Name: קופסית Serotyping של Streptococcus pneumoniae שימוש תגובת Quellung (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: למדו לבצע סרוטיפינג קפסולרי של Streptococcus pneumoniae באמצעות תגובת Quellung. שיטה זו, תקן הזהב במיקרוביולוגיה קלינית, מאפשרת זיהוי סרוטיפים בכ-10 דקות תחת מיקרוסקופ פאזה קונטרסט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (פרויקט PneuCarriage, גרנט 52099) ותכנית התמיכה בתשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני. תודה לאיילין דאן, ג&#39;נט Strachan, וקים הייר לקריאה ביקורתית של כתב היד.

1. הכנת תרחיף תא להקלדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש μl 1 לולאה חד פעמית סטרילית, לקחת תנופה קטנה של תרבות הטהורה הלילה הטרי של pneumococci גדל על אגר דם סוס לא סלקטיבי מוצק ולחסן 100 μl לב עירוי מרק (HI). ההשעיה צריכה להיראות רק בעליל עכור. בעדינות להתסיס את הצינור לemulsify. הערה: מדיה אחר כגון מרק מוח לב עירוי יכולה להיות גם מתאימה. תוספת של סרום (למשל ריכוז סופי של 10% (v / v) בסרום של סוס) ודגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעות לפני השימוש יכולה לשמש כדי לשפר את התגובה. </li></ol> 2. בבדיקה צפיפות של השעיה תא גם ההשעיה התא מוכנה בשלב 1.1 תשמש כביקורת השלילית, וצריכה להיבדק לצפיפות תאים לפני הוספה סרה ההקלדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות לולאת μl 1, להעביר טיפת הבידוד מוכן בשלב 1.1 על גלאסשקופיות מיקרוסקופ ים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים, במקום coverslip מעגלי קטן על ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרת שלב לעומת זאת, להתבונן בהכנה מיקרוסקופית בהגדלה 400X, כדי לבדוק את הצפיפות של ההשעיה (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הבידוד הוא כבד מדי (איור 2 א), להוסיף עוד מרק להשעית התא נעשתה בשלב 1.1 לדלל אותו. בעדינות מערבב שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הבידוד הוא קל מדי, לדוגמא, יש &lt;50 תאים גלויים בתחום המיקרוסקופי (איור 2), להוסיף עוד חיידקים להכנת ההשעיה התא נעשתה בשלב 1.1 ולערבב בעדינות. הערה: עם ניסיון, הצפיפות של ההשעיה התא יכולה להישפט על ידי רועד ומחזיק עד האור, שבו הוא אמור להופיע להיות פשוט בעליל עכור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.3 עד מספר מתאים של תאים נראים בשדה המיקרוסקופי. הערה: שקופיות זכוכית וcoverslשב&quot;ס מהווה סכנה חדה. לאחר שימוש, שקופיות וcoverslips מזוהמים עם חומר זיהומיות וחייבים להיות מסולקת למכל חד Biohazard. </li></ol> 3. הקלדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ~ μl 1 של הבידוד מוכן (למשל באמצעות μl לולאה 1) על גבי שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. מחק את הלולאה לתוך המכל החד Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה (loopful μl 1) של נסיוב בטמפרטורת חדר לשקופית ומערבבים שני טיפות היטב עם הלולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים, במקום coverslip מעגלי קטן על ההשעיה, נזהר שלא לגעת בטיפה. מקום coverslip על ההשעיה מייד לאחר התוספת של נסיובי כדי למנוע את הנוזל בשקופית מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ, לבחון את ההשעיה תחת שלב בניגוד עם הגדלה 400X. תגובת Quellung שלילית נצפתה כאשר ניתן לראות מעט או ללא &quot;נפיחות&quot; של תאי דלקת ריאות ב40הגדלת 0x, בדומה למה שרואה בהשעית תא pneumococcal ללא נסיובי הוסיפה (בקרה שלילית). תגובת Quellung חיובית נצפתה כאשר התאים נראים מוגדלים או &#39;נפוח&#39; וגלויים יותר בהשוואה לתאים בביקורת השלילית. הערה: תגובות חד משמעיות צריכים להיחקר יותר, למשל על ידי בדיקת התגובה לאחר דגירה דקות 5-10 בטמפרטורת חדר, או על ידי חזרה על התגובה עם יותר נסיוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל serotyping pneumococcal עם בדיקות רצופות של בריכות נסיובי בודדות עד תגובה חיובית הוא ציין. לחלופין, ניתן ליישם בברכות &#39;סיבובים&#39; בהתאם לשכיחות המקומית של קפסיד. הערה: בדיקה ב&#39;סיבובים &#39;מבטיחה כי הבריכות המכילות נוגדנים לזנים אל הנפוצים ביותר נבדקות ראשונה, מזעור מאמץ ועלות. בדיקה מקבילה של כמה בריכות מספקת גם בקרות שליליות נוספות, שיכול להיות שימושי בinterpretation. אם כל הבריכות ב&#39;סיבוב &#39;מסוים הן שליליות, לבדוק את הבודד בסיבובים הבאים של בריכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הבודד באמצעות הסוג המתאים או נסיוב קבוצה בתוך הבריכה תגובתי. במידת צורך, להשתמש בנסיובי גורם להבדיל סרוטיפ נוסף. הערה: מפתחות לנסיובי pneumococcal סופקו על ידי היצרן המשמשים בבחירת בריכה המתאימה, סוג, קבוצה או נסיובי גורם והפרשנות של תוצאות (כולל כל תגובות צולבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תוצאות שליליות שהושגו עם כל הבריכות, לבדוק את הבודד עם מגיב Omniserum (מכיל נוגדנים נגד 91 קפסיד 21). אם תגובת Quellung חיובית עדיין לא נצפתה כאשר בדיקת ריאות בודד עם מגיב Omniserum, זה יכול להיות בגלל הבודד מביע כמוסה קטנה או לא, או שנוגדנים נגד סרוטיפ אינם מיוצגים בOmniserum. הקטגוריה האחרונה עשויה לכלול קפסיד חדשים. </li> &lt;/ Ol&gt;

