חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ללכוד את התהליך הדינמי בזמן אמת של התבגרות פגוזומים וביוגנזה של פגוליזוזום בפגוציטים. זה מושג על ידי העמסת התאים הליזוזומליים של התאים בגדיל דקס מצומד פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה של תאים ליזוזומליים והעברת המטען הלומינלי שלו לפאגוזומים. כשלב שני מתווספים מיקרו-חלקיקים הפועלים כמודל פגוציטי.

לאחר מכן, מסירת החומר הליזוזומלי לפאגוזומים מנותחת באמצעות הדמיה חיה ועיבוד תמונה דיגיטלי לאחר מכן. על מנת לכמת את תהליך התבגרות הפגוזומים, התוצאות מראות את ההשפעה של גורמים שונים על תהליך הבשלת הפגוזומים בהתבסס על מסירת תוכן ליזוזומלי לפאגוזומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות, כגון הערכת הבשלת מקרופאגים בתאים קבועים הוא הקריאה הכמותית ברזולוציה זמנית גבוהה התחל על ידי המסת גדיל DExT 70 קילו-דלטון אדום טקסס או Dex 70 KD ב-PBS ב-20 מיליגרם למיליליטר ואחסן אליקוטים במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש לדלל את מלאי ה-Dex 70 KD בתרבית תאים שלמה Docos, מדיום נשרים מותאם או DMEM לכמיליגרם אחד למיליליטר. סוניק את גדיל ה-DExT באמבט מים אולטראסוני למשך חמש דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את התמיסה במיקרו צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך חמש דקות כדי להסיר גושים או מזהמים מהתמיסה.

העבר בזהירות את ה-SuperAgent לצינור טרי תוך הימנעות מהכדור בתחתית. לאחר מכן יש לדלל את התמיסה לריכוז עבודה סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר בתרבית תאים שלמה. DMEM ומסנן.

עקר את התמיסה דרך פילטר המותקן על מזרק של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, ראה שני מיליליטר של מקרופאגים של עכברים שמקורם במח עצם בריכוז של חמישה כפול 10 לתאים הרביעיים למיליליטר. ב-DMEM בצלחת תחתית זכוכית לא מצופה, דגרו את התאים למשך 12 שעות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני.

כדי להבטיח הצמדה והתאקלמות לאחר ההצמדה, שאפו את המדיום והוסיפו שני מיליליטר של DEM של גדיל DExT לפני המלחמה לצלחת תחתית הזכוכית, ולאחר מכן דגרו על התאים למשך שעתיים עד שמונה שעות לאחר הדגירה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם DMEM מלא שחם מראש. שאפו את המדיום לאחר השטיפה הסופית והוסיפו שני מיליליטר של DMEM שלם.

דגרו על התאים למשך ארבע עד 12 שעות. לאחר מכן שטפו את התאים עם DMEM מלא ללא פנול אדום מחמם מראש, והוסיפו שני מיליליטר של DMEM מלא ללא פנול אדום מסונן לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה. לאחר מכן, הביאו לטמפרטורת החדר תרחיף סלק מצופה 1% IgG שהוכן כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

סוניקציה של התמיסה באמבט מים אולטראסוני למשך שתיים-שלוש דקות. לאחר מכן, תחת ארון בטיחות ביולוגית מסוג שתיים, הוסף אחד עד שישה מיקרוליטר של תרחיף החרוזים לתאים. פזרו את ענן החרוזים הצפוף באמצעות פיפטה כדי לערבב בעדינות את המתלה בכלי התחתון מזכוכית.

לאחר מכן הביאו את הדגימה למיקרוסקופ והתמקדו באזור העניין. לפני הדמיית זמן-lapse. בצע אופטימיזציה של ההגדרות כולל סריקה, הגדלת מהירות ורזולוציה על מנת שתוכל ללכוד פריים אחד כל שבע עד 20 שניות.

התאם את הגדרות פליטת העירור על סמך מערכת ההדמיה והבדיקות המשמשות ומטב את ההגדרות כדי למנוע הלבנת תמונות מוגזמת. לאחר מכן צלם את סרטון ה-Time lapse ושמור אותו בפורמט הקובץ המקורי של המיקרוסקופ שלך. הימנע מייצוא הסרטון בפורמטים דחוסים כגון JPG או PNG.

לאחר מכן, הפעל את הפצת פיג'י ו-Image J המכילה חבילת עיבוד תמונה עם תפריטי כלים מאורגנים מחדש ותוספים מקוריים נוספים הזמינים בחינם. הורדה. פתח את הקובץ בפיג'י ובחר את הסרטון שיש להעריך. לאחר מכן הגדר את האפשרויות, המסננים ופרמטרי המדידה כמפורט בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן, סרוק את התמונות ושים לב למסגרת שבה נוצר פגוזום חרוז מתהווה שנוצר במלואו והכוס החומצית F סגורה. השתמש בכלי הבחירה הסגלגל כדי לבחור אזור עניין מעגלי או החזר ROI על החרוז המופנם. ודא שהבחירה מתאימה היטב לקצה החיצוני של החרוז.

לאחר מכן עבור לניתוח ולחץ על מדידה כדי לבצע את המדידה. התוצאה תוצג בחלון נפרד שכותרתו תוצאות. במסגרת העניין הבאה, התאם את מיקום ההחזר על ההשקעה למקרה שהחרוז זז וחזור על המדידה, שתתווסף לרשימה בחלון התוצאות.

ניתן לזהות כל מסגרת מנותחת על סמך הערך בעמודת התווית. לאחר השלמת המדידה של כל המסגרות הרלוונטיות, העתק את הערכים מהעמודה int den ליישום גיליון אלקטרוני. העמודה int den מתארת את העוצמות של האזור שנבחר.

באמצעות שיטות אלה, צולמו תמונות ברורות של מקרופאגים שמקורם במח עצם שנטענו בבדיקות גדיל DExT. התמונה הזו היא מזמן אפס, שזה בדיוק הזמן שבו התא השלים את הקליטה של החרוז המקודד IgG שצוין כאן. התמונות המוצגות כאן היו פסאודו-צבעוניות כדי לראות טוב יותר ומתארות פגוזום מאפס עד 85 דקות לאחר הקליטה.

הפאגוזום הנמדד, החזר ההשקעה מתואר בקו המקווקו והמופעים של מסירת דקסטרן והצטברות בפאגוזום מסומנים על ידי החצים. לאחר מכן נוצרו גרפים מתמונות אלה ומראים מגמה זמנית ברורה של קשר אות עם הפגוזום לאורך זמן. הגרף הזה מייצג בממוצע 10 פגוזומים משני התאים שמוצגים כאן.

בעוד שעוצמת האות המוחלטת משתנה לעתים קרובות בין כל פגוזום מנותח, המגמה הזמנית בדרך כלל דומה מאוד. מסירת דקס 70 KD לפאגוזומים, הושגה רמה תוך 35 עד 40 דקות לאחר פגוציטוזיס. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את הבשלת הפגוזום באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse.