מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי
December 19th, 2013
מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לא למדוד תגובות רגישות ללחץ מכני בכף האחורית של עכברים. זה מושג על ידי הנחת החיות תחילה על רצפת רשת תיל ומתן אפשרות להתרגל כשהן מוכנות. קצה פוליפרופילן מוחל על החלק התחתון של הכפה האחורית, והלחץ מוגבר בהדרגה.
כאשר מציינים את התגובה ההתנהגותית המתאימה, הגירוי נסוג. לאחר איסוף ערכי הבסיס, החיות מקבלות התערבות ניסיונית לפני בדיקות נוספות. בסופו של דבר, שינויים בסף הנסיגה של כפות הרגליים האחוריות מושווים בין קבוצות הטיפול כדי לקבוע את ההשפעה של טיפול מסוים על שינויים ברגישות המישוש ללחץ.
כאב הוא מרכיב קרדינלי של דלקת. חשוב למדוד ולאפיין כאב בהקשרים שונים. ניתן ליישם שיטה פשוטה יחסית זו של הערכת כאב על מודלים רבים ושונים של דלקת.
מי שתדגים את ההליך היא טיאנה אוב, טכנאית מחקר במעבדה שלי, מדיסון מאק, שהייתה מעורבת בעבודה זו כסטודנטית לתואר ראשון ואקילה סייקס. כרגע סטודנטית לתואר ראשון במעבדה שלי. התחל בהגדרת מכשיר הבדיקה לגישה נוחה לכפות האחוריות.
הניחו תאים בודדים על גבי רצפת רשת. רצפת הרשת צריכה להיות בגובה נוח ועל משטח יציב. לאחר מכן, הנח את מכשיר פון פריי האלקטרוני על הספסל.
ודא שהגשושית והכבל מחוברים כראוי ליחידת התצוגה והפעל את המכשיר במצב ההגדרה. הגדר את הקריאה לאפס והנח בעדינות את משקל הבדיקה שסופק על החרוט של בדיקת פון פריי. הקלט את הקריאה וחזור על הליך זה שוב בתום הבדיקה, אם יש אי התאמה בין שני הערכים, ייתכן שיהיה צורך לכייל מחדש את המכשיר.
בחר קצה פוליפרופילן בגודל המתאים לרקמה לבדיקה. טיפים קשיחים עובדים היטב עבור רקמת כף הרגל האחורית הפחות רגישה והקשוחה יותר. הרכיב בעדינות את הקצה על חרוט הגשושית.
לאחר מכן עבור ממצב הגדרה למצב פעולה. זה יציג את הלחץ המרבי המופעל כאשר הגשושית נסוגה. יש צורך בשני חוקרים כדי למדוד את סף נסיגת הכפות האחוריות.
האחד, להפעיל את המכשיר ולבצע את המדידות, והשני לתעד את המדידות הללו על מנת להפחית את ההטיה. החוקר המפעיל את ה-TER המרדים צריך להיות עיוור לטיפולים כמו גם לערכי סף הנסיגה המתועדים. יתר על כן, כדי להבטיח עקביות בין המדידות, אותו אדם צריך לרשום את כל ערכי סף הבסיס והנסיגה.
48 שעות לפני הטיפול, נרשמת הסט הראשון של מדידות הבסיס. הנח חומר סופג מתחת למעמד כדי לאסוף פסולת מופרשת. לאחר הרכבת הקצה ואיפוס הגשושית, הנסיין המתעד את המדידות צריך למקם את העכברים בתאים בודדים.
מכסים את התאים במכסים מחוררים, ומניחים מעל חפץ כבד. כדי למנוע מהעכברים לברוח, אפשר לעכברים להתאקלם בתא למשך 15 דקות לפני שתמשיך. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו עם יישום הדרגתי של לחץ מוגבר, ועם ביסוס עקביות פנימית עם המדידות שלהם, תרגול חיוני ליצירת תוצאות הניתנות לשחזור.
כשהוא מוכן, השתמש בשתי ידיים כדי להרים את הגשושית לאט ולעורר את כרית כף הרגל של הכף האחורית השמאלית או הימנית. הגדל את הלחץ בהדרגה עד שנצפית התנהגות נוסיספטיבית. אלה מזוהים על ידי נסיגת כפות אחוריות, ליקוק כפות אחוריות או לקפיצת כפות.
הנחו את החוקר השני לתעד את הלחץ שעורר את ההתנהגות שנצפתה. בזמן המדידה כדאי לעודד את העכבר להחזיק בשקט על ידי הנחת חיך מזון ממש מחוץ לחדר או השמעת רעש קל כגון הקשה עדינה לפני ביצוע המדידה. המשך לעכבר הבא עד שכל אחד מהם נבדק פעם אחת וחזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות.
לאחר איסוף חמישה ערכי בסיס, קבל ממוצע עבור כל עכבר. חזור על מדידות הבסיס 24 שעות לאחר מכן והשתמש בערכים אלה כדי לחשב ממוצע אחר. כדי להבטיח שלכל העכברים יש תגובות בסיס עקביות, אל תכלול בעלי חיים עם סף נסיגה ממוצע מתחת ל-3.5 גרם או עם סף בסיס שונה בשני גרם או יותר.
