מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי
19 בדצמבר 2013
מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד תגובות רגישות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים. הדבר מבוצע תחילה על ידי הנחת בעלי החיים על רצפת רשתית ומתן זמן להתרגלו כאשר הם מוכנים. קצה פוליפרופילן מופעל על הצד התחתון של כף הרגל האחורית, והלחץ מוגבר בהדרגה.
כאשר נצפית התגובה ההתנהגותית המתאימה, הגירוי מוסר. לאחר איסוף ערכי הבסיס, בעלי החיים מקבלים התערבות ניסיונית לפני המשך הבדיקות. לבסוף, מושווים שינויים בספי תגובת נסיגת כף הרגל האחורית בין קבוצות הטיפול כדי לקבוע את השפעת טיפול מסוים על שינויים ברגישות מגע ללחץ.
כאב הוא מרכיב מרכזי בדלקת. חשוב למדוד ולאפיין כאב בהקשרים שונים. שיטה פשוטה יחסית זו להערכת כאב ניתנת ליישום במודלים רבים ושונים של דלקת.
את הפרוצדורה תדגים טיאנה, טכנאית מחקר במעבדה שלי, מדיסון מאק, שהייתה מעורבת בעבודה זו כסטודנטית לתואר ראשון, ואקילה סייקס, סטודנטית לתואר ראשון במעבדה שלי. נתחיל בהכנת מכשיר הבדיקה כדי לאפשר גישה קלה לכפות הרגליים האחוריות.
הניחו תאי בידוד בודדים על גבי רצפת רשת. רצפת הרשת צריכה להיות בגובה נוח ועל משטח יציב. לאחר מכן, הניחו את מכשיר Von Frey האלקטרוני על גבי משטח העבודה.
יש לוודא שהגשושית והכבל מחוברים כראוי ליחידת התצוגה ולהדליק את המכשיר במצב הגדרה (setup mode). יש לאפס את התצוגה ולהניח בעדינות את משקולת הבדיקה המסופקת על קונוס גשושית ה-Von Frey. רשמו את ערך התצוגה וחזרו על הליך זה שוב בסיום הבדיקה; אם קיים פער בין שני הערכים, ייתכן שיהיה צורך לכייל את המכשיר מחדש.
בחרו טיפ פוליפרופילן בגודל המתאים לרקמה לבדיקה. טיפים קשיחים מתאימים לרקמה פחות רגישה ועמידה יותר של כף הרגל האחורית. הרכיבו בעדינות את הטיפ על קונוס הגשש.
כעת עברו ממצב הגדרה (setup mode) למצב פעולה (operation mode). פעולה זו תציג את הלחץ המקסימלי המופעל כאשר הגשוש נסוג. נדרשים שני חוקרים כדי למדוד את ספי תגובת הנסיגה של כף הרגל האחורית.
אחד להפעלת המכשיר וביצוע המדידות, ואחר לרישום המדידות הללו, וזאת כדי להפחית הטיות. החוקר המפעיל את ה-anesthesi TER צריך להיות מסומך (blinded) לגבי הטיפולים וכן לגבי ערכי סף הנסיגה הרשומים. יתרה מכך, כדי להבטיח עקביות בין המדידות, אותו אדם צריך לרשום את כל ערכי הבסיס וערכי סף הנסיגה.
48 שעות לפני הטיפול, נרשמות המדידות הראשונות של קו הבסיס. הנח חומר סופג מתחת למעמד כדי לאסוף את הפסולת המופרשת. לאחר התקנת הראש ואיפוס הגשושית, על החוקר המבצע את המדידות להניח את העכברים בתאים נפרדים.
כסו את התאים במכסים מחוררים והניחו חפץ כבד מעליהם. כדי למנוע מהעכברים לברוח, אפשרו להם להתרגל לתא במשך 15 דקות לפני ההמשך. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בטכניקה זו יתקשו ביישום הדרגתי של לחץ מוגבר וביצירת עקביות פנימית במדידותיהם; תרגול הוא חיוני להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
כאשר הדבר מוכן, השתמש בשתי ידיים כדי להרים את הגשוש באיטיות ולגרות את כרית כף הרגל של אחת הרגליים האחוריות, השמאלית או הימנית. הגבר את הלחץ בהדרגה עד להופעת התנהגות נוציצפטיבית. התנהגויות אלו מזוהות על ידי הרחקה של כף הרגל האחורית, ליקוק של כף הרגל האחורית, או קפיצות של כף הרגל.
