Name: חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: למדו לחקור את תהליך הבשלת הפאגוזומים והיווצרות הפאגוליזוזומים במקרופאגים בשידור חי. השיטה משתמשת בדקסטראן פלואורסצנטי לחקר דינמיקת התאים החיסוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי המעבדה לביולוגיה Phagosome לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הלמהולץ חוקר הצעיר (יוזמה וקופות ברשת של הלמהולץ האיגוד) ותכנית עדיפות SPP1580 גרנט מועצת המחקר הגרמנית (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

בסעיף הבא נדון שלבים קריטיים של השיטה המוצגת ומגבלותיו. יתר על כן, אנו יתחברו כמה מהבעיות הנפוצות בפתרונים שלהם, להציג את השינויים אפשריים, ורואים את היתרונות של השיטה שלנו, כמו גם שיטות משלימות מתאימות לגישה זו. הכנת חרוזים, כולל הצימוד של IgG אל פני השטח חרוז, היא קריטית ויש להימנע מהשימוש בתכשירים עבשים. בתוספת לזה, זה גם קריטי, כי dextran מוכן מהמלאי הקפוא (בדילול מלא ומעוקר) טרי לפני כל ניסוי. חשובה שהטעינה ...

phagocytes המקצועי, כוללים מקרופאגים, לשחק קריטי במערכת החיסונית. בנוסף להיותו קו הגנה הראשון של מערכת החיסון המולדת, הם גם לשחק תפקיד קריטי בהפעלה של החסינות אדפטיבית באמצעות האיתות ואנטיגן הצגת התפקיד 1-3. בעוד שהפונקציה של phagocytes המקצועי היא רבת פנים, התבגרות phagosome היא עמוד השדרה הקריטית של פונקצית עיבוד bactericidal ואנטיגן של phagocytes המקצועי 4,5. על היבלעות קולטן בתיווך והספיגה של יעד phagocytic, כגון חיידקים, phagosome המתהווה עובר רצף מורכב ומתוזמר היטב של אינטראקציה וחילופים עם תאים של רשת endocytic וכמה אברונים תאיים אחרים 6. טבעו של התרכובות החליף עם גופים סלולריים אלה, כמו גם הרגולציה והתזמון של אירועי היתוך קובע את סביבת phagosomal luminal וphagosהרכב omal קרום, ולכן 7, את גורלו של phagosome התבגרות 8. רלוונטי הפיזיולוגית של התבגרות phagosome מודגם על ידי האסטרטגיות המגוונות המועסקות על ידי פתוגנים תאיים שונים כדי לברוח מ, לעצור או לחתור תחת phagosome התבגרות 9. רוב האסטרטגיות אלה במישרין או בעקיפין למנוע את השלב האחרון וקריטי של תהליך התבגרות phagosome: ההיתוך של phagosome עם תאי endosomal / lysosomal מאוחר, שמשווה להם את חלק הארי של אנזימי hydrolytic והגורמים אנטי בקטריאלי של phagosome בוגר 7 , 8,10. ניתוח השלב האחרון וקריטי זו ולכן יכול לספק לנו אינדיקטורים חזקים על מצב ההבשלה של phagosomes ואם המצב הפיזיולוגי הטבעי הוא להיות חיובי או שלילי מושפע תחת ההגדרות הניסיוניות מסוימות כי הם מנוצלים. תא endosomal מאוחר / lysosomal<html> ים נחשב בדרך כלל להיות תאי המסוף של מסלול endocytic, מוגדרים ונבדלים מתאי endocytic המוקדמים על ידי הנוכחות של שונים, לביים מולקולות ספציפיות, סמן. למשל אנזימי hydrolytic או רכיבי קרום כגון חלבוני קרום lysosomal משויכים (מנורות) בין יתר 11. Endocytic המסוף התייחסה מדורים מעתה בפשטות lysosomes-משמש גם כמקום המרכזי לשלבים הסופיים של מערכת העיכול בסוף phagocytic / endocytic המסלול 12. בדרך זו, ניתן לטעון בדיקות nondigestible דרך אנדוציטוזה וmacropinocytosis מהסביבה תאית ומועברות דרך מסלול endocytic לlysosomes, שם הוא מצטבר 13,14 לאחר ביצוע מחזור של ספיגה ומרדף מוגדר. בדיקות Fluorophore מצומדות למיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון dextran פולימר nondigestible האורגני משמשות בדרך כלל כendocyticprobes 15-17. s = &quot;jove_content&quot;&gt; בשיטה זו, אנו מתארים את הניצול של microbeads מצופה IgG כמטען phagocytic לחקור התבגרות phagosome ידי ניתוח אספקת תוכן luminal lysosomal לphagosomes. באמצעות בדיקה dextran fluorophore מצומדות כסמן לזיהוי בקלות של lysosomes במקרופאגים מח עצם לחיות נגזרים (BMM) ווידאו הדמיה הזמן לשגות עם מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, אנו ממשיכים בתהליך הדינמי של משלוח המטען לphagosomes עם גבוה פתרון זמני. