Name: מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: למדו שיטה למתיחת תאים על ממברנת PDMS ממושקעת במיקרו-דפוסים. הטכניקה מאפשרת יישום כוחות מכניים על תאי יונקים מיטוטיים ומסייעת בחקר הביומכניקה של תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נוסדה על ידי מכון קירי, פריז, צרפת. האלונקה מכאנית תוכננה על ידי דמיאן Cuvelier (Institut קירי) ומיוצרת על ידי GREM (Mecanique-grem.com). הדפוסים על PDMS פותח על ידי עמאר Azioune (אוניברסיטה השנייה בורדו).

1. פסיבציה של PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה של PDMS כ 35 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ מגיליון שהוכן מראש (למשל, GelPak, כפי שמופיע בטבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק העליון ושכבות מגן התחתונה של פלסטיק (במידת צורך) ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את PDMS בפלסטיק (לא תא התרבות שטופלה) צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את PDMS עם אתנול 70% למשך 5 דקות על הכתף ב30 תנודות / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את פני השטח על ידי זורם אוויר על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר עם UV העמוק (λ = 180 ננומטר) במשך 5 דקות במרחק מנורות UV של כ -5 ס&quot;מ (ראה גיליון חומרים למנורת התייחסות; פרמטרים ישתנו למנורות שונות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 μl של פתרון EDC / NHS עבור כל PDMS חתיכה (זה חייב להיות מוכן רק לפני השימוש בגלל תגובתיות של הפתרון דועכת בעניין של שעות). עבור 1 מיליליטר של 0.05 M MES + 0.5 חיץ M NaCl ב-pH 6.0, להוסיף 11.5 מ&quot;ג sulfo-NHS ו19.2 מ&quot;ג של EDC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברPDMS גיליונות מצלחת פטרי למכסה של צלחת פטרי, שלא היה מוארת. זה יבטיח כי הסביבה של PDMS מאוד הידרופובי ולהקל על השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון EDC / NHS ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף EDC / NHS עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון PLL-G-PEG (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בHEPES pH 10 מ&quot;מ 8.6) ו דגירה מהשעה 3 בלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את PLL-G-PEG עם מים. PDMS פסיבציה (פונקציונליות עם PLL-G-PEG) יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים ב 4 ° C. </li></ol> 2. דפוסים של PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דף PDMS ולמקם אותו על photomask קוורץ סינטטי הנושא את microfeatures לדפוסים (ראה איור 1). הנח את צד PDMS הנושא את PLL-G-PEG מול צד הכרום של photomask. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר למשך 7 דקות באמצעות photomask במרחק מנורות UV של כ -5 ס&quot;מ.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים על המסכה + PDMS ולקלף את PDMS לאט את המסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם פתרון פיברונקטין ב50 מ&quot;ג / מיליליטר במאגר HEPES ב-pH 8.6 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. אפשר להשתמש באחרים חלבוני ECM, אבל אלה לא נבדקו עם פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף עם PBS. </li></ol> 3. הרכבה ההתקנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר PDMS פסיבציה בעבר על מכשיר המתיחה (ראה דיון לפתרון בעיות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צד אחד של PDMS לחלק הקבוע מהאלונקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הצד השני לחלק הנייד של האלונקה ללא הידוק רב מדי של גיליון PDMS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך מלבן של PDMS (22 מ&quot;מ x 19 מ&quot;מ) בדקירת PDMS עבה וחתך מלבן אחר בתוך כדי שתהיה בריכה (או מסגרת) שיישמר על התאים ותקשורת (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף גריז סיליקון תחת זה PDMS בריכה ולמקם אותו על גבי גיליון PDMS ליצור medium שמירה על בריכה. הגריז יאפשר הגלישה של הבריכה מעל גיליון PDMS במהלך מתיחה. </li></ol> 4. דפוסי התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים מ50% בקבוק תרבות confluency עם Versene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי resuspend אותם בריכוז של 200,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של השעיה תא בבריכה (ראה דיון לפרטים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים להיקשר לדפוסים ל10-30 דקות (תלוי בסוג התא, הרשתית-1 תאים ייקחו 10 דקות ותאי הלה 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את התאים הצפים עם מדיום equilibrated (לאזן בינוני בחממה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו התאים התפשטו לכמה שעות על הדפוסים (RPE-1 יצטרך לפחות 2 שעות; תאי הלה יצטרכו 3 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת coverslip על גבי הבריכה כדי למנוע דליפת אידוי ובינוני במקרה הפסקות PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את המכשיר על מיקרוסקופ הפוכה ולהתחיל הדמיה. הימנע משימוש באוב טבילת שמןjectives כפי שהוא לא יעבוד בשל בעיות מיקוד. </li></ol> 5. מתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את בורג micrometric תוך תיקון מיקום הבמה בx-, (בעיקר x) y-, וציר ה-z. מיקום הבמה צריך להיות מתוקן כדי לנטרל את הרחבת PDMS ואובדן המיקוד. (ראה &quot;במתיחה&quot; הפסק בדיון). </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות שטכניקה זו נעשתה שימוש פעמים רבות ונבדקה ביסודיות, ישנם מספר שלבים קריטיים שיכול להוביל לניסוי נכשל. אודות PDMS: לעבודה זו, GelPak, גיליון דק PDMS זמין מסחרי, היה בשימוש. לחלופין ניתן להטיל גיליונות PDMS ישירות מתערובת PDMS. אנו ממליצים להשתמש GelPak כי זה שחזור יותר, ופחות סביר לשבור לעומת PDMS בהתאמה אישית. <p class="jove_step" style=";...

