Name: הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1 + T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש Ex vivo עמית תרבות מערכת. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: חקור חישה מולדת של תאי CD4⁺ נגועים ב-HIV-1 על ידי תאים דנדריטיים פלזמציטואידיים. שיטת תרבית שכבה ex vivo מודדת ייצור אינטרפרון מסוג I ומסייעת להבנת התגובה החיסונית המוקדמת נגד HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים E. Massicotte וג &#39;ה&#39; לקבלת סיוע טכני מומחה בcytometry זרימה וניסויי מיון תא. כמו כן, ברצוננו להודות לצוות המרפאה IRCM וכל התורמים למתן דגימות דם. דגימות דם היקפיים התקבלו מתורמים מבוגרים בריאים שנתנו בכתב הסכמה מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי תחת פרוטוקולי מחקר שאושרו על ידי המועצה לביקורת האתיקה מחקר של מכון דה Recherches Cliniques מונטריאול (IRCM). התקבלו ריאגנטים הבאים באמצעות התכנית מגיב NIH האיידס, החטיבה של האיידס, NIAID, NIH: תאי MT4 מד&quot;ר דאגלס ריצ&#39;מן; וRIL-2 אדם מד&quot;ר מוריס גייטלי, הופמן - לה רוש בע&quot;מ ד&quot;ר כהן הוא הנמען של מחקר קתדרת קנדה בRetrovirology האדם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מCIHR (CIHR 111,226) לד&quot;ר כהן ומהחטיבות דה משוכלל ונדיר du קוויבק-סנטה (FRQ-S) רשת איידס לד&quot;ר Bego וד&quot;ר כהן.