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical%2C+genetic%2C+and+serological+characterization+of+two+capsule+subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+strains%3A+discovery+of+a+new+pneumococcal+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype.</a> J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Johnson, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+serotypes+causing+invasive+pneumococcal+disease+among+children+under+five%3A+the+pneumococcal+global+serotype+project%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project.</a> PLoS Med. 8, (2010).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+pneumococci+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 348, 271-272 (1996).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Austrian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quellung+reaction%2C+a+neglected+microbiologic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mt.+Sinai.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The quellung reaction, a neglected microbiologic technique.</a> Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).</li>
<li>Konradsen, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe.</a> Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).</li>
<li>Lovgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+international+external+quality+assurance+model+to+support+laboratory+investigation+of+Streptococcus+pneumoniae%2C+developed+for+the+SIREVA+project+in+Latin+America%2C+from%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).</li>
<li>Reasonover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+International+Circumpolar+Surveillance+interlaboratory+quality+control+program+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).</li>
<li>Hare, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDodgy+6As%26%2334%3B%3A+differentiating+pneumococcal+serotype+6C+from+6A+by+use+of+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">#34;Dodgy 6As&#34;: differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cpsA-cpsB+sequence+polymorphisms+and+serotype-%2Fgroup-specific+PCR+to+predict+51+Streptococcus+pneumoniae+capsular+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes.</a> J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).</li>
<li>Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Methods+for+the+Diagnosis+of+Meningitis+caused+by+Neisseria+meningitidis%2C+Streptococcus+pneumoniae%2C+and+Haemophilus+influenzae.+2nd+ed%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae.</a> Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).</li>
<li>Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene-technological+and+conventional+methods+in+the+identification+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).</li>
<li>SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Sorensen, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+pneumococci+by+using+12+pooled+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+to+pneumococcal+factor+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Key to pneumococcal factor antisera.</a> , (2013).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+antisera+for+in+vitro+diagnostic+use%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use.</a> , (2011).</li>
<li>Lund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+Pneumococcus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections.</a> Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).</li>
<li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%3A+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. 32, 165-179 (2013).</li>
<li>Vernet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-based+diagnosis+of+pneumococcal+pneumonia%3A+state+of+the+art+and+unmet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs.</a> Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).</li>
<li>Casewell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiences+in+the+use+of+commercial+antisera+for+the+capsular+typing+of+klebsiella+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species.</a> J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שלב קריטי בטכניקה זו הוא להבטיח תרבות טהורה משמשת להכנת ההשעיה יחד עם הוספת מספר מתאים של תאים חיידקיים למרק. יש לציין כי צמיחת מושבה ומורפולוגיה על צלחות אגר משתנים בין מבודד pneumococcal שונה. כמה לייצר מושבות יבשות ומחוספסות, שיכול להיות קשה לבחור את עם לולאה ולא emulsify גם במרק. מסיבה זו, ייתכן שתהיה צורך בתנופה גדולה יותר של חיידקים בעת הכנת ההשעיה התא. בכל מקרה, זוהי חובתו של תאים בודדים, ולא אגרגטים, ברורים בביקורת השלילית כל כך הגודל היחסי שלהם יכול להיות בהשוואה לתאים עם נסיובי הוסיפו. בנוסף, יותר מדי תאי חיידקים עלולים לגרום לתגובה שלילית כוזבת, שבו עודף של אנטיגן קופסית עשוי לעכב את תגובת Quellung 10. מסיבה זו, חשוב ליצור השעיה חיידקים עם צפיפות תאים מתאימה (איור 1). Susפנסיה יכולה להישמר במשך מספר חודשים על ידי התוספת של כמה טיפות של פורמלין המרוכז. זה מאפשר בדיקות אצווה קלים יותר וגם מעקר את מרק הפחתת הסיכון לזיהומים נרכש במעבדה, אם כי זה חייב להישקל מול סיכוני הבטיחות של פורמלין טיפול, שהוא רעיל ומאכל, מסרטנים, רגישות, ודליק. בנוסף, יש לנו ציינו כי חלק מבודד להראות תגובות חלשות יותר בנוכחות של פורמלין (מידע לא מוצג). תגובות Quellung נבחנות באמצעות מיקרוסקופ. השימוש בניגוד שלב משפר את הנראות של הקפסולה. בחלק מהמעבדות, התגובה היא שנצפו באמצעות נפט טבילה ב1,000 הגדלה X 14, 16. בנוסף, חלק ממעבדות משתמשות כתם דלפק (מתילן כחול) כדי לשפר את הנראות של תגובה חיובית 10, 16, 22 נוסף. השיטה המוצגת כאן מוצגת ללא שמן-immersion ותחת הגדלה 400X 15, 17. שיטה זו היא מהירה, פשוט וקלה יחסית לקרוא 23. זה חשוב לשמור על נהלי בקרת איכות פנימית טובים כדי להבטיח את נהלי נסיובי ובדיקות הם בסדר. השתתפות בתכנית אבטחת איכות חיצונית היא לעתים קרובות מועילה. מגבלה העיקרית של תגובת Quellung לserotyping של pneumococci היא העלות הגבוהה של נסיובי הנדרש. עם זאת, זה ממוזער בפרוטוקול לעיל בשל הכמות הקטנה של נסיוב המשמשת לכל תגובה. בכמה שיטות אחרות כבר תיארו לserotyping pneumococci 23, 24. עם זאת, Quellung נשאר תקן הזהב ופיתוח השיטות חדשות דורש סטנדרטיזציה נגד תגובת Quellung 23. שימוש נסיובי המתאים, תגובת Quellung יכולה גם להיות מנוצל כדי לזהות ולהקליד כובעים אחריםULE ייצור חיידקים 25. תגובת Quellung היא סייע באפיון של זנים אל ריאות הנוכחיות ועתידית, כמו גם מתן מידע על יעילות חיסון ואת ההשפעה ארוך הטווח של חיסון בכרכרה ומחלות.