התאים המרכיבים את רקמות באורגניזמים גבוהים יותר כפופים למתחים מכאניים וכוחות המתיחה מגיעים גם מהסביבה החיצונית או מהתאים המקיפים את 1,2. תאים חייבים להסתגל ולהתנגד לכוחות הללו על מנת לשמור על שלמות רקמה. כוחות כאלה הם גם חשובים עבור המורפוגנזה רקמות במהלך 3,4 פיתוח. החלת כוחות מכאניים על תאים בתרבית היא דרך לחקות את מה שעלול לקרות ברקמה, אבל עם שליטה כמותיים ועצמאית של צורת התא ו5,6 עיוות תא. לשם כך, עשויות לשמש במספר טכניקות. אפשר ללחוץ על התאים (התא כולו או חלק ממנו), למשל באמצעות AFM או נגזרי 7,8 או למתוח את מצע התאים גדלים על. השיטה המתוארת במאמר זה מדגימה כיצד למתוח מצע מטוס מצופה בתאים. טכניקה זו פותחה במקור כדי להעריך את התפקיד של כוחות המופעלים על מ &#39;תאי יונקים itotic 9. תאי mitotic להישאר מחוברים למצע דרך סיבי הכחשה ומותחים את הקרום שהפעילו כוח על אלה סיבים, אשר בתורו עורר את הסיבוב של ציר mitotic. העניין של שילוב micropatterns דבק ומתיחה הוא להשיג שליטה עצמאית של כוחות וצורה של תאים בודדים. זה למשל אפשר למתוח תא ביצה לצורה עגולה איזוטרופיים בצורה מושלמת, תוך מתיחת uniaxial מוחלת. אם התאים אינם קלועים בmicropatterns, uniaxial מתיחת תוצאות בהתארכות תא, עם רוב התאים שיש ציר ארוך מיושר עם ציר המתיחה. קשה לאחר מכן להפריד את ההשפעה של יישור ציר זמן ואת ההשפעה של המתיחה מוחלת על התאים. המכשיר מתאים לכל הדמיה תא חי, הכולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשגות זמן רב, וניתן להוסיף תרופות במהלך הניסוי. שיטת micropatterning יובס העמוקה 10תואר בפירוט בAzioune et al. 11 דפוסים על PDMS תוארו בAzioune et al. 12 הווה מתיחת פרוטוקול הוא גרסת וידאו של קארפי et al. 13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>עובי/דביקות שונים זמינים. חלופה אחת יכולה להיות להטיל את ה-PDMS&nbsp שלך; עצמך.</td></tr><tr><td>גריז סיליקון</td><td>GE Bayer סיליקונים</td><td>Baysilone-Paste</td><td>זה תואם ביולוגית</td></tr><tr><td>מכשיר מתיחה</td><td>GREM m&eacute; אלונקה קניק</td><td>2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide hydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>3450</td><td>יציב 6 חודשים ב-20 &deg; C</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide מלח נתרן)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>הגנה מפני לחות</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 מ"ג)SurfaceSolutions</td> <td>(ציריך)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מסכת פוטו קוורץ סינתטית</td><td>Toppan</td><td></td><td>קח מסכת פוטו בינארית סטנדרטית בקוורץ</td></tr><tr><td>פיברונקטין מפלזמת בקר</td><td>סיגמא</td><td>F1141</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

