מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS
22 בינואר 2014
כתב יד זה מציג טכניקה כדי להחיל או לשחרר כוחות על תאים או רקמות חסיד באמצעות מתיחה חד כיווני.
המטרה הכללית של הליך זה היא למתוח תאי תבנית על ממברנה גמישה של פולי-דימეთיל-סילוקסאן או PDMS. דבר זה מושג על ידי הכנת גליון PDMS, ולאחר מכן יישום של מיקרו-תבנית על ה-PDMS. גליון ה-PDMS בעל מיקרו-התבנית מורכב לאחר מכן על מכשיר המתיחה, ומעל לזה מונח מאגר לשמירה על המצע.
בשלב הבא, התאים נזרעים על פני השטח של גילי ה-PDMS בעל התבנית המיקרוסקופית וממתינים להיקשרותם לתבנית לפני שטיפה להסרת תאים שלא נקשרו. השלב הסופי הוא הפעלת מאמץ מתיחה על ה-PDMS המכיל את התאים כדי למתוח את התאים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה וידאו כדי להראות כי הפעלת כוחות על סיבי ההסגה של תאי יונקים במצב מיטוזה בעת מתיחת התא גורמת לעיוות של התא.
שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביומכניקה, כגון מהן ההשפעות של כוחות חיצוניים על תהליכים תאיים כמו חלוקה? הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו להפעיל כוחות על תא הנמצא בתהליך חלוקה; ראשית, גזרו חתיכה של PDMS בגודל של כ-35 על 20 מילימטרים מגיליון מוכן מראש. כאן, נעשה שימוש בגיליון PDMS דק הזמין מסחרית, מכיוון שהוא בעל שחזוריות גבוהה יותר וסיכוי נמוך יותר לשבירה בהשוואה ל-PDMS המיוצר בהתאמה אישית.
הסיר את שכבות המגן העליונה והתחתונה של הפלסטיק והשתמש בפינצטה כדי להניח את ה-PDMS בתוך צלחת פטרי מפלסטיק. לאחר מכן, שטוף את ה-PDMS ב-70% ethanol למשך חמש דקות על גבי רוטטור ב-30 תנודות לדקה. לאחר השטיפה, ייבש את פני השטח על ידי הזרמת אוויר עליהם.
בשלב הבא, חשפו את ה-PDMS לאור על-סגול עמוק למשך חמש דקות, במרחק של כחמישה סנטימטרים מנורות העל-סגול. בינתיים, הכינו תמיסת E-D-C-N-H-S כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. יש להכין את התמיסה רגע לפני השימוש, מאחר שהתגובתיות של התמיסה דועכת בתוך מספר שעות.
העבירו את דפי ה-PDMS מתוך צלחת הפטרי למכסה של צלחת הפטרי, שלא נחשף לאור. פעולה זו תבטיח שהסביבה של ה-PDMS תהיה הידרופובית מאוד ותקל על השלב הבא.
העבירו באמצעות פיפט את תמיסת ה-E-D-C-N-H-S על גבי ה-PDMS והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, שטפו את עודפי ה-E-D-C-N-H-S במים.
בשלב הבא, הוסיפו את תמיסת ה-PEG המורכב PLL והדגירו בין שלוש שעות ללילה שלם בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, שטפו את שאריות ה-PEG המורכב PLL מה-PDMS באמצעות מים. ה-PDMS כעת פסיבי או פונקציונלי עם PEG המורכב PLL וניתן לאחסן אותו למשך מספר ימים בטמפרטורה של 4 °C. כדי ליצור תבנית על ה-PDMS, הניחו גילי PDMS על מסכת פוטו-קוורץ סינתטי הנושאת את המאפיינים המיקרוסקופיים לתבנית.
הניחו את צד ה-PDMS הנושא את ה-PEG המורכב ב-PLL כשהוא פונה לצד הכרום של המסכה הפוטוגרפית. לאחר מכן, הקרינו במשך שבע דקות דרך המסכה הפוטוגרפית, במרחק של כחמישה סנטימטרים מנורות העובן (ultraviolet). לאחר ההקרנה.
הוסיפו מים על המסכה ועל ה-PDMS ולאחר מכן קלפו באיטיות את ה-PDMS מהמסכה. רכבו את ה-PDMS שעבר פסיבציה קודם לכן על מכשיר המתיחה. חברו צד אחד של ה-PDMS לחלק הקבוע של המותח. קבעו את הצד השני לחלק הנייד של המותח, תוך הקפדה שלא למעוך חלק גדול מדי מגיליון ה-PDMS.
אם ה-PDMS מהודק יתר על המידה, הוא מתקצר, דבר שעלול להוביל לשבירה כיוון שהמתיחות תהיה גבוהה יותר עבור אותו מרחק מתיחה. ודאו שהברגים מהודקים היטב, אחרת גיליון ה-PDMS יחליק מיד עם תחילת המתיחה, או בשלב מאוחר יותר במהלך הניסוי. לאחר מכן, דגרו את ה-PDMS עם תמיסת פיברונקטין למשך שעה אחת.