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד ניתן להעריך את נתוני הזמן לשגות הדמיה נאספו באמצעות הקוד הפתוח ותוכנה זמינה באופן חופשי ניתוח תמונה, פיג&#39;י (או ImageJ), מבחינה סטטיסטית נותח באמצעות Microsoft Excel ומוצג באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה 14,18. לאחר התיאור של השיטה שלנו, יכולים להיות מתוכננים ניסויים מקבילים באמצעות הגדרות וגורמים שונה כדי לחקור את ההשפעה שלהם על התבגרות phagosome; כמעט כל otהסוג של תאי phagocytic ראשוניים או תא שורה חסיד שלה, אובדן גנטי של ניסויי פונקציה כוללים גן עקום החוצה ולדפוק למטה, מוטציות או ביטוי של חלבוני איחוי, phagocytic-מטרות, תרכובות ציפוי microbead, בדיקות endosomal / lysosomal וגורמים כגון ציטוקינים, מעכבים כימיים, או siRNA בין השאר הם כל המשתנים שניתן ליישם את הגישה הבסיסית של שיטה זו. אנו מגדירים את המטרה ודרישות הבסיסיות של שיטה זו באופן הבא: <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטרתה של השיטה: כדי לאפשר תצפית ישירה, כמוני ואיכותית וניתוח של התבגרות phagosome עם רזולוציה גבוהה זמנית בתאים חיים phagocytic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטען phagocytic: microparticle מצופה כראוי או יעד ביולוגי. כאן אנו משתמשים IgG מצופה 3 מיקרומטר microparticles קלקר כדורי שהם הפנימו בקלות דרך phagocytosis קולטן בתיווך FC-γ. לחלופין, כל מיקרואורגניזם או מיקרופון מצופהניתן להשתמש roparticle שלקולט phagocytic נמצא על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי phagocytic: תאי phagocytic חסיד המבטאים את הקולטנים phagocytic המתאימים. כאן אנו משתמשים BMMs עיקרי עכבר ששפע להביע את הקולטנים FC-γ. לחלופין, תאים דנדריטים (DC), מונוציטים או תאי אפיתל phagocytic או מוטציות הגנטיות שלהם או גרסאות עקום החוצה יכולים לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטען lysosomal: חללית lysosomal שכותרתו fluorescently. הנה, dextran 70,000 kiloDaltons (Dex70kD) מצומדת-טקסס האדומה משמש כמטען luminal של lysosomes. לחלופין, סמן כל fluorescently זיהוי של תא סלולארי או אברון, או בדיקה נאותה לנכסי phagosomal כגון קיבולת חומציות או degradative, יכול לשמש כדי לחקור את התקדמות הבשלת phagosome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השפעה גורמים: למשל, מולקולות איתות, תרכובות כימיות, גן עקום למטה, או ביטוי חולף של חלבוני מוטציה יכלו. הנה, יש לנו פרגאחד שימוש בגורם כזה לשם פשטות, אבל לדוגמה האחרונה עם ביטוי חלבון מוטציה וגורמים המשפיעים על לדפוק למטה ראו Kasmapour et al. 18 כל גורם שיכול להשפיע על phagocytosis או הנסיבות וניידות של phagosomes ו / או עלולים לשמש התאים שאינטראקציה עם phagosomes התבגרות. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium ללא פנול אדום (D-MEM)</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; צלחת תחתית מזכוכית (35 מ"מ & ריקה;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, הולנד</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM צלחת תחתונה מזכוכית, 35 מ"מ</td><td>Greiner Bio one, גרמניה</td><td>627871</td><td>אלטרנטיבה: זמין</td></tr><tr><td>כמיקרוספירות לטקס קרבוקסיל</td> מפולחות <td>Polysciences, ארה"ב</td> <td>#09850</td><td>זמין בקטרים שונים, השתמשנו ב-3 &mu; m</td></tr><tr><td>מיקרו-חלקיקי פוליסטירן</td><td>Kisker Biotech, גרמניה</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, גרמניה</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>עכבר שלם IgG</td><td>Rockland, ארה"ב</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC crosslinker</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ Tris</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל אומניפיקס -F</td><td>B.Braun, גרמניה</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; מחט G (0.45*25 מ"מ)</td><td>B.Baun, גרמניה</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, אוסטריה</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; מסנן רכוב על מזרק M</td><td>Sartorius, גרמניה</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר phagolysosome biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