מתיחת תאי micropatterned בממברנה pdms

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

כוחות מכאניים המופעלים על תאים ו / או רקמות לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים רבים. פיתחנו מכשיר למתוח תאים מצופים בpolydimethylsiloxane קרום (PDMS), תואם עם הדמיה. טכניקה זו ניתנת לשחזור ותכליתי. קרום PDMS ניתן micropatterned כדי להגביל את התאים או רקמות לגיאומטריה ספציפית. הצעד הראשון הוא להדפיס micropatterns על הממברנה PDMS עם טכניקת UV עמוקה. קרום PDMS מותקן אז על אלונקה מכאנית. תא חייב על גבי הקרום עם גריז ביולוגית כדי לאפשר גלישה במתיחה. התאים הם זורעים ואפשרו להפיץ לכמה שעות על micropatterns. המדגם יכול להיות מתוח וunstretched מספר פעמים עם השימוש בבורג micrometric. זה לוקח פחות מדקה כדי להחיל את המתיחה לכל אורכו (בסביבות 30%). הטכניקה המוצגת כאן אינה כוללת מכשיר ממונע, אשר הוא הכרחי עבורpplying מחזורי מתיחה חוזרים ונשנים במהירות ו / או בשליטת מחשב מתיחה, אבל יכול להיות מיושם זה. מתיחה של תאים או רקמות יכולות להיות עניין לשאלות הקשורות לכוחות תא, בתגובת תא ללחץ מכאני או המורפוגנזה רקמות. מצגת וידאו זה יראה איך להימנע מבעיות אופייניות שעלולות להתעורר כאשר אתה עושה את זה סוג של ניסוי פשוט לכאורה.

<html> הטכניקה שהוצגה בפרוטוקול וידאו זה אפשר את היישום של כוחות על סיבי ההכחשה של תאי יונקים mitotic. ואכן, במהלך חלוקת תא, בשלב mitotic, תאי יונקים לחזור לקחת את הצורה של כדור ולהשאיר מאחור כבלים אקטין דקים מוקפים בקרום אשר מחוברים למצע. כבלים אלו (סיבי הכחשה), הם הזיכרון של הגיאומטריה התא לפני שהוא הולך לחטיבה. ביצוע micropatterns עם UV העמוק דרך photomask על סרט דק PDMS (איור 1) אפשר שליטה הגיאומטרית של הידבקות תא. על ידי מתיחת המצע בתחילת metaphase, חלק מסיבי ...

כתב יד זה מציג טכניקה כדי להחיל או לשחרר כוחות על תאים או רקמות חסיד באמצעות מתיחה חד כיווני.