pneumoniae Streptococcus (pneumococcus) הוא אחראי למותם של 800,000 ילדים מוערכים מתחת לגיל חמש בשנה, עם הנטל של מחלה נופל בעיקר במדינות משאבים לעניים 1. מחלות דלקת ריאות טווח חומרה מזיהומים מקומיים כגון תקשורת אזנים חריפה לזיהומים מסכנים חיים קשים כגון אלח דם, דלקת קרום המוח ודלקת ריאות 2. מעל 90 קפסיד קופסית של pneumococci תוארו 3, 4. חיסוני pneumococcal הנוכחיים מספקים הגנה מפני הזנים אל כי הם אחראים למרבית מחלות 5 פולשנית, 6. עם זאת, שימוש נרחב בחיסונים נקשר עם החלפת קפסיד הכלולים בחיסון מזני nonvaccine, הן בכרכרה האף והלוע ומחלה פולשנית 7, 8. זה מדגיש את החשיבות של serotyping לאפידמיולוגייםמעקב והשפעת חיסון לטווח ארוך לומדים 9. שיטת תקן זהב עבור הקלדת pneumococcal היא מבחן התגובה קופסית, המכונה תגובת Quellung, שתואר לראשונה על ידי נויפלד ב1902 (ראה 10 אוסטריים). רמה גבוהה של התאמה נמצאה בין מעבדות, ובין תגובת Quellung ושיטות serotyping האחרות 11-13. יש כמה וריאציות של תגובת Quellung 10, 14-16. השיטה המתוארת כאן אינה דורשת שימוש בכתם דלפק או עדשת טבילת שמן, אלא ירידה של דגימה מוכנה היא מעורבת עם סרום ההקלדה ובדקה באופן מיידי בהגדלה 400X. תגובת Quellung מבוצעת בדרך כלל באמצעות נסיובי זמין מסחרי. השיטה המתוארת כאן משתמשת בפחות נסיובי לעומת שיטות אחרות 16, 17, מה שהופך את זה יותר חסכוני. ברגע שIsolאכלתי מזוהה pneumococcus, הוא נבדק ברצף עם בריכות נסיובי עד תגובה חיובית הוא ציין. כל נסיוב בריכה מכיל תערובות שונות של נסיובי הועלו נגד 91 קפסיד pneumococcal 18. ברגע שהברכה הוקמה, סוג הפרט ונסיובי קבוצה שנכללים בבריכת התגובה נבדקים בנפרד ברצף. נסיובי סוג בדרך כלל מגיב עם סרוטיפ אחת (לדוגמא סוג נסיוב 1 מגיב עם סרוטיפ 1), ואילו נסיובי הקבוצה להגיב בכל קפסיד בקבוצה מסוימת (לדוגמא: קבוצת 22 נסיוב מגיב עם קפסיד 22F ו22A). הזנים אל חלק בתוך קבוצות נבדלים נוסף באמצעות נסיובי גורם (למשל סרוטיפ 22F מגיב עם 22b גורם, אבל לא 22c). במקרה זה בדיקה היא המשיכה עם כל נסיובי הגורם הרלוונטי עד סרוטיפ נקבע 19, 20. תגובת Quellung היא פשוטה ומהירה 14 וניתן לבצעו בכל ליטרaboratory כי הוא מצויד במיקרוסקופ באיכות טוב וסט מתאים של נסיובי.