הנח את החוקר השני לרשום את הלחץ שעורר את ההתנהגות שנצפתה. במהלך המדידה, מומלץ לעודד את העכבר להישאר ללא תנועה על ידי הנחת פלטת מזון ממש מחוץ לתא או הפקת רעש קל, כגון נקישה עדינה, לפני ביצוע המדידה. המשך לעכבר הבא עד שכל העכברים נבדקו פעם אחת, וחזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות.
לאחר איסוף חמישה ערכי בסיס, חשבו ממוצע עבור כל עכבר. חזרו על מדידות הבסיס לאחר 24 שעות והשתמשו בערכים אלה כדי לחשב ממוצע נוסף. כדי להבטיח תגובות בסיס עקביות בכל העכברים, הסירו בעלי חיים עם סף נסיגה ממוצע בבסיס הנמוך מ-3.5 grams או עם ספי בסיס הנבדלים בשני grams או יותר.
לבסוף, חלקו את העכברים לקבוצות טיפול נפרדות כך שממוצע בסיס הסף למשיכה של כל קבוצה יהיה דומה ככל האפשר. במקרה זה, ספי משיכה נמדדו לאחר הזרקת הרעל לכף הרגל האחורית, ROS raca. עכברים שקיבלו תמיסת סליין כביקורת הראו שינוי מועט בהשוואה לבסיס בכל נקודות הזמן.
נקודות שנבדקו הראו כי התגובות הנוציספטיביות בעכברים שעברו טיפול נשמרו בבירור עד שש שעות. בנוסף, בצקת רקמה, המאפיינת דלקת, הייתה ניכרת בכפות הרגליים האחוריות שטופלו ברעל, אך לא באלו שטופלו בתמיסת סליין. שינויים ברגישות למגע שגרם הרעל לוו בהגעה של נויטרופילים פי כמעט 1000.
בהשוואה לכפות רגליים אחוריות שטופלו בתמיסת סליין, תאי המסט הפלנטריים ברקמת כף הרגל האחורית היו במינם שלמים או הראו דגרנולציה קלה. לעומת זאת, בכפות רגליים אחוריות מזדווגות נצפתה דגרנולציה מתונה ונרחבת של 15% עד 20% מתאי המסט. ניתן להתאים טכניקה זו להערכת רגישות מכנית או מגעית במגוון רחב של רקמות מלבד כף הרגל האחורית.
לפיכך, ניתן לשלב טכניקה זו במודלים רבים ושונים של דלקת וכאב במכרסמים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה למדידת תגובות נוציצפטיביות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מדידות von Frey אלקטרוניות. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של שינויים בספי רפלקס נסיגה מכני לפני ואחרי התערבויות דלקתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- הערכה התנהגותית
- מודלים של דלקת
רקע
- מדידת כאב היא קריטית להבנת דלקת.
- מכשיר von Frey אלקטרוני מציע יתרונות על פני שיטות קלאסיות.
- מדידה מדויקת של ספי תגובת נסיגה חיונית לשחזור התוצאות.
- ניתן להתאים שיטה זו למודלים שונים של מכרסמים.
מטרת המחקר
- להערכת רגישות מכנית בתגובה לגירויי לחץ.
- להערכת השפעות של טיפולים על התנהגות נוציצפטיבית.
- לביסוס שיטה אמינה להערכת כאב במחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרגלה של עכברים על רצפת רשת מתכת.
- הפעלת לחץ הדרגתית באמצעות טיפ פוליפרופילן.
- תיעוד של ספי רף נסיגה על ידי שני חוקרים מסוככים.
- השוואה בין מדידות הבסיס למדידות לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- נצפו שינויים משמעותיים בספי סף הנסיגה לאחר הטיפול.
- הדלקת אופיינה בבצקת רקמות ובזרימה של נויטרופילים.