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למתוח תאי תבנית על ממברנה גמישה של פולי-דימეთיל-סילוקסאן או PDMS. דבר זה מושג על ידי הכנת גליון PDMS, ולאחר מכן יישום של מיקרו-תבנית על ה-PDMS. גליון ה-PDMS בעל מיקרו-התבנית מורכב לאחר מכן על מכשיר המתיחה, ומעל לזה מונח מאגר לשמירה על המצע.בשלב הבא, התאים נזרעים על פני השטח של גילי ה-PDMS בעל התבנית המיקרוסקופית וממתינים להיקשרותם לתבנית לפני שטיפה להסרת תאים שלא נקשרו. השלב הסופי הוא הפעלת מאמץ מתיחה על ה-PDMS המכיל את התאים כדי למתוח את התאים. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה וידאו כדי להראות כי הפעלת כוחות על סיבי ההסגה של תאי יונקים במצב מיטוזה בעת מתיחת התא גורמת לעיוות של התא.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביומכניקה, כגון מהן ההשפעות של כוחות חיצוניים על תהליכים תאיים כמו חלוקה? הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו להפעיל כוחות על תא הנמצא בתהליך חלוקה; ראשית, גזרו חתיכה של PDMS בגודל של כ-35 על 20 מילימטרים מגיליון מוכן מראש. כאן, נעשה שימוש בגיליון PDMS דק הזמין מסחרית, מכיוון שהוא בעל שחזוריות גבוהה יותר וסיכוי נמוך יותר לשבירה בהשוואה ל-PDMS המיוצר בהתאמה אישית.הסיר את שכבות המגן העליונה והתחתונה של הפלסטיק והשתמש בפינצטה כדי להניח את ה-PDMS בתוך צלחת פטרי מפלסטיק. לאחר מכן, שטוף את ה-PDMS ב-70% ethanol למשך חמש דקות על גבי רוטטור ב-30 תנודות לדקה. לאחר השטיפה, ייבש את פני השטח על ידי הזרמת אוויר עליהם.בשלב הבא, חשפו את ה-PDMS לאור על-סגול עמוק למשך חמש דקות, במרחק של כחמישה סנטימטרים מנורות העל-סגול. בינתיים, הכינו תמיסת E-D-C-N-H-S כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. יש להכין את התמיסה רגע לפני השימוש, מאחר שהתגובתיות של התמיסה דועכת בתוך מספר שעות.העבירו את דפי ה-PDMS מתוך צלחת הפטרי למכסה של צלחת הפטרי, שלא נחשף לאור. פעולה זו תבטיח שהסביבה של ה-PDMS תהיה הידרופובית מאוד ותקל על השלב הבא.העבירו באמצעות פיפט את תמיסת ה-E-D-C-N-H-S על גבי ה-PDMS והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, שטפו את עודפי ה-E-D-C-N-H-S במים.בשלב הבא, הוסיפו את תמיסת ה-PEG המורכב PLL והדגירו בין שלוש שעות ללילה שלם בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, שטפו את שאריות ה-PEG המורכב PLL מה-PDMS באמצעות מים. ה-PDMS כעת פסיבי או פונקציונלי עם PEG המורכב PLL וניתן לאחסן אותו למשך מספר ימים בטמפרטורה של 4 °C. כדי ליצור תבנית על ה-PDMS, הניחו גילי PDMS על מסכת פוטו-קוורץ סינתטי הנושאת את המאפיינים המיקרוסקופיים לתבנית.הניחו את צד ה-PDMS הנושא את ה-PEG המורכב ב-PLL כשהוא פונה לצד הכרום של המסכה הפוטוגרפית. לאחר מכן, הקרינו במשך שבע דקות דרך המסכה הפוטוגרפית, במרחק של כחמישה סנטימטרים מנורות העובן (ultraviolet). לאחר ההקרנה.