הערות כלליות חשוב לשמור על תאים בתרבית ללא כל אנטיביוטיקה, מאז ניתן חש זיהומים חיידקיים אפילו נשלטים על ידי PBMCs. חישה כגון רכיבי חיידקים תגרום לייצור אינטרפרון רקע שלא ניתן להבחין בין שמופעל על ידי חישת HIV-1 ספציפית. יתר על כן, כל התאים צריכים להיבדק באופן שגרתי על היעדריו של זיהום mycoplasma. תמיד להשתמש בפתרונות ללא רעלן פנימי בכל ההזדמנות אפשרית. אפיון cytometric זרימה של התאים השונים כדי לשמש בשיתוף התרבויות (PBMCs, pDCs, MT4 ותאי CD4 + T) הוא צעד אופציונאלי, אך מומלץ מאוד שכן הוא יכול לספק מידע רב ערך הנדרש לפרשנות נכונה של ניסוי נתון. 1. הכנת תאי יעד נגוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קו של תאי CD4 + אדם MT4 בRPMI 1640 Mediבתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), המכונה מעתה ואילך כRPMI-1640 בינוניים מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאים מסוג CD4 + T העיקריות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי mononuclear מהדם היקפי אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ימפוציטים מסוג CD4 + T באמצעות ערכת סלקציה שלילית תאי CD4 + T, בעקבות ההמלצות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לימפוציטים מסוג CD4 + הפעל T עם PHA-L (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 48 שעות ולאחר מכן לשמור בRPMI-1640 בינוניים מלא בתוספת IL-2 רקומביננטי (100 U / ml). להדביק תאי T שלאחר בידוד 5 ימים ראשוניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום של תאי מטרה (קו תא MT4 T או תאי CD4 + T Heterologous העיקריים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני תרבות משותפת, להדביק תאי T עם נגיף ה- HIV-1. בדוגמא הספציפית המתוארת כאן pNL4.3-GFP_ires_Nef סוג בר (WT) או וירוסי pNL4.3-GFP_ires_Nef דלתא Vpu (dVpu) היה בשימוש. זני נגיפים אלה מייצגים GREen חלבון ניאון (GFP) -marked שיבוטים מולקולריים זיהומיות isogenic שונה רק ביכולתם להביע את פעולת ה- Vpu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש multiplicities שונה של זיהום (MOIs) ובחר תרבויות עם רמות דומות של זיהום לשיתוף תרבויות. היום של התרבות המשותפת, לקבוע את האחוז של ה- GFP + תאים על ידי cytometry זרימה כסמן לזיהום. השתמש בתרבויות רק עם טווח של תאים נגועים 20-50% לשיתוף תרבויות. </li></ol></li></ol> צעדים אופציונליים: בצעו צביעת cytometric זרימה בשלב זה להעריך את ביטוי פני השטח של מולקולות / ligands של עניין, כגון BST2, וCD4. עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 0.5 x 10 6 תאי T בפתרון לשטוף 100 μl, להוסיף 1 μl של אנטי-CD4_PerCP / Cy5.5 וμl 1 של אנטי-BST2_A660. דגירה צינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף. אם המחקרים שמטרתם להעריך את התפקיד של אנטגוניזם BST2 תיווך Vpu, לבצע חלקיקים HIV-1assay שחרור בשלב זה כפי שתואר לעיל 15. 2. בידוד והעשרה של תאי חישה (PBMCs כולו או pDCs מועשר) הערה: כאשר PBMCs משמש לחישה, להתחיל בידוד בתוך חצי שעה לאחר איסוף דם ולנהל אותו במועד. השתמש PBMCs מייד לשיתוף תרבויות או העשרת PDC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי mononuclear מהדם היקפי אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. שלב אופציונאלי: בצע צביעת cytometry זרימה רב-פרמטרית כדי לאשר שPBMCs מבודד טרי מכיל את שושלות תאים השונות ביחסים פיסיולוגיים. עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 10 6 PBMCs בפתרון של חסימת Fc 100 μl, דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, להוסיף μl 1 של אנטי-CD3_Pacific כחול (לתאי T), 1 μl של אנטי-CD14-PE_Texas אדום (לתאי מיאלואידית), 4 μl של אנטי-BDCA2_APC וμl 1 של אנטי-ILT7_PE (לPDC). דגירהצינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר pDCs באמצעות ערכת סלקציה שלילית PDC, בעקבות ההמלצות של היצרן. מומלץ לעבוד מהר, לשמור על תאים קרים, ולהשתמש בפתרונות מקוררים מראש. זה ימנע את מכסת של נוגדנים על פני התא ותיוג תא שאינו ספציפי, כמו גם להבטיח את פעילות PDC מקסימלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח התזרים cytometric רב פרמטרית של pDCs המבודדים הטרי כדי לאשר טוהר, אחוז ההעשרה, וכמויות יחסי של סמני משטח ספציפי pDC- (כגון ILT7 וBDCA2). עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 10 4 pDCs בפתרון של חסימת Fc 100 μl, דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, להוסיף μl 1 של אנטי-CD3_Pacific כחול, μl 1 של אנטי-CD14_PE_Texas אדום, 4 μl של אנטי-BDCA2_APC וμl 1 של אנטי-ILT7_PE. דגירה צינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). מינימום של 40% טוהר PDC מומלץ (אם חומר ההתחלה יש 0.4% PDC, זה יהיה שווה ערך להעשרה פי 100). </li></ol></li></ol> 3. משותף תרבות של תאים נגועים מסוג CD4 + T ותאי חישה (PBMCs כולו או pDCs מועשר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 220 μl של PBMCs (/ מיליליטר בריכוז הנע בין 100,000 ל 500,000 תאים) (בדילול ב850,000 תאים / מיליליטר) או 220 μl של pDCs עם 30 μl של תאי T נגועים (בדילול ב 10 6 תאים / מיליליטר) לכל גם ב צלחת גם 96 U-תחתון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפקדים, PBMCs צלחת או pDCs ותאי T לבד. להתאים את עוצמת קול ובל -250 μl עם RPMI 1640 בינוניים מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך תגובות הסלולר אגוניסט הידוע של מסלולי TLR7 וTLR9. לשם כך, 220 μl הצלחת של PBMCs (בדילול ב850,000 תאים / מיליליטר) או 200 μl של pDCs (בריכוז הנע בין 100,000 ל 500,000 תאים / מיליליטר) לכל היטב בצלחת גם U-תחתונה 96 ולהוסיף אגוניסט TLR7 ( אימיquimod, ריכוז סופי: 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) או אגוניסט TLR9 (ODN 2,216 CPG-, ריכוז סופי: 5 מיקרומטר). דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-22 שעות ולעבד אותם באופן דומה לשיתוף התרבויות המתוארות להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שיתוף תרבויות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-22 שעות, ולאחר מכן להעביר אותם לצלחת גם 96 V-תחתון. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את supernatants לצלחת גם 96 בעלת תחתית. ניתן לאחסן supernatants ב -80 ° C או המשמש לזיהוי סוג אני IFN מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי שיתוף תרבותי בparaformaldehyde 2% ולנתח אותם באמצעות cytometry זרימה. בשל הבדלים בגודל ובפרור, תאי MT4 הם להבחין בקלות מPBMCs או pDCs מבוסס על תופעות פיזורם (SS) לעומת קדימה-פיזור פרופילים (FS). אם תאי T עיקריים משמשים כתאי מטרה נגועה, אלה יכולים להיות מוכתמים עם כל צבע גשש תא, כגון CSFE, לשתף תרבות קודמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדידה ביו-הסוג אני IFN שימוש בתאי כתב β HEK-הכחול IFN-α /. הערה: תאים אלה נוצרו על ידי transfection היציב של תאי HEK293 עם גני STAT2 וIRF9 אדם להשיג סוג פעיל באופן מלא אני IFN מסלול איתות. הם גם מכילים את גן כתב phosphatase אלקליין המופרש (SEAP) תחת שליטתו של IFN-α / β אמרגן ISG54 מושרה. גירוי של תאים אלה עם סוג אני IFN מפעיל את JAK / STAT / ISGF3 מסלול וגורם ייצור של SEAP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HEK-הכחול IFN-α / β DMEM בתוספת 10% FBS. צלחת אותם בצפיפות של 50,000 תאים לכל גם בצלחת גם 96 בעלת תחתית, בנפח סופי של 180 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של supernatant התרבות המשותפת לכל טוב בשני עותקים. כל צלחת גם דורשת קבוצה של פקדים סטנדרטיים פנימיים (IFNα אדם, ריכוז סופי של 100 U / ml 2500 U / ml). דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 18שעה -22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע רמות של פעילות בסיסית phosphatase באמצעות פתרון Quanti-הכחול, שמשתנה מורוד לסגול / כחול בנוכחות של האנזים. הכן Quanti-כחול בעקבות ההמלצות של היצרן. להוסיף 180 μl של פתרון זה היטב בכל צלחת גם 96 בעלת תחתית. לכל אחד גם להוסיף גם 20 μl של supernatants תאי HEK-הכחול IFN-α / β המושרה, ודגירת הצלחת בחממה 37 ° C עד הצבע מתפתח בבארות שליטת IFN סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך רמות של SEAP באמצעות ספקטרופוטומטר ב620-655 ננומטר ולקבוע את הריכוז של הסוג-אני IFN על ידי ניפוח מהחלק ליניארית של העקומה סטנדרטית IFN. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in immunity.</a> Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).</li>
<li>Lepelley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+sensing+of+HIV-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Innate sensing of HIV-infected cells.</a> PLoS pathogens. 7, e1001284(2011).</li>
<li>Beignon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+HIV-1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+via+Toll-like+receptor-viral+RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).</li>
<li>Martinelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120+inhibits+TLR9-mediated+activation+and+IFN-%7Balpha%7D+secretion+in+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).</li>
<li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TLR7%2F9+responses+in+plasmacytoid+dendritic+cells+by+BST2+and+ILT7+receptor+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction.</a> The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).</li>
<li>Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-activated+interferon+regulatory+factor+7+upregulates+expression+of+the+interferon-regulated+BST2+gene+independently+of+interferon+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling.</a> Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpu+enhances+HIV-1+virus+release+in+the+absence+of+Bst-2+cell+surface+down-modulation+and+intracellular+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).</li>
<li>McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpu+binds+directly+to+tetherin+and+displaces+it+from+nascent+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions.</a> PLoS pathogens. 9, e1003299(2013).</li>
<li>Manel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryptic+sensor+for+HIV-1+activates+antiviral+innate+immunity+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells.</a> Nature. 467, 214-217 (2010).</li>
<li>Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytosolic+exonuclease+TREX1+inhibits+the+innate+immune+response+to+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1.</a> Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).</li>
<li>Fonteneau, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+and+concomitantly+induces+the+bystander+maturation+of+myeloid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells.</a> Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).</li>
<li>Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+induction+by+HIV-1-infected+cells%3A+a+possible+role+of+sulfatides+or+related+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids.</a> Virology. 221, 113-119 (1996).</li>
<li>Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-infected+cells+are+major+inducers+of+plasmacytoid+dendritic+cell+interferon+production%2C+maturation%2C+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration.</a> Virology. 343, 256-266 (2005).</li>
<li>Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+calcium-modulating+cyclophilin+ligand+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+particle+release+and+cell+surface+expression+of+tetherin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin.</a> Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).</li>
<li>Grouard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+plasmacytoid+T+cells+develop+into+dendritic+cells+with+interleukin+%28IL%29-3+and+CD40-ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand.</a> The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).</li>
<li>Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection%3A+striking+a+delicate+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance.</a> Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).</li>
<li>Bego MG,, Côté, É, Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohen+%C3%89A.+Exploits+the+Cross-Talk+between+BST2+and+the+ILT7+Receptor+to+Suppress+Anti-HIV-1+Responses+by+Plasmacytoid+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Cohen ÉA. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005024(2015).</li>
</ol>