תאי phagocytic לשחק תפקיד מרכזי במערכת החיסון המולדת על ידי הסרת וביטול מיקרואורגניזמים פולשים בphagosomes. התבגרות Phagosome היא התהליך המורכב והדוק מוסדר שבמהלכו phagosome המתהווה עובר שינוי דרסטי דרך אינטראקציות מתוזמרות היטב עם האברונים שונים סלולריים ותאים בציטופלסמה. תהליך זה, שהוא חיוני לתפקוד הפיזיולוגי של תאי phagocytic ידי מעניק phagosomes עם מאפייני ממס וbactericidal שלהם, מגיע לשיאו בשילוב של phagosomes עם lysosomes וקיום חיים של phagolysosomes שנחשב לשלב האחרון וקריטי של התבגרות לphagosomes. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים שיטה מבוססת הדמיה תא חי לניתוח איכותי וכמותי של התהליך הדינמי של הליזוזום לphagosome אספקת תוכן, שהוא סימן היכר של קיום חי phagolysosome. גישה זו משתמשת בmicrobeads מצופה IgG כמודל לphagocytosis ומולקולות dextran fluorophore-מצומדות כמו בדיקה מטעני lysosomal luminal, על מנת לעקוב אחר המשלוח הדינמי של תוכן lysosmal לphagosomes בזמן אמת במקרופאגים חיים באמצעות זמן לשגות הדמיה ומיקרוסקופיה לייזר confocal סריקה. כאן אנו מתארים בפירוט את הרקע, את שלבי ההכנה והתקנה ניסיונית צעד אחר צעד כדי לאפשר פריסה קלה ומדויקת של שיטה זו במעבדות אחרות. השיטה המתוארת שלנו היא פשוטה, חזקה, והכי חשוב, ניתן להתאים בקלות כדי לחקור אינטראקציות phagosomal והתבגרות במערכות שונות ותחת הגדרות ניסיוניות שונות, כגון שימוש בסוגים שונים תאי phagocytic, ניסויי הפסד של פונקציה, בדיקות שונות, ו חלקיקי phagocytic.

ההכנה הנכונה של התאים והחרוזים להדמיה היא קריטית. איור 1 מציג את קווי המתאר של הזריעה, בדיקה טעינה וצעדי הדמיה ראשוניות בשיטה זו, המבוסס על הפרוטוקול מותאם שלנו לBMMs. זה חיוני, אפוא, כי הפרמטרים הפרוטוקול להיבדק ומותאם בהתאם לסוג של תאים ובדיקות שיש לעשות שימוש ב. לאחר תוספת של חרוזים מצופים IgG לתאים שנטענו מראש, חשוב ששדה הראיה הוא נבחר באופן לספק את המספר הגדול ביותר של אירועי ספיגה פוטנציאלי...