<table><tbody><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td></td><td><a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> הביאו את כל האנטיסרות לטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>ב-Pneumococcus (Omni) antiserum</td><td>SSI Diagnostica</td><td>2438</td><td>הביאו את כל האנטיסרה לטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DML</td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון חד פעמיות מכוילות 1 ומיקרו; l</td><td>צלחות קופאן</td><td>CD175S01</td><td></td></tr><tr><td>אגר דם סוס (HBA) Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td><a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au/</a> הביאו לטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>מרק עירוי לב (HI)</td><td>יחידת הכנת מדיה (MPU), אוניברסיטת מלבורן</td><td>40HIN</td><td>הביאו לטמפרטורת החדר לפני השימוש</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית 76 מ"מ x 26 מ"מ</td><td>Lomb Scientific</td><td>7101</td><td>סכנה חדה: השלך למיכל חד</td></tr> ביולוגי <tr><td>כיסויי זכוכית עגולים</td><td>NeuVitro</td><td>GG-5</td><td></td></tr> <tr><td>* למעט האנטיסרה, ניתן לרכוש את כל שאר החומרים מספקים חלופיים</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>* צלחות שהוכנו מדם כבשים מפורק מתאימות אך לוחות דם שהוכנו מדם מצויט או דם אנושי אינם מתאימים</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קופסית serotyping של<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת quellung