הפרוטוקולים שתוארו כאן למדוד חישה של תאי T נגועים בוירוסים מתויג GFP HIV-1 שנבדלים רק ביכולתם להביע את פעולת ה- Vpu, כפי שתוארו בדו&quot;ח האחרון שלנו 18. עם זאת, יכולים היו בקלות להיות שונה בשיטות אלה כדי ללמוד חישה של וירוסים לא מתויגים כמו גם וירוסים חסרי גנים נגיפיים אחרים שעלולים לווסת חישה מולדת. אם הווירוסים משמשים לא להביע GFP, אחוז תאי יעד הנגועים צריכים להיקבע על ידי אמצעים אחר לפני תרבות משותפת, כגון p24 (קפסיד) מכתימה תאית וcytometry זרימה או על ידי p24 ELISA. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה עם תאי T היעד שונים, כוללים מגוון רחב של שורות תאים זמינות ותאים ראשוניים. יש השיטות שתוארו בכתב היד הזה יש מספר היתרונות בהשוואה לשיטות המוקדמות נהגו ללמוד חישת HIV-1. בראש ובראשונה את זה כבר נקבע על ידי מספר הקבוצות שp HIV-1-תא ללאמאמרים מעוררים עניים מהסוג-אני IFN 2,13,14. יתר על כן, מחקרים מוקדמים הסתמכו על שיטות מבוססות ELISA IFNα מבוגרות לכמת את כמות סוג אני IFN מיוצרת. הגבלה של טכניקת זיהוי זה היא שרוב ערכות IFNα ELISA המבוגרות למדוד רק סוג אחד של IFNα, בעוד שמשקיף סוגי IFNα וIFNβ האחרים. השימוש בשורות תאי הכתב תיארו מתגברת על מגבלה זו כריכוז של כל הצורות ביו של IFNs סוג-אני האנושי ניתן למדוד בפעם אחת. הטכניקה היא רגישה מאוד, יקרה פחות מהדור החדש של ערכת ELISA IFN ולתורמים רבים כמויות גדולות של הסוג-IFN אני יכול בקלות להיות מזוהות. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לשימוש עם סוג אני IFN שיטות אחרות לקריאה החוצה כגון ELISAs. צעדים קריטיים: חשוב שהאיכות של כל המרכיבים התאיים (המטרות והן effectors) להיות מבוקרת היטב. זיהום פוטנציאלי, גם כאשר asymptomatic, צריך להיות במעקב ובשליטה. כפי שהזכרנו קודם לכן, אנטיביוטיקה בשליטת זיהום חיידקים ללא תסמינים, ופתוגנים תאיים פוטנציאלי אחרים כגון mycoplasma, יכולים ליצור תגובה חיסונית דומה לאלה שנצפו לאחר הדבקת HIV-1, כלומר ייצור של הסוג-אני IFN. יתר על כן, כל חומרים כימיים צריכים להיות חופשי של LPS או אנדוטוקסינים פוטנציאליים אחרים. כמו כן, ניטור של PBMCs וpDCs חשוב גם כן לעתים קרובות יכולות להיות דרוכים דגימות אנושיות על ידי זיהומים מתמשכים הבסיסיים, אשר עשוי להשפיע חישה נורמלית. אנחנו תמיד ממליצים כוללים בקרות שליליות המוצעות, כגון העדר תאי יעד, כמו גם שיתוף תרבויות עם תאים נגועים מדומים. כדאיות של תאים נגועים היא גם חשובה לחישה נכונה PDC מאז סוג אני IFN אינו מיוצר הבא תרבות משותפת עם תאים אפופטוטיים 2,14. מגבלה חשובה אחת של הטכניקה היא את הצורך בתאים ראשוניים מבודדים טרי. הליך זה לא היה<html> נבדק באמצעות PBMCs או pDCs שהוקפאו או נשמר בתרבות או בעבר. הבידוד של PBMCs הוא עבודה אינטנסיבית ויש לי תאים אלה אורך חיים מוגבלים מאוד. יתר על כן, יש להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים להגנה מפני פתוגנים שמקורן בדם בעת שעבדו עם דם אנושי. לעתים קרובות יש כמה מקורות שונות הקשורים בעבודה הכרוכה בתאים אנושיים מבודדים טרי. ביניהם ההליכים השונים יושמו לבודד תאים אלה, וההשתנות בירושה נתקלו מתורם לתורם הם. בעוד שאי אפשר להימנע משונות בין תורם, השימוש בפקדים חיוביים הציעו, כגון מדידת תגובה לאגוניסטים ידועים של מסלולי TLR7 וTLR9, יספק בקרה פנימית חשובה לניסויים אלה. אנחנו הבחנו שתגובה חזקה לאגוניסטים של מסלול TLR9 יכולה להיות מתואמות עם תגובת PDC בריאה, ואילו נדרש מסלול TLR7 מגיב לתגובה הולמת נגד HIV-1 3. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; בהתבסס על תצפיות שנעשו על ידי אותנו ואחרים 2, העשרת pDCs מPBMCs לעתים קרובות אין צורך. עם זאת, אם עיצוב ניסיוני דורש את זה (למשל בהקשר שבו יש צורך בדלדול של סמני משטח PDC ספציפיים) סלקציה שלילית עדיף על בחירה חיובית, כמו תאים להישאר חופשיים של נוגדן לאחר תהליך הבחירה. pDCs המבודד עובר אפופטוזיס המהיר בתרבות. לניסויים הדורשים תאים אלה להיות מתורבתים לתקופה ארוכה של זמן, יכולה להיות בתוספת תקשורת ותרבות עם IL-3. ציטוקינים זה גורם התפשטות PDC ומעכב אפופטוזיס 16. עם זאת, IL-3 שימוש צריך להיות מבוקר היטב שכן הוא עלול להוביל להתבגרות או בידול PDC. השיטה המתוארת כאן משלבת יעד HIV-1 תאים נגועים בPBMCs או pDCs המבודדים טרי כדי לשחזר מעורבים בחישה מולדת הצעדים הראשוניים. שיטה זו תהיה ללא ספק להיות שימושית לExplorאירועי הדואר מוקדמים מולדים חיסוניים קשורים לזיהום HIV. למרות שהפרוטוקולים הנלווים מכוונים מדידה מסוג אני IFN, הם יכלו בקלות להיות שונה כדי למדוד מולקולות ביו אחרות שוחררו מpDCs בעת ההכרה של תאים נגועים. אלו יכולים לכלול: סוג III-IFN (IFN-λ), ציטוקינים פרו-דלקתיים (כגון TNF-α ו- IL-6) וCXCL10 כמוקינים, CCl4, וCCL5 17.