הוסיפו מים על המסכה ועל ה-PDMS ולאחר מכן קלפו באיטיות את ה-PDMS מהמסכה. רכבו את ה-PDMS שעבר פסיבציה קודם לכן על מכשיר המתיחה. חברו צד אחד של ה-PDMS לחלק הקבוע של המותח. קבעו את הצד השני לחלק הנייד של המותח, תוך הקפדה שלא למעוך חלק גדול מדי מגיליון ה-PDMS.אם ה-PDMS מהודק יתר על המידה, הוא מתקצר, דבר שעלול להוביל לשבירה כיוון שהמתיחות תהיה גבוהה יותר עבור אותו מרחק מתיחה. ודאו שהברגים מהודקים היטב, אחרת גיליון ה-PDMS יחליק מיד עם תחילת המתיחה, או בשלב מאוחר יותר במהלך הניסוי. לאחר מכן, דגרו את ה-PDMS עם תמיסת פיברונקטין למשך שעה אחת.בטמפרטורת החדר, ניתן להשתמש בחלבונים אחרים של המטריצה החוץ-תאית, אך אלו לא נבחנו בפרוטוקול זה. כשלב סופי, שטפו את ה-PDMS בתמיסת PBS (phosphate buffered saline). לאחר מכן, גזרו מלבן של PDMS מתוך לוח PDMS עבה.לאחר מכן, גזרו מלבן נוסף בפנים. כדי ליצור בריכה שתשמור על התאים והמדיום, מרחו גריז סיליקון מתחת לחלק ה-PDMS הגזור בצורת מלבן והניחו אותו מעל גיליון ה-PDMS כדי ליצור בריכה לשמירה על המדיום. הגריז יאפשר להחליק את הבריכה מעל גיליון ה-PDMS במהלך המתיחה לצורך דפוס התאים.ראשית, נתקו את התאים מבקבוק תרבית ב-50% תוך כדי תפזורת (confluency). לאחר שהתאים נמצאים בסוספנזיה, העבירו אותם בפיפט מספר פעמים באמצעות טיפ של 200 µL כדי לפרק צברים, דבר שיבטיח שכל תא יקשר לתבנית באופן פרטני. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של סוספנזיית התאים לתוך הבריכה.הניחו לתאים להיקשר לתבניות למשך 10 עד 30 דקות, בהתאם לסוג התא, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. לאחר שהתאים נקשרו לתבניות, שטפו בעדינות את התאים הצפים באמצעות מצע מאוזן כדי להסירם.הסיר את המצע באמצעות פ pipette שאיבה תוך כדי הוספה סימולטנית של מצע. קריטי לשמור על זרימה מספקת כדי לשטוף תאים שאינם מודבקים, תוך השארת התאים טבולים במצע. לאחר מכן, הנח כיסוי זכוכית (cover slip) מעל למאגר כדי למנוע התאיידות ודליפת מצע במקרה של שבירה של ה-PDMS, ואפשר לתאים להיפרס למשך מספר שעות על התבניות.לאחר מכן, הניחו את המכשיר על מיקרוסקופ הפוך והתחילו בצילום. הימנעו משימוש בעדשות טבילה בשמן, כיוון שהן לא יעבדו בשל בעיות מיקוד. כדי למתוח את התאים בתבנית המיקרוסקופית, סובבו את בורג המיקרומטר תוך תיקון מיקום השולחן בצירים x, y ו-Z.יש לתקן את מיקום השלב כדי לפצות על התרחבות ה-PDMS ואובדן המיקוד. הטכניקה המוצגת בפרוטוקול וידאו זה אפשרה הפעלת כוחות על סיבי נסיגה (retraction fibers) של תאי יונקים במצב של מיטוזה, על ידי מתיחת התשתית בתחילת המטפאזה. חלק מסיבי נסיגה אלו נמשכו הרחק מגוף התא, מה שהביא להפעלת כוח מכני על קורטקס התאים המיטוטיים; כדי להשיג זאת, התא מושב על תבנית אובלית לפני המתיחה.הדפוס נוצר כאשר ה-PDMS נמתח במהלך החטבה של תבניות עגולות דרך מסיכה פוטוגרפית. לאחר המתיחה, התשתית נמתחת כך שהדפוס הופך למעגל. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזרוע תאים על דפוסים מאקרוסקופיים ולאחר מכן להפעיל כוחות מתיחה על התשתית.