- דה-גרנולציה של תאי מאסט השתנתה בין קבוצות הטיפול.
- השיטה הפגינה התאמה לרקמות שונות.
מסקנות
- שיטת von Frey האלקטרונית יעילה להערכת כאב במכרסמים.
- טכניקה זו יכולה להגביר את ההבנה של מנגנוני כאב דלקתי.
- היא מספקת בסיס למחקרי עתיד על כאב ויעילות טיפולית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתיתי לדרג ניהולי
הערכת שינויים ברגישות למגע במודלים של מכרסמים מספקת נתונים קריטיים בשלב מוקדם לצורך תיקוף של מטרות אנלגזיות והפחתת סיכונים מכניסטיים בפיתוח תרפיה לכאב. שיטת von Frey האלקטרונית מאפשרת מדידה כמותית ומהירה של ספי סף לנסיגה מכנית, ובכך תומכת בהערכה פרה-קלינית הדירה של מודלים לכאב דלקתי וכאב נוירופתי. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במעורבות המטרה ובאתילת הטיפול לפני קידום תרכובות לשלבי מחקר מאוחרים יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולים נוציצפטיביים ומנגנוני ויסות של כאב.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מדדים כמותיים ומבוקרי-פנימיים של רגישות מגע על פני קבוצות טיפול שונות.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות השוואה אובייקטיבית בין ספי רגישות למגע בנקודת ההתחלה ולאחר ההתערבות, לצורך הערכת ויסות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקה המשכית על ידי קביעת מדידות בסיס סטנדרטיות של רגישות תחושתית.
- שחזוריות: מאפשרת מדידות עקביות וחוזרות בפרקי זמן קצרים, ובכך תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובהשוואה בין קבוצות.
- מדרגיות: מאפשרת מספר מדידות לכל נבדק, מה שמגביר את התפוקה ואת המהימנות עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אלודניה מכנית המושרה על ידי דלקת, בהתאמה לפנוטיפים קליניים של כאב במצבים דלקתיים ונוירופתיים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלבי הגילוי למסלולי העבודה הפרה-קליניים על ידי אספקת תוצאות מדידות של רגישות לכאב הרלוונטיות מבחינה מכניסטית.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות go/no-go בהתבסס על שינויים הניתנים לשחזור בספי סף הנסיגה בעקבות התערבויות ניסיוניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת von Frey האלקטרונית משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תרכובות מווסתות כאב.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מדידת תגובות נוציצפטיביות ללחץ מכני כמדד תפקודי למעורבות המטרה.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, החיוניים להערכה אמינה של תרכובות במודלים של כאב.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מדויקות של סף נסיגה ויכולת השוואה סטטיסטית בין תנאי הבסיס לתנאי הטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני באמצעות תוצאות רגישות מכנית רלוונטיות למחלה במודלים של דלקת.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פלטפורמה הניתנית לשימוש חוזר במגוון מודלים של כאב דלקתי ונוירופתי, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בוויסות נתיבי כאב.
- ערך תפעולי: מספק מדידות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של רגישות מגע עם שונות טכנית מינימלית.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go), ובכך מגביר את יעילות ההון ומפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב חוסר יעילות המתווכת על ידי המטרה.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף תרכובות מבוסס סיכון על בסיס השפעות כמותיות על ספי סحب מכני.
שיקולי יישום
- נדרש אימון בתצפית התנהגותית ובזיהוי תגובות נוציספטיביות כדי להבטיח עקביות במדידות.
- תלוי במכשיר von Frey אלקטרוני מכויל ובבחירה נכונה של חוד polypropylene המתאים לרקמות כף הרגל האחורית.
- מחייב ביצוע עיוורון (blinding) של המפעילים והרושמים לגבי תנאי הטיפול, כדי למזער הטיות ברישום הסף.
- כולל קריטריוני החרגה המבוססים על שונות בסף הבסיס, כדי להבטיח הומוגניות של הקבוצות ושלמות הנתונים.
- מוגבל לתגובות התנהגותיות מדידות; מחייב נקודות קצה נוציספטיביות ברורות, כגון הרמת כף הרגל, ליקוק או קפיצה.