<html> pDCs IFN-ייצורי-הקלד מייצג את קו הגנה הראשון מפני זיהומים נגיפיים, ובתור שכזו ישמש כקישור חיוני בין חסינות מולד אדפטיבית 1. בעוד חלקיקי HIV-1-תא ללא מזוהים היטב על ידי מערכת החיסון המולדת, תאי CD4 + T נגוע HIV-1 הם חשו ביעילות על ידי pDCs 2. מנגנון החישה דורש קשר ראשוני בין גליקופרוטאין הנגיפי המעטפה (gp120) על פני השטח של התאים הנגועים T מסוג CD4 ומולקולות בPDC, אשר לאחר מכן ואחריו ללכוד וירוס והפנמה על ידי PDC. הכרה עוקבת RNA HIV-1 שהועבר על ידי TLR7 מפעילה את ההפעלה של Myd88 / מסלול IRF7 וסופו של דבר מובילה לסוג-שהייצור IFN 3. חשוב לציין, המסלול השני החישה הנוכחי בpDCs, אשר מתווך על ידי TLR9, הוא מעוכב על ידי האינטראקציה של גליקופרוטאין הנגיפי, gp120, עם BDCA2 סמן משטח PDC הספציפי 4. &gt; מסלולי חישת TLR7 וTLR9 של PDC יכולים להיות מווסת על פוטנציאל שלילי על ידי ההתקשרות של BST2 (גם המיועדת Tetherin או CD317) עם עוד קולט מעכב משטח PDC ספציפי נקרא ILT7 5. BST2 מתבטא ברמות גבוהות על פני השטח של pDCs וכמה תאי סרטן, אך ברמות נמוכות יחסית בסוגי תאים אחרים, כגון תאי B, מקרופאגים, תאי T ו. חשוב לציין, יכול להיגרם על ידי BST2 סוג אני IFN במספר שורות תאים הפכו, כמו גם בתרביות תאים ראשוניות של מקורות אנושיים ועכבריים 6. מלבד תפקוד מערכת חיסון-הרגולציה שלה, BST2 נמצא לאחרונה כדי לעכב את שחרורו של HIV-1 ואחר עטפו חלקיקים נגיפיים על ידי חלקיקי נגיף המתהווים cross-linking על פני השטח של התאים הנגועים 7. במקרה של HIV-1, חלבון אבזר קידוד הווירוס U (Vpu) הוצג לפעול כיריב BST2. הוא האמין כי פעולת ה- Vpu downregulates BST2 מתא השטח של תאים נגועים בנגיף HIV-1, באתר שלה לקשורing פעילות וכתוצאה מכך משפר את השחרור נגיפי ולהפיץ 7, למרות שרעיון זה כבר אתגר 8,9. בהעדר פעולת ה- Vpu, מספר גדול של נוצר באופן מלא וחלקיקי HIV-1 צאצאים בוגרים נשמרים על פני התא. אם חלקיקים קשורים אלה יכולים לייצג מטרות יעילות לחישה חיסונית עדיין נותר פתוח. בנוסף, לא ברור אם פעולת ה- Vpu תוכל dysregulate ייצור IFN-אני סוג מpDCs על ידי ויסות משטח BST2 רמות. מחקרים מוקדמים נועדו להעריך חישת HIV-1 נערכו באמצעות חלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, שנחשבים בדרך כלל מעוררים עניים מסוג-אני IFN 3,10-12. בהתחשב בכך שהמחקרים האחרונים מראים כי PBMCs וpDCs יעילות לחוש לימפוציטים מסוג CD4 + T נגוע ב- HIV 2,13,14, אנו מתארים כאן שיטה פשוטה למדידת תגובות מולדת מופעלות על ידי pDCs בעת ההכרה של תאים נגועים בנגיף HIV-1 במבחנה.

