מאוד ידוע על תפקידם 7 בכליות במצב היציב ותחת מצבים פתולוגיים כגון פגיעה אקוטית בכליות (AKI) הקשורים transpl כליותנמלה. בגלל התפקידים המורכבים של תאים חיסוניים שונים בויסות תגובה חיסונית כולל alloresponses, המגדיר את תפקידו של כל שחקן הוא קריטי בהבנת alloresponses ועיצוב תרופות חדשות. בהתחשב במספרים המשמעותיים של תאי T DN הווה בכליות בתנאים פיסיולוגיים ומחלות שונים, תאי T DN עשויים לשחק תפקיד קריטי בויסות תגובה חיסונית ומחלות אוטואימוניות בעכברים ובבני אדם, וalloresponses במושתלים. צבירה למרות שראיות עדיין מפוזרות מפלילה תאי DN T בשתי פונקציות פתוגניים ומדכאות את מערכת חיסון, אבל הוא הבין למה ואיך הם מפגינים פונקציה מזיקה או מדכאת ספציפית ואיך הסביבה משפיעה עליהם בצורה גרועה. בשל השפע הנמוך שלהם בכליות, שיטות משופרות של בידוד נחוצות. אין כרגע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד של תאי T מDN tהוא רקמות שאינן הלימפה. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה חדשה לבידוד של תאי T DN מהכליות; עם זאת, השיטה יכולה לשמש גם לרקמות שאינן הלימפה שונות.

<table><tbody><tr><td>קולט אדים למינארי&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>או ציוד שווה ערך&nbsp;</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>או ציוד שווה ערך&nbsp;</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>חממה מבוקרת אטמוספירה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>&nbsp;( 37 מעלות; C עם 5% CO2)</td></tr> <tr><td>ציטומטר זרימה אנליטית</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% נתרן אזיד (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>בופר פוספט מאגר מלח (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA buffer&nbsp;</td><td>טורים של Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ מיקרו-חרוזים</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזי ביוטין&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD45 (שיבוט: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD45 (שיבוט: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-TCR פסיפיק בלו&nbsp; (שרשרת ab, שיבוט: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biotinylated (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 biotinylated&nbsp; (שיבוט 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-MHC Class II (I-A b) מאגר ריצה ביוטיניל</td><td></td><td>BD</td> 553609-AutoMACS <td></td></tr><tr><td>- מאגר הפרדה של MACS&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>כליות - בלוטות לימפה</td></tr><tr><td>צלחת פטרי&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 & #956; מסנן M&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>בוכנה&nbsp;</td><td></td><td></td><td>או ציוד שווה ערך&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות GeneMate 50 מ"ל</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>או ציוד שווה ערך&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות GeneMate 15 מ"ל</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>או ציוד שווה ערך&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galcer tetramer</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי t αβ כפול שליליים מהכליות

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

אין כרגע פרוטוקול סטנדרטי לבידוד של תאי T DN מהרקמות שאינן הלימפה למרות המעורבות דיווחה יותר ויותר שלהם בתגובות חיסוניים שונות. תאי T DN הם סוג תא חיסון ייחודי שהיה מעורב בויסות תגובות וסובלנות חיסוניים ואוטואימוניות לallotransplants 1-6. תאי T DN, לעומת זאת, נדיר בדם היקפי ואיברים משניים הלימפה (בלוטות לימפה וטחול), אבל הם התושבים עיקריים של הכליות תקינות. מעט מאוד ידוע על תפקוד pathophysiologic 7 בשל מיעוטם בפריפריה. לאחרונה תיארו ניתוח פנוטיפי ופונקציונלי מקיף של אוכלוסייה זו בכליות 8 במצב יציב, ובמהלך פגיעת reperfusion איסכמיה. ניתוח של תפקוד תא T DN יהיה משופר מאוד על ידי פיתוח פרוטוקול לבידודם מהכליה. כאן אנו מתארים פרוטוקול רומן המאפשר isolation של תאים טהורים מאוד ab מסוג CD4 + CD8 + T ותאי T DN מהכליות העכבריות. בקצרה, אנחנו לעכל רקמת כליה באמצעות collagenase ובודד תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC) על ידי שיפוע צפיפות. זה ואחריו שני צעדים להעשרת תאי T hematopoietic מ -3% ל 70% מKMNC. הצעד הראשון מורכב מסלקציה חיובית של תאי hematopoietic באמצעות CD45 + ערכת בידוד. בשלב השני, תאי T DN מבודדים באופן שלילי על ידי הסרת תאים הלא רצויים באמצעות CD4, CD8, וMHC הכיתה השני נוגדנים חד שבטיים וtetramer α-galcer CD1d. אסטרטגיה זו מובילה לאוכלוסייה של תאי DN T יותר מ 90% טהורים. צביעת משטח עם הנוגדנים שהוזכרו לעיל ואחרי ניתוח FACS משמשת כדי לאשר את טוהר.