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

ישנם מעל 90 קפסיד שונים קופסית של Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). כמו גם להיות כלי להבנת האפידמיולוגיה pneumococcal, serotyping קופסית יכול לספק מידע שימושי למחקרי יעילות חיסון והשפעה. תגובת Quellung היא שיטת תקן זהב עבור serotyping קופסית ריאות. השיטה כרוכה בבדיקת השעיה תא pneumococcal עם נסיובי נקווה וספציפי המכוונים נגד פוליסכריד קופסית. תגובות נוגדן אנטיגן הם נצפו במיקרוסקופ. יש הפרוטוקול שלושה שלבים עיקריים: 1) הכנה של השעיה תא חיידק, 2) ערבוב של תאים ונסיובי בשקופית זכוכית, ו 3) קריאת תגובת Quellung באמצעות מיקרוסקופ. תגובת Quellung היא פשוטה למדי לביצוע ויכולה להיות מיושמת בכל מקום במיקרוסקופ ונסיובי מתאים זמינים.

<html> תגובת Quellung חיובית מתרחשת כאשר נוגדן ספציפי לסוג נקשר לכמוסה של pneumococcus, מה שמוביל לשינוי במקדם השבירה שלה 10. כאשר מתחת למיקרוסקופ, החיידקים מופיעים &#39;נפוחים&#39; וגלוי יותר 14. איור 1A מראה תאי דלקת ריאות במרק HI. כאשר אנטי סרום ספציפי לסוג נוסף להשעית החיידקים, pneumococci מופיע &#39;נפוח&#39;, שבירה ומעוגלת יותר (איור 1). תאי חיידקיים רבים מדי הוסיפו למרק עלולים לגרום להצטברות של תאים או תגובה שלילית כוזבת. איור 2 מראה inocula של תאי דלקת ריאות במרק HI כי הם &#39;כבדים מדי&#39; (איור 2 א) או &#39;קל מדי&#39; (איור 2). &quot;Src =&quot; 08fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. תגובת Quellung שלילית וחיובית. תכשירים pneumococcal 9V סרוטיפ לבודד ללא נסיוב (1A) ועם קבוצת 9 נסיוב (1B), נתפסו בהגדלה 400X. זה האחרון מציג את &quot;נפיחות&quot; ועיגול של תאים חיידקיים לראות בדרך כלל בתגובת Quellung חיובית. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2.jpg" /> איור 2. כבד מדי וקל מדי inocula. הכנות של מתלי pneumococcal סלולריים, כי הם כבדים מדי (2A) או בהיר מדי (2B), כאשר הוא מוצג תחת הגדלה 400X.