<table><tbody><tr><td>תאי MT4</td><td>תוכנית ריאגנטים לאיידס של NIH</td><td>120</td><td>מגיב זה הושג באמצעות תוכנית ריאגנטים לאיידס, המחלקה לאיידס, NIAID, NIH: MT-4 מד"ר דאגלס ריצ'מן.</td></tr><tr><td>HEK-Blu IFN-&alpha;/&beta; תאי מדווח&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>HKB-IFNAB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll-P&acirc; que Plus</td><td>Myltenyi</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאי T CD4+ II</td><td>Myltenyi</td><td>130-091-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאים דנדריטיים פלסמציטואיד יהלום II&nbsp;</td><td>Myltenyi</td><td>130-097-240</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O2769</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מגיב איידס אנושי rIL-2</td><td>NIH</td><td>136</td><td>מגיב זה הושג באמצעות תוכנית ריאגנטים לאיידס, החטיבה לאיידס, NIAID, NIH: rIL-2 אנושי מד"ר מוריס גייטלי, הופמן - לה רוש בע"מ.</td></tr><tr><td>Imiquimod</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-IMQS</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ODN 2216 CpG-A</td><td>Hycult Biotec</td><td>HC4037</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IFN&אלפא אנושי;</td><td>PBL אינטרפרון מקור</td><td>11100-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>קוונטי-כחול&nbsp;</td><td>סידרליין</td><td>REP-QB2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>זרימה ציטומטרית (נוגדנים/ריאגנטים)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת חסימת Fc (הרכב למטה):</td><td></td><td></td> <td>הערה: הכינו תמיסת כביסה (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td></tr><tr><td>10% סרום עיזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% סרום ארנב</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 9133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום עכבר 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 5909</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2.5 מ"ג/מ"ל IgG</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> I <td>אנושי 4506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-CD3_Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>300417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD14_PE-TxRed</td><td>Life Technologie</td><td>MHCD1417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי BDCA2_APC</td><td>Myltenyi</td><td>130-090-905</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגד ILT7_PE</td><td>Biolegend</td><td>326408</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-CD4_PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>317427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-BST2_Alexa 660</td><td>eBioscience</td><td>50-3179</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>פ 6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מסננת סלולרית</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>מכשיר ADP ציאן&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>CY20030</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

הערכת חישה המולדת של cd4 הנגוע ב- hiv-1<sup&gt; +</sup&gt; t תאים על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid שימוש<em&gt; ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 חישה מולדת דורשת מגע ישיר של תאים מסוג CD4 + T נגועות בתאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). על מנת ללמוד את התהליך הזה, הפרוטוקולים המתוארים כאן להשתמש בתאים מבודדים טרי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) לחוש זיהומים באו קו T תא (MT4) או תאי CD4 + T Heterologous העיקריים. על מנת להבטיח חישה נכונה, זה חיוני כי PBMC מבודדים מייד לאחר איסוף דם ושהאחוז האופטימלי של תאי T נגועים משמש. יתר על כן, מכתים התזרים cytometric רב פרמטרית ניתן להשתמש כדי לאשר כי דגימות PBMC מכילות את שושלות תאים השונות ביחסים פיסיולוגיים. מספר הפקדים יכול להיכלל גם להעריך את הכדאיות ואת הפונקציונליות של pDCs. אלה כוללים, הנוכחות של סמני משטח ספציפיים, הערכת תגובות הסלולר אגוניסט הידוע של רצפטורים אגרה-כמו (TLR) מסלולים, ומאשר חוסר sponייצור taneous סוג אני אינטרפרון (IFN). במערכת זו, PBMCs או pDCs המבודדים טרי הם שיתוף תרבותי עם HIV-1 תאים נגועים ב 96 צלחות גם ל18-22 שעות. Supernatants משיתוף תרבויות אלה משמשים לאחר מכן כדי לקבוע את הרמות של IFNs סוג אני ביו ידי ניטור ההפעלה של מסלול ISGF3 בתאים / β IFN-α HEK-הכחול. לפני ובמהלך תנאי שיתוף תרבות, יכולים להיות נתונה תאי יעד לניתוח תזרים cytometric לקבוע מספר הפרמטרים, ביניהם אחוז התאים הנגועים, הרמות של סמני משטח ספציפיים, והרג ההפרש של תאים נגועים. אמנם, פרוטוקולים אלה פותחו בתחילה כדי לעקוב ייצור מסוג אני IFN, הם עלולים לשמש כדי לחקור מולקולות imuno-modulatory אחרים שוחררו מpDCs ולהשיג תובנה נוספת לתוך המנגנונים המולקולריים השולטים HIV-1 חישה מולדת.