לבסוף, הקצה עכברים לקבוצות טיפול נפרדות כך שקו הבסיס הממוצע של כל אחד מהם יהיה דומה ככל האפשר כאן, ספי הנסיגה נמדדו לאחר כף הרגל האחורית, מתן הארס, ROS raca. בקרה מטופלת במי מלח. עכברים הראו שינוי מועט בהשוואה לקו הבסיס בכל הזמנים.
נקודות שנבדקו תגובות נוסיספטיביות בעכברים שטופלו נשמרו בבירור עד שש שעות. בנוסף, בצקת רקמות, האופיינית לדלקת, ניכרה בארס, אך לא בכפות האחוריות שטופלו במי מלח. שינויים שנגרמו על ידי ארס ברגישות המישוש לוו בזרם נויטרופילים של כמעט פי 1000.
בהשוואה לכפות הרגליים האחוריות שטופלו במי מלח בכפות שטופלו במי מלח, תאי הפיטום הפלנטרי ברקמת הכף האחורית היו שלמים ברובם או הראו דה-גרנולציה קלה. לעומת זאת, בחלק האחורי המזווג הראה דגרנולציה מתונה ונרחבת של 15 עד 20% של תאי פיטום. ניתן להתאים טכניקה זו להערכת רגישות מכנית או מישוש במגוון רחב של רקמות מלבד הכף האחורית.
לכן, ניתן לשלב טכניקה זו במודלים רבים ושונים של מכרסמים של דלקת וכאב.
סקירה
מאמר זה מציג שיטה למדידת תגובות נוציצפטיביות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מדידות פון פריי אלקטרוניות. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של שינויים בסף הנסיגה המכנית לפני ואחרי התערבויות דלקתיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- הערכה התנהגותית
- מודלי דלקת
רקע
- מדידת כאב חיונית להבנת הדלקת.
- מכשיר פון פריי אלקטרוני מציע יתרונות על פני שיטות קלאסיות.
- מדידה מדויקת של ספי רסיגה חיונית לשחזור.
- שיטה זו ניתנת להתאמה למודלי מכרסמים שונים.
מטרת המחקר
- להעריך את הרגישות המכנית בתגובה לגירויי לחץ.
- להעריך את השפעות הטיפולים על התנהגות נוציצפטיבית.
- לבסס שיטה אמינה להערכת כאב במחקר.
שיטות ששימשו
- הרגלה של עכברים על רצפת רשת תיל.
- יישום הדרגתי של לחץ באמצעות קצה פוליפרופילן.
- רישום של ספי רסיגה על ידי שני חוקרים מסווגים.
- השוואה של מדידות בסיסיות ומדידות לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- נצפו שינויים משמעותיים בספי רסיגה לאחר הטיפול.
- הדלקת התאפיינה בבצקת רקמות וזרם נויטרופילים.
- הפירוק של תאי גזע השתנה בין קבוצות הטיפול.
- השיטה הפגינה יכולת התאמה לרקמות שונות.
מסקנות
- שיטת פון פריי האלקטרונית יעילה להערכת כאב אצל מכרסמים.
- טכניקה זו יכולה לשפר את ההבנה של מנגנוני כאב דלקתיים.
- היא מספקת בסיס למחקרים עתידיים על כאב ויעילות הטיפול.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Assessing tactile sensitivity changes in rodent models provides critical early-phase data for analgesic target validation and mechanistic de-risking in pain therapeutics development. The electronic von Frey method enables rapid, quantitative measurement of mechanical withdrawal thresholds, supporting reproducible preclinical evaluation of inflammatory and neuropathic pain models. This approach enhances predictive confidence in target engagement and treatment efficacy before advancing compounds into later-stage studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to nociceptive pathways and pain modulation mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing quantifiable, internally controlled tactile sensitivity readouts across treatment groups.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage through objective comparison of baseline and post-intervention withdrawal thresholds to assess target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized baseline tactile sensitivity measurements.
- Reproducibility: Enables consistent, repeated measurements within short time periods, supporting assay standardization and cross-group comparability.
- Scalability: Allows multiple measurements per subject, increasing throughput and reliability for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models inflammation-induced mechanical allodynia, aligning with clinical pain phenotypes in inflammatory and neuropathic conditions.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing mechanistically relevant, quantifiable pain sensitivity outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on reproducible changes in withdrawal thresholds following experimental interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The electronic von Frey method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for pain-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring nociceptive responses to mechanical pressure as a functional readout of target engagement.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs essential for reliable compound evaluation in pain models.
- Analytics: Provides precise withdrawal threshold measurements and statistical comparability across baseline and treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through disease-relevant mechanical sensitivity outcomes in inflammation models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across multiple inflammatory and neuropathic pain models, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pain pathway modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible tactile sensitivity measurements with minimal technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhancing capital efficiency and reducing late-stage attrition due to lack of target-mediated efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on quantifiable effects on mechanical withdrawal thresholds.
Implementation Considerations
- Requires training in behavioral observation and nociceptive response identification to ensure measurement consistency.
- Dependent on calibrated electronic von Frey apparatus and appropriate polypropylene tip selection for hind paw tissue.
- Necessitates blinding of operators and recorders to treatment conditions to minimize bias in threshold recording.
- Involves exclusion criteria based on baseline threshold variability to ensure group homogeneity and data integrity.
- Limited to measurable behavioral responses; requires clear nociceptive endpoints such as paw withdrawal, licking, or jumping.