כליות סוג בר C57BL / 6 (B6) מכילה כ 1.5-2.1 x 10 6 תאים חד גרעיניים לכליות. כ פחות מ -10% הם CD45 + תאי hematopoietic. להכנת תאים חד גרעיניים בכליות (KMNC), הכליות לחתוך לחתיכות קטנות כפי שמוצגים באיור 1 ואחרי עיכול באמצעות collagenase 5%. זה ואחריו על ידי ביצוע צנטריפוגה שיפוע צפיפות לאסוף שכבת KMNC (איור 2, פנל משמאל). KMNC אז היו נתונים לסלקציה חיובית באמ...

תאי DNabT הם נדירים בין תאי T היקפיים; עם זאת, הם נמצאים בשפע ברקמות שאינן הלימפה מסוימות. קושי של בידוד תאי T DN מרקמות שאינן הלימפה מעכב אנליזה הפונקציונלית שלהם למרות במיוחד גדל הבחין במשמעות pathophysiologic. אנו מתארים פרוטוקול חדשני לבידוד של תאי T DN נקיים במיוחד מכליות עכבריות.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתאר כיצד לבודד תאי T טהורים ובעלי סימון שלילי כפול מכליות עכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי עיכול הכליה בתמיסת קולגנאז. לאחר מכן, תאים חד גרעיניים מופרדים באמצעות מדרג צפיפות, ותאים המטופואטיים חיוביים ל-CD 45 נאספים על ידי ברירה חיובית.בסופו של דבר, ניתן לבודד את תאי ה-T הבעליים לשני סממנים שליליים (double negative) באמצעות סלקציה שלילית. בשנת 1998, הצוות שלנו גילה כי תאי מערכת החיסון, ובמיוחד תאי T, תיווכו פגיעה חריפה בכליות, בניגוד לדוגמה המדעית המקובלת באותה עת. מספר התאים הללו בכליות ובלב היה נמוך מאוד כדי לאפשר מחקר, ולכן פיתחנו טכניקה המאפשרת לחקור אותם בצורה טובה יותר.הופתענו למצוא אוכלוסייה של תאי T כפולי-שליליים (double negative T-cells), ללא CD4 או CD8, שהיו בריכוז גבוה הן בכליה תקינה והן בזמן פגיעה. הטכניקה המפורטת והמשופרת ללימוד מעמיק יותר של תאים אלה ולבחינת המנגנוים תתוארה בסרטון זה. אנו חוקרים תאי T כפולי-שליליים מאז שנת 2001, ולאחרונה שיתפנו פעולה עם המעבדה של ד"ר Rob כדי לשנות את השיטה האזורית לבידוד תאים אלה, במטרה להפיק אוכלוסייה טהורה שניתן להשתמש בה למגוון תגובות חיסוניות ביולוגיות.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות על תאי החסינות בכליה, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כגון רקמות שאינן לימפטיות. לפני תחילת הניתוח, ראשית, העבירו 10 milliliters של collagenase D לצלוחית פטרי לאספירת רקמות. לאחר מכן, רססו את אזור הבטן של עכבר שהורג (euthanized) ב-70% ethanol.לאחר מכן, בצעו חתך בקו האמצע דרך עור הבטן והפריטונאום מהסטרנום עד לעבס, ואז הזיזו את המעיים לצד כדי לחשוף את הכליה השמאלית. זהו את הקפסולה השמאלית, הנראית כשכבה שקופה העוטפת את הכליה ומכוסה בחלקה על ידי רקמת שומן פרינפרית (perinephric adipose tissue), והפרידו אותה בזהירות מהכליה באמצעות פינצטה. לאחר מכן, חתכו את כלי הדם של הפדיקל (pedicle vessel) בעזרת מספריים כירורגיים כדי להסיר את הרקמה, והניחו את הכליה בתוך צלחת פטרי.לאחר הסרת הכליה הימנית, השתמש בלהב עיצוב מתכתי רגיל כדי לחתוך את רקמת הכליה לחתיכות קטנות של 1 עד 2 מילימטר. עשה עיכול לחתיכות בתמיסת קולגנאז למשך 30 עד 45 דקות ב-37 °C, ולאחר מכן, כדי לבודד את התאים חד-גרעיניים של הכליה, פצפץ מכנית את תגכילי הכליה דרך מסננת של 70 מיקרון. השהה מחדש את תליית התאים ב-25 מיליליטר של מצע לתרבית רקמות.