מערכת שיתוף התרבות המתוארת באיור 1 מאפשרת למחקר מבוקר של HIV-1 חישה מולדת. בשל האופי המשתנה של תאים ראשוניים, חשוב שהיחסים נורמלים של מיאלואידית ותאי T (CD14 + וCD3 + בהתאמה) הם נצפו, כמו בדוגמא המוצגת באיור 2 א. יתר על כן, רק מספר נמוך של תאים מופעלים T (FS גבוה יותר ורמות גבוהות יותר CD3 בהשוואה לתאי T מופעל ללא) רצוי בתרבויות PBMCs המבודדים הטרי. PBMCs עם יחסים נורמליים בין תאים מהסוגים השונים הם לעתים קרובות לא מסוגל הרכבה תגובה חיסונית מולדת נכונה במבחנה, כנראה עקב פנוטיפ כבר הופעל כתוצאה מזיהום מתמשך. והכי חשוב, את האחוז היחסי של pDCs צריך להיות מוערך כפי שמוצג באיור 2. למרות שאחוז זה יכול להשתנות 0.2-1.2%, פנוטיפ חישה נורמלי הוא ציין גם עם שני extreMES של טווח זה. העשרת pDCs באמצעות סלקציה שלילית לעתים קרובות מניבה 50-95% טוהר PDC, כפי שניתן לראות בשתי דוגמאות באיור 2 (92% ו -72%). דוגמא טיפוסית לניסוי הכולל מוצגת באיורים 3 ו -4. בדוגמא זו, תאי MT4 נדבקו pNL4.3-GFP_ires_Nef WT או דלתא Vpu להשיג זיהום 30% בזמן של התרבות המשותפת (איור 3 א). כפי שתואר לעיל, רק הזיהומים בוירוס WT הביאו את תקנה משמעותית של BST2 פני השטח (איור 3). בשל חילוקי הדעות ביניהם בגודל ובגרעיניות, תאי MT4 ניתן להבחין בקלות מPBMCs ידי cytometry זרימה (איור 4 א). לאחר הדגירה התרבות המשותפת, PBMCs רק במגע עם אגוניסט הידוע TLR7 או TLR9 וPBMCs במגע עם HIV-1 כמויות משמעותיות תאים נגועים שוחררו מהסוג-אני IFN (איור 4). אין IFN זוהה בPBMCs לבד, בשיתוף מ&quot;ק PBMCsltured עם תאי MT4 נגועים מדומים, או בתאים נגועים MT4 לבד (איור 4). בדוגמא שהוצגה כאן, חישה מולדת של תאי MT4 נישאים HIV-1 על ידי PBMCs נמצאה להיות מופחת באופן משמעותי בנוכחות Vpu. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> איור 1:. סקירה סכמטי של תכנון ניסוי SUP: supernatant <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> איור 2: אפיון פנוטיפי של PBMCs וenr המבודדים טריpDCs iched. () התפלגות נורמלית של תאי מיאלואידית ותאי T שנצפו בPBMCs מבודד מתורם בריא (אחוז מתאי מיאלואידית צריך לנוע בין 10-20% ותאי T בין 55-65%). מדגם PBMCs היו מוכתם באמצעות נוגדני fluorophore מצומדות שיכירו CD14 פני השטח (סמן שושלת מיאלואידית) וCD3 (סמן תא T). אפיון פנוטיפי של pDCs (B). לפני pDCs העשרה מייצג בין .2-1.2% מהמספר הכולל של תאים בתוך PBMCs (0.99% בדוגמא מוצגים). ניתן לזהות תאים אלה מבוססים על ביטוי של סמנים ספציפיים, כגון BDCA2 וILT7, שנכחו בשטח פני התא. סלקציה שלילית יכולה לשמש כדי להעשיר באופן משמעותי את מספר pDCs ולחסל זיהומים שעלולים להיות מזיקים, כגון תאי CD14 + מיאלואידית (העשרה להגיע 92% ו -72% בשתי דוגמאות מוצגות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">CLI</a>CK כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> אחוז אפיון של תאי MT4 יעד נישאים HIV-1 (א) של תאים נגועים בתרבויות MT4 הנגועים בpNL4.3-GFP_ires_Nef WT או dVpu כפי שנקבעו על ידי אחוז התאים החיוביים GFP: איור 3.. ביטוי פני תא (ב &#39;) BST2 בתאים הנגועים הוערך לאחר צביעת פני השטח. היסטוגרמות האפורה מילא מייצגת תאים נגועים מדומים מוכתמים בדם לפני חיסון הארנב (שליטה בלא כתם); היסטוגרמות שנותרה לייצג תאים מוכתמים בסרום ארנבת polyclonal אנטי-BST2. היסטוגרמות עם קווים מוצקים מייצגת שלילי שליטת GFP (נג) תאים; בעוד היסטוגרמות עם קווים מקווקווים מתאים לתאים נגועים GFP חיוביים (POS). אומר שפעתעוצמת orescence ערכים (MFI) מצוינים עבור כל דגימה. Cytometry זרימה בוצע ונותח, כמתואר באיור 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> איור 4:. תרבות Co של PBMCs מבודד טרי ותאי T נגועים MT4 () השוואת cytometry זרימת פרופילי FS / SS נצפו לתאי T MT4 לבד, PBMCs לבד, או שיתוף תרבויות בין PBMCs ותאי T MT4. בשל הבדלים בגודל ובגרעיניות, תאי T MT4 ניתן להבחין בקלות מPBMCs בשיתוף תרבויות באמצעות cytometry זרימה. דוגמא מייצגת של כמות סוג אני IFN שוחררה לאחר גירוי של PBMCs עם TLR (ב)7 או אגוניסט TLR9 (לפני), או לאחר שיתוף תרבויות עם מדומה או תאי MT4 המצוין נגועים בpNL4.3-GFP_ires_Nef WT או dVpu. הנתונים גולמיים מוצגים כOD 650 ערכים וconverseion המקביל להקליד-אני ריכוז IFN לידי ביטוי בU / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוערכו על ידי שחרורו של הסוג-אני IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא להעריך את החישה המולדת של תאי T חיוביים ל-CD4 המודבקים ב-HIV-1 על ידי תאים דנדריטיים פלסמציטואידיים, או PDCs. דבר זה מושג תחילה על ידי הדבקת תאי T חיוביים ל-CD4 ב-HIV-1. בשלב השני, תאי ה-T המודבקים גודלים בתרבית משותפת (co-culture) עם PDCs.לאחר 18 עד 22 שעות, אוספים את העל-נוזלים (supernatants) מהתרביות המשותפות לצורך כימות ייצור אינטרפרון מסוג 1 על ידי תאי PDC. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בייצור אינטרפרון מסוג 1 כדי להעריך את הרגישות של תאי PDC המבודדים מדם אנושי להדבקה של תאי T חיוביים ל-CD4 ב-HIV-1. שיטה זו עשויה להיות שימושית לחקר הגורמים הווירוסליים וגורמי המארח השולטים בתגובה החיסונית המולדת המוקדמת בזיהוי פתוגנים, כגון זיהוי תאי T חיוביים ל-CD4 המודבקים ב-HIV-1 על ידי תאים פלסמציטואידיים (plasmacytoid dendritic cells).