תגובת Quellung היא טכניקת תקן זהב עבור serotyping Streptococcus pneumoniae. טכניקה זו מנצלת מיקרוסקופ ונסיובי pneumococcal הספציפי ומשמשת בדרך כלל התייחסות ומעבדות מחקר ברחבי העולם.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש תגובת Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טיפוס קפסולרי (capsular stereotyping) של streptococcus pneumoniae או הפנומוקוק, באמצעות תגובת השקיעה (quelling reaction). זאת מושג תחילה על ידי ה接種 של heart infusion broth בתרבית טהורה וטרייה של פנומוקוקים שגודלה במשך לילה.בשלב הבא, מוסיפים נסיוב אנטיסרי בנפח שווה על גבי הפסלורה. בשלב הסופי, מערבבים את שתי הטיפות ומניחים כיסוי זכוכית מעל התוך. לבסוף, ניתן לבחון את התוך תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבחין בתגובת Quellung ריאתית חיובית או שלילית.שיטה זו מדגימה את שיטת gold standard לזיהוי הנוכחות של syp בחיידקי פנומוקוקים. השיטה פשוטה, קלה לביצוע וקלה לפירוש. הדגמה חזותית של שיטה זו היא חשובה, שכן אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו עשויים להתקשות לזהות מהו צפיפות תאים מתאימה לביצוע מבחן qualm.התחילו בשימוש בלולאה סטרילית חד-פעמית של מיקרוליטר אחד כדי לקבל דגימה קטנה של תרבית טהורה וטרייה של פניומוקוקים (pneumococci) שגודלה באופן בן לילה על מצע אגר דם סוס לא סלקטיבי; זריעו את הפניומוקוקים לתוך 100 µL של מרק עיכור לב (heart infusion broth). התרחיף צריך להיראות עכור באופן גלוי; נערערו בעדינות את המבחנה כדי להמיס את תמיסת התאים. השתמשו בלולאה חדשה של מיקרוליטר אחד כדי להעביר טיפה מהתמיסא הזרועה על פלטה של מיקרוסקופ זכוכית.בשלב הבא, הניחו כיסוי זכוכית מעגלי קטן מעל התרחוף ובדקו את צפיפות התרחוף תחת מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast) בהגדלה של 400. אם האינוקולום (inoculum) סמיך מדי, דללו את תרחוף התאים בעזרת תרבילי צח (broth) נוסף וערבבו בעדינות את התאים שוב; אם האינוקולום דליל מדי, למשל אם נראים פחות מ-50 תאים, הוסיפו חיידקים נוספים לתרחוף התאים וערבבו שוב בעדינות.עם ניסיון, ניתן להעריך את צפיפות תרחיף התאים על ידי ניעור והחזקת התרחיף מול האור, כאשר הוא אמור להיראות עכור באופן גלוי למשך רגע. בבדיקה תחת המיקרוסקופ, תמיסת התאים צריכה להיות בצפיפות זו.לאחר השגת הדילול האופטימלי של התאי הבקטריאליים, העבירו כ-1 µL מהאינוקולום אל על גבי זכוכית של מיקרוסקופ. השלימו את הפעולה. באמצעות לולאה חדשה, הוסיפו נפח שווה של נוזל בטמפרטורת החדר.טפטפו אנטיסרום על העגלה וערבבו היטב את שתי הטיפות. בעזרת הלולאה, הניחו מיד כיסוי זכוכית קטן על התו suspension, תוך הקפדה לא לגעת בטיפה עם הפינצטה. לאחר מכן, בחנו את התו suspension תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast) כפי שהודגם זה עתה.תגובת Quellung שלילית נצפית כאשר נצפה נפיחות מועטה או אפס של תאי הפנומוקוקים. בדומה לבקרת השלילה, תרחיף תאי פנומוקוקים ללא הוספת אנטי-סרומים. תגובת Quellung חיובית מתרחשת כאשר נוגדן ספציפי לסוג נקשר לקפסולה של הפנומוקוק, מה שמוביל לשינוי במקדם השבירה שלו.בבדיקה תחת מיקרוסקופ ניגוד מופע (phase contrast), החיידקים נראים נפוחים ובולטים יותר. זכרו שבמהלך ביצוע הליך זה אתם למעשה עובדים עם מיקרואורגניזמים חיים. מסיבה זו, עליכם להיזהר ולהקפיד על נהלי מעבדה תקינים, ללבוש ביגוד מגן, להשתמש בציוד המעבדה המתאים, ולהשליך את כל הציוד והריאגנטים בסוף התהליך בצורה בטוחה.לאחר שהטכניקה תהפוך לשגורה, ניתן לבצעה בערך ב-10 דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בהליך זה, יהיה לכם מושג טוב כיצד לבצע סרטיפיקציה (serotyping) של פנומוקוק באמצעות תגובת Quellung. טכניקה זו חשובה להבנת האפידמיולוגיה של הפנומוקוק, הן בנשאות של הנזיל והלוע והן במחלה פולשנית.

capsular-serotyping-streptococcus-pneumoniae-using-quellung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה יעילה כדי להעריך את פני חשיפה של חלבונים leptospiral מתואר. השיטה היא תוכננה במיוחד כדי למנוע שיבוש של הממברנה החיצונית של התאים leptospiral שביר. טכניקה זו דורשת עבודה של בקרות שלילי מספר להעריך את היושרה של הממברנה החיצונית הספציפיות של תגובת הנוגדנים.