לאחר ערבוב עדין, סובבו את התאים במערך צנטריפוגה ושחזרו את המשקע בארבעה מיליליטרים של תמיסת Percoll בריכוז 40%. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כדי להניח בעדינות את תמיסת התאים ב-Percoll מעל לארבעה מיליליטרים של תמיסת Percoll בריכוז 80%, כך שיווצרו שני פאזים המופרדים בבירור על ידי שכבה שקופה. הפרידו את התאים במשך 30 דקות ב-1500 Gs ובטמפרטורת החדר עם בלימה (brake off), ולאחר מכן שאבו כ-1 עד 2 מיליליטרים מהשכבה העליונה העבה, הצהובה והמכילה ליפידים.השתמשו בפיפטת העברה חדשה כדי לאסוף את השכבה השקופה-לבננה מהממשק שבין שני הפאזים אל תוך מבחנה קונית של 15 milliliter המכילה שני milliliters של מצע תרבית רקמה. לאחר מכן, הוסיפו 13 milliliters של מצע כדי להביא את הנפח הכולל ל-15 milliliters. לאחר השטיפה והספירה, דללו את התאים ל-1 × 10⁷ ב-90 µL של running buffer.לאחר מכן, דגרו את התאים ב-10 µL של חרוזי CD 45 מגנטיים בטמפרטורה של 4 °C. לאחר 15 דקות, הוסיפו 1 mL של running buffer כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים והשתמשו בהם שוב.שHו את המשקע ב-500 µL של running buffer טרי. לאחר מכן, מקמו עמודה במגנט להפרדת חרו지를 ושטפו את העמודה עם 3 mL של running buffer. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים דרך העמודה המגנטית, תוך איסוף התאים הלא-מסומנים העוברים דרך העמודה.שטפו שלוש פעמים את המבחנה המכילה את התאים עם שלושה מיליליטרים של running buffer, תוך כדי איסוף השאיפה בכל פעם, ולאחר מכן הוציאו את העמודה מהמגנט. העבירו באמצעות פיפטה חמישה מיליליטרים של running buffer אל העמודה ושטפו באופן מיידי את הפרקציה המסומנת המכילה את התאים החיוביים ל-CD 45. לאחר ספירת התאים, דגרו אותם עם 2.5 µL מכל אחד מהנוגדנים הביוטיניליים הללו עבור כל 1×10⁷ תאים המטופויטיים בטמפרטורה של 4 °C.לאחר 30 דקות, דגרו את התאים למשך חצי שעה נוספת בטמפרטורה של 4 °C במיליליטר אחד של חרוזי מיקרוביאדס אנטי-ביוטין. הניחו עמודה חדשה במגנט ולאחר מכן העמיסו את התאים על העמודה כפי שהודגם כעת, כאשר הפעם אספו את הפראקציה השלילית. לבסוף, ספרו את התאים החיים כדי לקבוע את המספר הכולל של תאי T כפולי-שליליים בפראקציה השלילית והכפילו מספר זה באחוז הטוהר כפי שנקבע בניתוח זרימה ציטומטרית.בעוד שכליות של עכברי C57BL/6 מכילות בערך 1.5 עד 2.1 × 10⁶ תאים חד-גרעיים לכליה, פחות מ-10% מהם הם תאים המטופואטיים חיוביים ל-CD45. לאחר סבב של סבב צנטריפוגה במדרג צפיפות לאיסוף שכבת התאים החד-גרעיים מהכליה, ניתן לטהר את התאים החיוביים ל-CD45 לרמה של כ-80% עד 95% באמצעות הפרדה מגנטית של חרוזים חיוביים ל-CD45. מבין התאים ההמטופואטיים המועשרים החיוביים ל-CD45, כ-30% עד 60% הם תאי T כפולי-שליליים.סלקציה שלילית של תאי CD 45 חיוביים להסרת תאים חיוביים ל-CD 4, CD 8, MHC class two וטטראמר, מביאה לקבלת תאי T כפולי-שליליים בדרגת טוהר גבוהה של 90% עד 95%. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להשיג עד 0.5 $\times$ 10⁶ תאים המטופואטיים CD 45 חיוביים המסומנים מגנטית לכל עכבר. הליך זה יספק הבנה טובה יותר של הפונקציות הביולוגיות ומנגנוני הפעולה של תאי T כפולי-שליליים ברקמות שונות.