למרות שפרוטוקולים אלו נועדו למדידת אינטרפרון מסוג 1, ניתן להתאימם בקלות לזיהוי מולקולות ביו-אקטיביות אחרות המופרשות על ידי PC בעת זיהוי של תאי T נגועים, כגון אינטרפרון גמא, TNF אלפא, או קינינים. להדבקה של תאי T ראשוניים חיוביים ל-CD4, התחילו בהפעלת תאי T חיוביים ל-CD4 שבודדו מדם פריפריאלי אנושי באמצעות PHAL למשך 48 שעות. תחזיקו את התאים במצע מלא, מועשר ב-IL-2 רקומביננטי, למשך שלושה ימים לפחות לפני ההדבקה. לאחר מכן, במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3), הדביקו את תאי ה-T עם נגיפי HIV-1 תוך שימוש בריבוי הדבקה (MOI) שונה; המדידה תבוצע יומיים לאחר ההדבקה.העריכו את תרביות התאים עבור ביטוי של GFP BST two ו-CD four. השתמשו רק בתרביות עם 20 עד 50% חיוביות ל-GFP עבור ניסויי התרבית המשותפת במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level two). לאחר מכן, בודדו את התאים המוניקלאריים מדגימת דם פריפרית אנושית באמצעות סבב צנטריפוגה במעבר דחיסות (density gradient centrifugation) בתוך חצי שעה מרגע איסוף הדם.לאחר מכן, צבעו את התאים עם הנוגדנים המתאימים כדי לאשר כי שושלות התאים הרצויות בודדו ביחסים פיזיולוגיים. עבדו במהירות כדי לשמור על התאים קרים. השתמשו בערכה לברירה שלילית של PDC כדי להעשיר את ה-PDCs בתוך ה-PBMC שבודדו, בהתאם להמלצות היצרן.לאחר מכן, אשר את אחוז הניקיון של ההעשרה ואת הכמויות היחסיות של סממנים שטח ספציפיים ל-PDC, כגון I LT seven ו-BDCA two, באמצעות ציטומטריית זרימה. דגימות מועשרות צריכות להכיל לפחות 40% PDCs. כעת, בצע תרבית משותפת של 220 µL של תאי החישה עם 30 µL של תאי T נגועים לכל באר בפלטת 96 בארות בעלת תחתית בצורת U. הוסף בארי בקרה המכילים את תאי החישה או את תאי המטרה לבדם, והבאת את הבארים הללו לנפח סופי של 250 µL באמצעות מצע גידול מלא. כדי להעריך את תגובות ה-PDC לאגוניסטים ידועים של קולטני toll-like, הוסף אגוניסט של TLR seven או TLR nine לבארים המתאימות והדגר את הפלטה ב-37 °C וב-5% CO2 למשך 18 עד 22 שעות.בסיום התרבית המשותפת (co-culture), העבירו את התאים לפלטת 96 בארות בעלת תחתית V וסובבו את הפלטה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 Gs ובטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את העלונות (supernatants) לפלטת 96 בארות בעלת תחתית שטוחה. השעיו מחדש את משקעי התאים ב-2% paraform aldehyde, ונתחו אותם באמצעות ציטומטריית זרימה (flow cytometry) תוך שימוש בגודלם ובגרנולציה שלהם כדי להבדיל בין התאים בתרשים של forward scatter לעומת side scatter.למדידת אינטרפרון מסוג 1 ביו-אקטיבי באמצעות תאי דוח (reporter cells) של hcbl interferon alpha beta, יש להוסיף תחילה את תאי הדוח לצלוחית בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה בצפיפות של 50,000 תאים לבערה, לנפח סופי של 180 µL. לאחר מכן, יש להוסיף לשתי בארות בשכפול 20 µL מהעליון (supernatant) של תרבית השיתוף (co-culture) שנאסף זה עתה; יש לכלול סט של בקרות סטנדרט פנימיות ולהדגיר את הצלוחית בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 18 עד 22 שעות. כדי לקבוע את רמות הפוספטאז האלקלי (alkaline phosphatase) ששוחרר מתאי הדוח, יש להוסיף 180 µL של תמיסת quantum blue לכל בארה בצלוחית חדשה בעלת תחתית שטוחה. לאחר מכן, יש להוסיף לכל בארה 20 µL מהעליון של תאי HEC PLU interferon alpha beta שעברו השראה, ולהדגיר את הצלוחית בטמפרטורה של 37 °C עד לפיתוח צבע בבארות בקרת האינטרפרון הסטנדרטיות.התמיסה הכחולה הקוונטית משנה את צבעה מוורוד לכחול-סגול בנוכחות האנזים. לבסוף, השתמש בספקטרופוטומטר כדי להעריך את רמות הפוספטאז האלקלי המופרש ב-620 עד 655 nanometers וקבע את ריכוז ה-type one interferon באמצעות אקסטrapולציה מהחלק הלינארי של עקומת הסטנדרט של ה-interferon. בשל אופיים המשתנה של תאים ראשוניים, חשוב שייצפו יחסים נורמליים של תאי myeloid חיוביים ל-CD 14 ותאי T חיוביים ל-CD three, כפי שמוצג בתרשימי הנקודות (dot plots) המייצגים הללו.יתר על כן, רק מספר נמוך של תאי T מופעלים, המזוהים על ידי פיזור קדמי (forward scatter) גבוה יותר ורמות CD3, רצוי בתרביות PBMC שבודדו acabado. החשוב ביותר הוא שיש לקבוע את האחוז היחסי של PDCs, למרות שאחוז זה עשוי להשתנות בין 0.2% ל-1.2%. פנוטיפB sensing חריג נצפה גם בשני קצוות טווח זה. העשרה של PDCs באמצעות ברירה שלילית מניבה לרוב טוהר PDCs של 50% עד 95%, כפי שניתן לראות בשני תרשימי הפיזור (dot plots) המייצגים אלו מתורמים שונים.דוגמה טיפוסית לניסוי הכולל מוצגת במספר הדמויות הבאות. במחקר מייצג זה, תאי MT four הודבקו עם P and l 4.3 GFP, IRIS NF wild type, או delta VPU כדי להשיג 30% זיהום במועד תחילת התרבית המשותפת (co-culture).כפי שתואר בעבר, רק הזיהומים בנגיס מסוג הבר (wild type) הובילו להפלה משמעותית (downregulation) של BST2 על פני השטח. בשל ההבדלים בגודל ובגרנולריות, ניתן להבחין בקלות בין תאי MT-4 לבין תאי pBMC באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר התרבית המשותפת. רק pBMC בנוכחות אגוניסטים ידועים של TLR7 או TLR9, או pBMC במגע עם תאים נגועים ב-HIV-1, שחררו כמויות משמעותיות של אינטרפרון מסוג 1. לא זוהה אינטרפרון ב-pBMC לבד, בתרבית משותפת של pBMC עם תאי MT-4 שאינם נגועים (mock infected), או בתאי MT-4 נגועים לבדם. בדוגמה המוצגת כאן, נמצא כי הזיהוי המולד של תאי MT-4 נגועים ב-HIV-1 על ידי pBMC פחת באופן משמעותי בנוכחות VPU.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע כל מקור של זיהום. השתמשו תמיד בתמיסות נקיות מאנדוטוקסינים. זכרו לבדוק באופן שגרתי זיהומים למיקופלסמה ולשמור את התאים בתרבית ללא אנטיביוטיקה, שכן אפילו זיהומים בקטריאליים מבוקרים יכולים להיות מזוהים על ידי PBMs.אל תשכחו שתאי PC הם תאים שבירים מאוד. הם בעלי אורך חיים מוגבל, והתגובתיות שלהם עלולה להיפגע אם הפרוצדורה לא תבוצע בזמן.