בטמפרטורת החדר, ניתן להשתמש בחלבונים אחרים של המטריצה החוץ-תאית, אך אלו לא נבחנו בפרוטוקול זה. כשלב סופי, שטפו את ה-PDMS בתמיסת PBS (phosphate buffered saline). לאחר מכן, גזרו מלבן של PDMS מתוך לוח PDMS עבה.
לאחר מכן, גזרו מלבן נוסף בפנים. כדי ליצור בריכה שתשמור על התאים והמדיום, מרחו גריז סיליקון מתחת לחלק ה-PDMS הגזור בצורת מלבן והניחו אותו מעל גיליון ה-PDMS כדי ליצור בריכה לשמירה על המדיום. הגריז יאפשר להחליק את הבריכה מעל גיליון ה-PDMS במהלך המתיחה לצורך דפוס התאים.
ראשית, נתקו את התאים מבקבוק תרבית ב-50% תוך כדי תפזורת (confluency). לאחר שהתאים נמצאים בסוספנזיה, העבירו אותם בפיפט מספר פעמים באמצעות טיפ של 200 µL כדי לפרק צברים, דבר שיבטיח שכל תא יקשר לתבנית באופן פרטני. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של סוספנזיית התאים לתוך הבריכה.
הניחו לתאים להיקשר לתבניות למשך 10 עד 30 דקות, בהתאם לסוג התא, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שהתאים נקשרו לתבניות, שטפו בעדינות את התאים הצפים באמצעות מצע מאוזן כדי להסירם.
הסיר את המצע באמצעות פ pipette שאיבה תוך כדי הוספה סימולטנית של מצע. קריטי לשמור על זרימה מספקת כדי לשטוף תאים שאינם מודבקים, תוך השארת התאים טבולים במצע. לאחר מכן, הנח כיסוי זכוכית (cover slip) מעל למאגר כדי למנוע התאיידות ודליפת מצע במקרה של שבירה של ה-PDMS, ואפשר לתאים להיפרס למשך מספר שעות על התבניות.
לאחר מכן, הניחו את המכשיר על מיקרוסקופ הפוך והתחילו בצילום. הימנעו משימוש בעדשות טבילה בשמן, כיוון שהן לא יעבדו בשל בעיות מיקוד. כדי למתוח את התאים בתבנית המיקרוסקופית, סובבו את בורג המיקרומטר תוך תיקון מיקום השולחן בצירים x, y ו-Z.
יש לתקן את מיקום השלב כדי לפצות על התרחבות ה-PDMS ואובדן המיקוד. הטכניקה המוצגת בפרוטוקול וידאו זה אפשרה הפעלת כוחות על סיבי נסיגה (retraction fibers) של תאי יונקים במצב של מיטוזה, על ידי מתיחת התשתית בתחילת המטפאזה. חלק מסיבי נסיגה אלו נמשכו הרחק מגוף התא, מה שהביא להפעלת כוח מכני על קורטקס התאים המיטוטיים; כדי להשיג זאת, התא מושב על תבנית אובלית לפני המתיחה.
הדפוס נוצר כאשר ה-PDMS נמתח במהלך החטבה של תבניות עגולות דרך מסיכה פוטוגרפית. לאחר המתיחה, התשתית נמתחת כך שהדפוס הופך למעגל. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזרוע תאים על דפוסים מאקרוסקופיים ולאחר מכן להפעיל כוחות מתיחה על התשתית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
כתב יד זה מציג טכניקה להפעלת או שחרור כוחות על תאים או רקמות נצמדים באמצעות מתיחה חד-כיוונית. השיטה כוללת מתיחה של תאים בעלי תבנית על ממברנה אלסטית של poly dimethyl siloxane (PDMS).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- הנדסת רקמות
- ביומכניקה
רקע
- תאים נצמדים עשויים להיות מושפעים מכוחות מכניות.
- מתיחה של תאים יכולה להשפיע על התנהגותם ותכונותיהם.
- PDMS משמש באופן נפוץ ליצירת מצעים גמישים.
- הבנת תגובת התאים לגירויים מכניים היא קריטית ליישומים שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להפעלת כוחות מכניים על תאים.
- בחינת ההשפעות של מתיחה על התנהגות תאיים.
- שימוש במיקרוסקופיה של וידאו לצפייה בתגובות תאיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של יריעת PDMS עם תבניות מיקרוסקופיות.
- הרכבת ה-PDMS על מכשיר מתיחה.
- זריעת תאים על פני השטח עם התבניות המיקרוסקופיות.
- הפעלת מאמץ מתיחה להארכת התאים.
תוצאות עיקריות
- הצמדה מוצלחת של תאים ל-PDMS בעל תבנית מיקרוסקופית.