חיסונית פלואורסצנציה Assay של משטח חשוף חלבונים Leptospiral

אנו מתארים זמנית PCR לזיהוי מהיר של סלמונלה enterica serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium. Serovars סלמונלה מסוימים ניתן לזהות על ידי מיקוד זמנית PCR לגנים רצפים ייחודיים אשכול O-האנטיגן ביוסינתזה ו flagellin של serovar נתון. Serovar מוקצה אז סלמונלה לבודד המבוססת על הופעתו של, amplicons גודל מסוים (מוצר PCR) המתאים אלל היעד.

Allelotyping PCR לזיהוי סלמונלה enterica Serovars enteritidis, הדר, היידלברג, ו Typhimurium

קולוניזציה של nasopharynx מורין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת החילוץ הבא של תאים חסידיים או מגויסים מתואר. טכניקה זו כרוכה בשטיפת nasopharynx ואיסוף של הנוזל דרך nares והוא מסתגל לקריאות שונות, כולל כימות תאים דיפרנציאלי וניתוח של ביטוי mRNA באתרו.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

אנו מדגימים בדיקת PCR מולטיפלקס פשוטה לסינון והקלדה מהירים של כרומוזום קלטת סטפילוקוקלית (SCCmec) סוגים I-V עבור סטפילוקוקוס זהוב עמיד למתיצילין, ומספקים כמה מהשלבים החיוניים והניואנסים הפרוצדורליים שהופכים אותה למוצלחת בהתאמת בדיקה זו למעבדות בודדות.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Streptococcus pneumoniae יוצר נגעים מיקרוסקופיים נפרדים שאינם מוגלתיים בלב. מתואר הפרוטוקול למודל עכברי של היווצרות מיקרו-נגעים לבביים. ניתנת הדרכה על הדמיית מיקרו-נגעים באמצעות מיקרוסקופיה, הבחנה בין מיקרו-נגעים מוקדמים ומאוחרים, ושיטות לאיתור שיפוץ לב בלבבות של בעלי חיים מחלימים.

ויזואליזציה של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; בתוך Microlesions הלב וRemodeling לב לאחר

שיטת ההרג הזה opsonophagocytic משמש כדי להשוות את היכולת של תאים חיסוניים phagocytic להגיב ולהרוג חיידקים בהתבסס על טיפולים שונים ו/או תנאים. באופן קלאסי, assay הזה משמש תקן זהב להערכת אפקטור פונקציות של נוגדנים שהועלו נגד חיידק בשם opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

כאן אנו מתארים זן סרוטיפ 1 של S. pneumoniae serotype 1 519/43 שניתן להנדס גנטית באמצעות יכולתו לרכוש באופן טבעי DNA ופלסמיד מתאבד. כהוכחה עקרונית נוצרה מוטציה איזוגנית בגן הפנאומוליזין (ply).

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

בזיהום Mycoplasma pneumoniae, בדיקות סרולוגיות יכולות להניב תוצאות טובות, אך עם ספציפיות נמוכה בגלל תגובה צולבת אימונולוגית. ה- ELISA ללכידת אנטיגן פנימית, המתוארת במאמר זה, מבטיחה ספציפיות גבוהה של מינים והוכחה כבדיקת סינון אמינה לאבחון מדויק של M. pneumoniae.

בדיקת חיסון הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן לזיהוי ספציפי של דלקת ריאות מיקופלסמה

למדו לבצע סרוטיפינג קפסולרי של Streptococcus pneumoniae באמצעות תגובת Quellung. שיטה זו, תקן הזהב במיקרוביולוגיה קלינית, מאפשרת זיהוי סרוטיפים בכ-10 דקות תחת מיקרוסקופ פאזה קונטרסט.

קופסית Serotyping של

גלה סרטונים נוספים