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בידוד של לימפוציטים באמצעות MACS Miltenyi ערכת מהווה דרך אמינה לטהר תאים שלמים homogenates רקמת הלימפה. תאים מטוהרים באמצעות מערכת Miltenyi הם בדרך כלל ≥ 96% טהור. הנה, אנחנו מדגימים את הצעדים שננקטו כדי לבודד תאים מסוג CD4 + T, אחת ערכות רבים המוצעים על ידי Miltenyi.

בידוד של תאים מסוג CD4 + T מ בלוטות לימפה עכבר באמצעות טיהור Miltenyi MACS

הסרטון מסביר דרך לטהר תאי B על ידי מיקוד אימונומגנטי והפרדה מהשעיית תאי דם חד-גרעיניים היקפיים. השיטה כוללת סימון סוגי תאים לא רצויים עם נוגדנים או ליגנדים ספציפיים (הקשורים לחלקיקים מגנטיים) המכוונים לחלבונים ספציפיים על פני התא, כדי להתרוקן מתרחיף התא ההטרוגני על ידי הפרדה מגנטית.

ברירה אימונומגנטית שלילית: שיטה לטיהור תאי B מתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

סרטון זה מדגים פרוטוקול לבידוד מבוסס תיוג מגנטי של אוכלוסייה בריכוז נמוך של תאי T CD4+Vδ1+γδ מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). באמצעות שילוב של נוגדנים מצומדים נגד Vδ1 FITC, מיקרו-חרוזים מגנטיים נגד FITC וחרוזים על-פאראמגנטיים מצופים נוגדנים נגד CD4, תאי T CD4+Vδ1+ יכולים להיות מטוהרים בהצלחה מאוכלוסיית PBMC.

בידוד סלקטיבי של תאי T CD4+ Vδ1+ γδ מתאי דם מונוגרעיניים היקפיים אנושיים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול אופטימלי לבידוד ושיבוט של ישות תאי T הנדירה של תאי T Vδ1+CD4+ היקפיים, שהיא, כפי שהראינו לאחרונה, אב תאי T αβ חוץ-תימיים. טכניקה זו מאפשרת לבודד כמותי, לשכפל ולהרחיב ביעילות תאים אלה בתרבית ex vivo.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

טכניקות אמינות ויעילות לבידוד תאי חיסון כליות נחוצות ליישומים במורד הזרם. זה דורש תיוג נוגדנים על פני השטח של מספר קטן של תאי חיסון כליות. כאן אנו מתארים שיטה תמציתית לבידוד תאי חיסון בכליות שלכאורה משיגה מטרה זו.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.

במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים

כאן אנו מציגים כיתה קליניים הרומן בידוד ותרבות שיטה כליות Perivascular סטרומה תאים (kPSCs) המבוסס על כל האיבר זלוף עם אנזימי עיכול והעשרה תא NG2. בשיטה זו, אפשרי לרכוש מספרי הטלפון הנייד מספיק לתרפיה תאית.

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי מדם שלם המתקבל מחולים שאובחנו עם תסמונת סזארי, ולאחר מכן בחירה של תאי CD4+ T, הגירוי שלהם עם phorbol12-myristate13-acetate ו-A23187 ionophore, והכנת RNA ליצירת פרופיל שעתוק.

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

בעקבות זיהום ויראלי, הכליות מטפחות מספר גדול יחסית של תאי CD8+ T ומציעות הזדמנות לחקור תאי TRM שאינם ריר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד לימפוציטים כליות העכבר לניתוח ציטומטריה זרימה.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מכליות עכבר קפואות המשפרים את ייצוג סוגי תאי הכליה המדולריים ומונעים את ביטוי הגנים מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

פרוטוקול זה מתאר הליך הישרדות לכריתת לימפאדנקטומיה כלייתית דו-צדדית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב.

כריתת לימפהדנקטומיה דו-צדדית של עכברים

למדו פרוטוקול לבידוד תאי T כפול שליליים מכליות עכברים באמצעות עיכול קולגנאז, הפרדת שכבת צפיפות וסלקציה שלילית. השיטה מאפשרת ניתוח תפקודי של תאים אלה בפציעת כליה.

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

גלה סרטונים נוספים