- הפעלת כוחות הובילה לעיוות של תאי יונקים בשלב המיטוזה.
- מיקרוסקופיה בווידאו תיעדה ביעילות את תהליך המתיחה.
- השיטה מספקת תובנות לגבי מכניקת התא במהלך המיטוזה.
מסקנות
- הטכניקה מאפשרת גרייה מכנית מבוקרת של תאים.
- ניתן להשתמש בה כדי לחקור תגובות תאיות לכוחות מכניים.
- לגישה זו פוטנציאל ליישומים בהנדסת רקמות וברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גירוי מכני של תאים נצמדים מאפשר בחינה של מסלולי איתות תלויי-כוח הקריטיים לתיקוף מטרות בביולוגיה מכנית (mechanobiology). שיטה זו תומכת בסריקה פנוטיפית על ידי הפעלת מתיחה מבוקרת וניתנת לשחזור על תאים בעלי תבנית מיקרוסקופית, ובכך מסייעת בהפחתת סיכונים של היפותזות הקושרות מכניקה תאית למנגנוני מחלה. הגישה מספקת תוצאים כמותיים התואמים לדימות, אשר מגבירים את הביטחון החזוי בתהליכי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של האופן שבו כוחות חיצוניים משפיעים על התקדמות המיטוזה ועל הדינמיקה הקורטיקלית בתאי יונקים.
- ערך תפעולי: משתמש בתבניות מיקרוסקופיות (micropatterning) הניתנות לשחזור של PDMS כדי להגדיר גיאומטריה תאית אחידה ולהבטיח עומס מכני עקבי בין הניסויים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדי דפורמציה בסיבי נסיגה כקריאה כמותית להשפעות של תרכובות או הפרעות גנטיות על התהליך המכנו-טרנסדוקטיבי (mechanotransduction).
- ערך תפעולי: תואם למיקרוסקופיה וידאו, מה שמאפשר ניטור בזמן אמת וללא סימון של תגובות תאיות למתיחה מבלי להפריע לתנאים הפיזיולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול רלוונטי למחלה של מורפוגנזה של רקמות ופיברוזיס על ידי שחזור מיקרו-סביבות מכניות דינמיות.
- ערך תפעולי: מאפשר מחזורי מתיחה-הרפיה חוזרים לסימולציה של עומס פיזיולוגי, ובכך משפר את יכולת התרגום לתנאי in vivo.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות, דרך סריקה פנוטיפית ועד לתיקוף מכניסטי, ובמיוחד עבור מטרות המעורבות במסלולי תגובה למעמס מכני.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחן כיצד מתיחה של התשתית משפיעה על אוריינטציית כישורי המיטוזה ועל המתח הקורטיקלי, ובכך מבהיר מנגנוני חישה של כוחות.
- סריקה: מאפשרת הערכה סטנדרטית של יכולת הדפורמציה התאית תחת עומס, ובכך תומכת בחזרתיות של הבדיקה לאורך מסעות סריקה.
- אנליטיקה: מספקת נתוני דימוי ברזולוציית זמן על רטרקציית סיבים ושינוי בצורת התא, מה שמאפשר השוואה כמותית של פנוטיפים מכניים.
- מחקר תרגומי: ממדל תרחישי מתיחה של רקמות פתולוגיות, כגון בהקשרים של כלי דם או דיסטרופיה שרירית, כאשר הדבר נתמך על ידי סוגי תאים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמת המתיחה מ-PDMS ניתנת להתאמה לסוגי תאים ולעיצובי תבניות מרובים, ובכך תומכת בשימוש חוזר בפרויקטים שונים ללא צורך בתיקוף מחדש של המכניקה הבסיסית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות במחקרי מכנו-טרנסדוקציה (mechanotransduction) על ידי בידוד מתיחת התשתית כמשתנה הבלתי תלוי.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות מיקרו-דפוס (micropatterning) סטנדרטי והארכה מבוקרת באמצעות בורג מיקרומטרי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת תוצאות מוקדמות המבוססות על מנגנונים לגבי שלמות השלד התאי תחת מאמץ.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם לסיכון, בהתבסס על רגישותן להפרעה מכנית בהקשרים תאיים רלוונטיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בליתוגרפיה רכה, תרביות תאים ודימוי תאים חיים.
- תלוי בגישה לציוד תבנית UV, מצעי PDMS ובמישורי מתיחה מכניים.
- מחייב סטנדרטיזציה של ציפוי פיברונקטין וממדי המיקרו-תבנית בין מעבדות לצורך השוואת נתונים.
- התאמה למודלים של רקמות בתלת-ממד או לחלבוני ECM חלופיים עשויה לדרוש אופטימיזציה מחדש של שלבי ההיחבּרות והפסיבציה.
- מוגבל על ידי הפעלה ידנית; מחזוריות בתדר גבוה או בבקרה ממוחשבת דורשת שילוב של מישורי הנעה ממוטרים.