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ללכוד בזמן אמת את התהליך הדינמי של הבשלת הפגוזום והביוגנזה של הפגוליזוזום בתאי פגוציטים. דבר זה מושג על ידי טעינת המדורים הליזוזומליים של התאים עם חוט דקסטראן המשוער עם פלואורופור, כדי לאפשר ויזואליזציה של המדורים הליזוזומליים והעברה של המטען הלומנלי שלהם לפגוזומים. כשלב שני, מתווספות מיקרו-חלקיקים, המשמשים כמודל פגוציטי.בשלב הבא, מסירה של חומר ליסוזומלי אל הפגוזומים מנותחת באמצעות דימיון של תאים חיים ועיבוד דיגיטלי של התמונות לאחר מכן. כדי לכמת את תהליך הבשלת הפגוזום, התוצאות מראות את ההשפעה של גורמים שונים על תהליך הבשלת הפגוזום בהתבסס על מסירת התוכן הליסוזומלי אל הפגוזומים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הערכת בשלות מקרופאגים בתאים מקובעים, הוא הקריאה הכמותית בעלת רזולוציה זמנית גבוהה. התחילו בהמסה של דקסטראן 70 kDa מסומן ב-Texas Red או Dex 70 KD ב-PBS בריכוז של 20 mg/mL, ואחסנו מנות בטמפרטורה של 20°C-.בשלב הבא, דללו את מלאי ה-Dex 70 KD בתוך Docos לתרבית תאים מלאה, מצע eagles modified או DMEM לריכוז של כ-1 mg/mL. בצעו סוניקציה למנת ה-DExT במכשיר סוניקציה בתוך אמבט מים למשך חמש דקות. לאחר מכן, סבבו את התמיסה במיקרו-צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך חמש דקות כדי להסיר גושים או זיהומים מהתמיסה.העבירו בזהירות את ה-SuperAgent למבחנה נקייה תוך הימנעות מהמשקע בתחתית. לאחר מכן, דללו את התמיסה לריכוז עבודה סופי של 20 micrograms per milliliter במצע גידול תאים מלא DMEM מסונן.עקרו את התמיסה באמצעות מסנן מורכב על מזרק בנקבוביות של 0.22 micrometer. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטרים של מקרופאגים של עכבר המופקים ממחול השתחבון בריכוז של 5 × 10⁴ תאים למילליטר. בתוך DMEM בצלוחית בעלת תחתית זכוכית ללא ציפוי, דגרו את התאים למשך 12 שעות לפחות בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה מרוכבת של 5% carbon dioxide.כדי להבטיח היצמדות ואקלימציה לאחר ההיצמדות, שאבו את המצע והוסיפו שני מיליליטר של DMEM מסוג pre-war DExT strand לצלח עם התחתית מזכוכית, ולאחר מכן דגרו את התאים במשך שעתיים עד שמונה שעות. שטפו את התאים שלוש פעמים עם DMEM מלא שחומם מראש. שאבו את המצע לאחר השטיפה האחרונה והוסיפו שני מיליליטר של DMEM מלא.דגרו את התאים למשך ארבע עד 12 שעות. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-DMEM מלא ללא פנול אדום שחומם מראש, והוסיפו שני מיליליטרים של DMEM מלא מסונן ללא פנול אדום לפחות 30 דקות לפני תחילת הדמיה. לאחר מכן, הביאו מנה של תרחיף חרוזים מצופה 1%IgG, שהוכנה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, לטמפרטורת החדר.בצע סוניקציה לתמיסה באמבט מים אולטרסוני למשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, תחת מ चैप्ट ביטחון ביולוגי דרגה 2, הוסף אחת עד שש µL של תרחיף החרוזים לתאים. פזר את ענן החרוזים הדחוס באמצעות פיפטה על ידי ערבוב עדין של התרחיף בתוך הצלחת בעלת התחתית מזכוכית.לאחר מכן, העבירו את הדגימה למיקרוסקופ והתמקדו באזור רב-העניין. לפני ביצוע הדמיות בשיטת time-lapse, בצעו אופטימיזציה להגדרות, כולל הסריקה, המהירות, ההגדלה והרזולוציה, כדי לאפשר לכידה של פריים אחד מדי שבעה עד 20 שניות.התאימו את הגדרות העירור והפליטה בהתאם למערכת הדמיה ולגששים שבהם נעשה שימוש, ובצעו אופטימיזציה של ההגדרות כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching) מופרז. לאחר מכן, צלמו את סרטון ה-time lapse ושמרו אותו בפורמט הקובץ המקורי של המיקרוסקופ שלכם. הימנעו מייצוא של הסרטון לפורמטים דחוסים כגון JPG או PNG.בשלב הבא, הפעילו את Fiji ו-Image J, הפצה הכוללת חבילת עיבוד תמונה עם תפריטי כלים מאורגנים מחדש ותוספים מובנים נוספים הזמינים להורדה בחינם. פתחו את הקובץ ב-Fiji ובחרו את הסרטון המיועד להערכה. לאחר מכן, הגדירו את האפשרויות, המסננים ופרמטרי המדידה כפי שפורטו בפרוטוקול הטקסט המצורף.בשלב הבא, סרקו את התמונות וסמנו את הפריים שבו נוצר פגוזום של חרוז ראשוני (nascent bead phagosome) בשל ומסובב, וה-F acidic cup סגור. השתמשו בכלי הבחירה האליפסי (Oval selection tool) כדי לבחור אזור עניין (ROI) מעגלי על החרוז שהופנם. ודאו שהבחירה צמודה לדפ外 החיצוני של החרוז.לאחר מכן עברו ללשונית analyze ולחצו על measure כדי לבצע את המדידה. התוצאה תוצג בחלון נפרד תחת הכותרת results. בפריים המעניין הבא, התאימו את מיקום ה-ROI במידה והחבב זז וחזרו על המדידה, אשר תתווסף לרשימה בחלון התוצאות.ניתן לזהות כל פריים שנותח על סמך הערך בעמודת התווית (label). לאחר השלמת המדידה של כל הפריים הרלוונטיים, העתיקו את הערכים מעמודת ה-int den לאפליקציית גיליון אלקטרוני. עמודת ה-int den מציגה את העוצמות של האזור שנבחר.באמצעות שיטות אלו, צולמו תמונות ברורות של מקפגוציות ממחית עצם שנטענו עם גששי רצפי DExT. תמונה זו היא מרגע אפס, בדיוק כאשר התא השלים את בליעת החרוז המקודד ב-IgG המצוין כאן. התמונות המוצגות כאן צבעו בצבעים מדומים (pseudo colored) לצורך נראות טובה יותר, והן מתארות פגוזום מדקה 0 ועד דקה 85 לאחר הבליעה.הפגוזום שנמדד, ה-ROI, מוקף בקו מקווקו, ומקרי ההובלה והצטברות של דקסטראן בפגוזום מסומנים על ידי החיצים. לאחר מכן נוצרו גרפים מתמונות אלו, המראים מגמה זמנית ברורה של קישור הסיגנל לפגוזום לאורך זמן. גרף זה מייצג ממוצע של 10 פגוזומים משני התאים המוצגים כאן.בעוד שעוצמת האות המוחלטת משתנה לרוב בין כל פגוזום שנותח, המגמה הזמנית היא בדרך כלל דומה מאוד. בהעברה של Dex 70 KD לפגוזומים, הושגה רמה של פלטו בתוך 35 עד 40 דקות לאחר הפגוציטוזה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן הערכת הבשלת פגוזומים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בשיטת time-lapse.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