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מבחני cytotoxicity למדוד טבעי התא הרוצח התגובות ממס ל-HIV נגועים בתאי מוגבל על ידי טוהר התאים היעד. אנו מדגימים כאן את בידודה של אוכלוסייה מטוהרים של HIV-1 נגוע T-cell תקיעות ראשונית על ידי ניצול היכולת של HIV-1 אל מטה לווסת CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

סרטון זה מדגים בדיקת פוספטאז אלקליין אלקליין עוברית המופרשת באמצעות תאי כתב אינטרפרון-α/β HEK-Blue כדי לכמת את האינטרפרונים מסוג I (IFNs) המשתחררים בעקבות גירוי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים על ידי תאי T CD4+ נגועים ב- HIV-1.

כימות של אינטרפרונים ביו-אקטיביים מסוג I באמצעות בדיקת כתב אלקליין אלקליין מופרש

סרטון זה מדגים שיטה להמרת תאים דנדריטיים (DCs) ל-DCs סובלרוגניים (TolDCs) באמצעות סוכן תרופתי אימונומודולטורי. המרה זו מאושרת על ידי הערכת הפונקציה TolDC באמצעות ההשפעה החיסונית שלהם על תאי CD4+ T.

השפעת סוכן פרמקולוגי אימונומודולטורי על האינטראקציה בין תאים דנדריטיים ותאי T CD4+

פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

הבנת קונפורמציות של אנטיגנים על פני השטח של הנגיף נדרשת כדי להעריך את נטרול הנוגדנים ולהדריך את התכנון של אימונוגנים יעילים לחיסון. כאן אנו מתארים בדיקת ELISA מבוססת תאים המאפשרת לחקור את הזיהוי של HIV-1 Env טרימרי המתבטא על פני תאים שעברו טרנספטציה על ידי נוגדנים ספציפיים נגד Env.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבניית מודל עכבר מח עצם/כבד/תימוס אנושי עם חסינות מהונדסת מבוססת תאי גזע נגד זיהום HIV.

תאי גזע מהונדסים חסינות בהתבסס נגד HIV זיהום במודל העכבר האנושי

כאן, אנו מדגימים כיצד מונוציטים מבודדים על ידי הפרדת חרוזים מגנטיים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי לאחר צנטריפוגה בשיפוע צפיפות של דם אנושי נוגד קרישה. לאחר הדגירה במשך 5 ימים, מונוציטים אנושיים מתמיינים לתאים דנדריטיים לא בשלים ומוכנים להליכים ניסיוניים בסביבה לא קלינית.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

כאן, אנו מתארים כמה שיטות מבוססות לקביעת מתח רשתית אנדופלסמית (ER) והפעלת תגובת חלבון פרושה (UPR), עם דגש מיוחד על זיהום HIV-1. מאמר זה מתאר גם סדרה של פרוטוקולים כדי לחקור את ההשפעה של מתח ER / UPR על שכפול HIV-1 והדבקה virion.

מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

כאן, אנו מפרטים פרוטוקול פשוט, מהיר ואמין של זרימה רב-פרמטרית בסיוע ציטומטריה וגידול על שבב כדי לנטר ולאפיין את השלבים המרכיבים את מחזור החיסון לסרטן. ואכן, הבנה מעמיקה של יחסי הגומלין בין סרטן לתאי מערכת החיסון מספקת תובנות קריטיות כדי להערים על גידולים ולהנחות את הטיפול הקליני.

תרבות משותפת במערכות מבחנה כדי לשחזר את מחזור החיסון לסרטן

חקור חישה מולדת של תאי CD4⁺ נגועים ב-HIV-1 על ידי תאים דנדריטיים פלזמציטואידיים. שיטת תרבית שכבה ex vivo מודדת ייצור אינטרפרון מסוג I ומסייעת להבנת התגובה החיסונית המוקדמת נגד HIV.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1

גלה סרטונים נוספים