stretching-micropatterned-cells-on-a-pdms-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מציגים במאמר זה פלטפורמה חדשני מתיחה שיכול לשמש כדי לחקור את תגובות תא בודדות לעיוות מכאנית biaxial איזוטרופי מורכב ולכמת את התכונות מכאניות של רקמות ביולוגיות.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

אנו מתארים ייצור של יריעות הידרוג'ל בתבנית מיקרו בתהליך פשוט, הניתן להרכבה ולתפעל בצורה עצמאית. באמצעות יריעות הידרוג'ל מודולריות אלה, ניתן ליצור מערכת תרבית תאים תלת מימדית פשוטה בקנה מידה מאקרו עם מיקרו-סביבה תאית מבוקרת.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

מוצג פרוטוקול לייצור שטח גדול של מצע ננו-דפוסי מתבניות ננו-דפוסיות קטנות לחקר אפנון ננוטופוגרפי של התנהגות התא.

הרחבת טכניקת תפר באמצעות מצעי nanopatterned עבור Nanotopographical אפנון של התנהגות תא

דוח זה מתאר טכניקה פשוטה וקלה לביצוע, תוך שימוש בוואקום בלחץ נמוך, למילוי תעלות מיקרופלואידיות בתאים ומצעים למחקר ביולוגי.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ייצור של הערוץ מתיחה, כפול, איברים שבב microfluidic תא תרבות מכשירי recapitulating איברים ברמת פונקציונליות בתוך חוץ גופית.

ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

באופן מסורתי, תרבית תאים מבוצעת על מצעים מישוריים המחקים בצורה גרועה את הסביבה הטבעית של תאים in vivo. כאן אנו מתארים שיטה לייצור מצעי תרביות תאים עם גיאומטריות מעוגלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית וחלבונים חוץ-תאיים מיקרו-פטרייתיים, המאפשרת חקירה שיטתית של חישה תאית של רמזים חוץ-תאיים אלה.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

פרוטוקול זה מתאר שיטת דפוס תאים ללא דיו, ללא תוויות, שאינה תלויה במצע ובעלת תפוקה גבוהה המבוססת על אפקט ארכימדס מגנטי.

תבניות תאים באמצעות אסטרטגיית ארכימדס מגנטי

כאן, אנו מציגים מכשיר מתיחה שווה צירי רב-תכליתי המופעל פניאומטית ותואם למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

מכשיר מתיחה שווה צירי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בהגדלה גבוהה

אנו מציגים פלטפורמת בדיקת קשיחות דינמית והפיכה המיוצרת באמצעות אלסטומר סיליקון רך במיוחד (פולידימתילסילוקסן, PDMS) עם חלקיקי ברזל משובצים. בדיקה חדשנית זו מתאימה לחקר שינויים פיזיים תלויי זמן בפנוטיפים של תאים, כולל הנחיית מגע. כאן, אנו מודדים יישור קרדיומיוציטים של חולדות יילודים עם התקשות מטריצה באמצעות מגנטיות.

אלסטומרים מגנטו-ריאולוגיים מיקרו-דפוסיים להנעת שינויים ביישור קרדיומיוציטים

למדו שיטה למתיחת תאים על ממברנת PDMS ממושקעת במיקרו-דפוסים. הטכניקה מאפשרת יישום כוחות מכניים על תאי יונקים מיטוטיים ומסייעת בחקר הביומכניקה של תאים.

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

גלה סרטונים נוספים