סרטון וידאו זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת ברזולוציה גבוהה (TIRF) להדמיה בזמן אמת של היווצרות וסגירת פאגוזומים במהלך פגוציטוזה בתיווך מקרופאגים של תאי דם אדומים מסוג IgG (RBCs) המחוברים לפני השטח של צלחת תחתית זכוכית. המקרופאגים מרחיבים את הפסאודופודיה סביב ה-RBCs ובולעים אותם בתוך הפאגוזומים, ומנתקים אותם מפני השטח של הזכוכית.

הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

אנו מתארים שיטה למדידת מהירות הפגוזומים הנעים לעבר מרכז התא בתאים חיים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) מסוג 1 או בלעדיו, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של דיסק מסתובב לזיהוי תאים נגועים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ שדה בהיר לזיהוי פגוזומים.

הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1

כאן אנו מתארים טכניקה מבוססת מיקרוסקופ כדי להמחיש ולכמת את מפלי האירועים המוקדמים במהלך פגוציטוזיס של פתוגנים כגון הפטריות קנדידה אלביקנס וחלקיקים הגדולים מ-0.5 מיקרומטר כולל חרוזים מצופים זימוזאן ו-IgG.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.

במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם

נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

המנגנון הקשור לפאגוציטוזה בזיהום לישמניה נותר לא מובן. כאן אנו מתארים שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים.

חקירת הפאגוציטוזה של לישמניה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

מחקר זה מבהיר את העיבוד הפגוציטי של חלקיקי Godanti Bhasma (GB) בתאי יונקים, ומאפיין את ספיגתם התאית, דינמיקת הוואקואול, החמצה ופירוק. ממצאים אלה לא רק מקדמים את הבנתנו את מנגנוני הפגוציטוזה הבסיסיים, אלא גם מבססים את GB כמערכת מודל מבטיחה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

חקר האירועים התאיים הרציפים של פגוציטוזיס המופעלים על ידי גודנטי בהסמה בתאי יונקים

למדו לחקור את תהליך הבשלת הפאגוזומים והיווצרות הפאגוליזוזומים במקרופאגים בשידור חי. השיטה משתמשת בדקסטראן פלואורסצנטי לחקר דינמיקת התאים החיסוניים.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

גלה סרטונים נוספים