Name: מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: למדו למדוד תגובות נוקיצפטיביות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מכשיר אלקטרוני פון פריי. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של סף הנסיגה לפני ואחרי התערבויות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R15 NS067536-01A1 (ל-DC) וקרן המחקר של מכללת מקאליסטר וולאס (ל-DC) תמכו במחקרים אלה. ספריית מכללת מקאליסטר תמכה בפרסום בגישה פתוחה של מאמר זה. בנוסף, אנו מודים לחברי מעבדת Chatterjea בהווה ובעבר על תמיכתם.

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת מקאליסטר (IACUC) אישרה את כל הפרוטוקולים. עכברים שוויצריים זכרים בני 8-12 שבועות ND4 שימשו לניסויים אלה.
1. הכנה והזרקה של ארס Bothrops jararaca
<ol>
	<li>זהירות: ארס B. jararaca רעיל. ללבוש כפפות, מסכה והגנה על העיניים בעת הטיפול באבקה והכנת תמיסות.</li>
	<li>יש לתת 45 מיקרוגרם/ק"ג ארס B. jararaca (משטר שנקבע על ידי ניסויים קודמים של תגובת מינון) או 0.9% מי מלח (10 מיקרוליטר) באמצעות הזרקה תוך-פלנטרית לשתי הכפות האחוריות באמצעות מזרקי אינסולין של 3/10 מ"ל עם 29 גרם x 1/2 במחטים. הערה: בהתאם לתכנון הניסוי, ניתן להזריק בנפרד פתרונות טיפול ובקרה לכל כף אחורית בהתאמה כדי לספק בקרות פנימיות בתוך כל נבדק.</li>
</ol>
2. התקנה ותפעול אלקטרוני של מכשירי פון פריי
<ol>
	<li>הנח את יחידת פון פריי האלקטרונית על מעמד הבדיקה. ודא שהגשושית והכבל מחוברים כראוי ליחידת התצוגה, והפעל את המכשיר. הגדר את הקריאה לאפס (0.00 גרם) במצב ההגדרה, והנח בעדינות את משקל הבדיקה שסופק (5.00 גרם) על החרוט של בדיקת פון פריי.</li>
	<li>רשום את הקריאה במחברת מעבדה, וחזור על הליך זה בסיום מפגש הבדיקה. אם יש פער גדול מ-0.20 גרם בין קריאות משקל הבדיקה שלך לפני ואחרי מפגש הבדיקה, או אם הקריאה משתנה לאחר הפעלת משקל הבדיקה, ייתכן שיהיה צורך בכיול מחדש של המכשיר (על ידי היצרן).</li>
	<li>כדי להעריך את סף הנסיגה של כף העכבר האחורית, השתמש בקצה הפוליפרופילן המתאים מבין אלה שסופקו עם הבדיקה. בחירת הטיפ תלויה ברקמה הנבדקת. טיפים קשיחים עובדים היטב עבור רקמת כף הרגל האחורית הפחות רגישה והקשוחה יותר, בעוד שקצוות גמישים למחצה עשויים להיות בחירה טובה יותר עבור אזור רך יותר כמו רכס איברי המין (Chatterjea, לא פורסם). הרכיב בעדינות את הקצה הנוקשה על חרוט הבדיקה.</li>
	<li>כדי להקליט את הלחץ המרבי המופעל, העבר את מצב ההפעלה מהגדרה לפעולה כך שהלחץ המרבי המופעל יירשם בתצוגה. במצב זה, קריאת הלחץ המקסימלית המופעלת תישמר על מסך התצוגה כאשר הגשושית נסוגה.</li>
</ol>
3. שיקולים כלליים להערכת סף משיכת כפות אחוריות
<ol>
	<li>באופן אידיאלי, יש צורך בשני חוקרים כדי למדוד את סף נסיגת הכף האחורית (רגישות מכנית) באמצעות מכשיר EVF - אחד להפעלת המכשיר וביצוע המדידות, ואחר לתמלל את המדידות המוקלטות ולטפל בעכברים.</li>
	<li>על מנת להפחית את ההטיה, החוקר המפעיל את המכשיר צריך להיות עיוור לטיפולים ולערכי סף הגמילה שנרשמו. יתר על כן, כדי להבטיח עקביות בין המדידות, אותו אדם צריך להעריך את כל ספי הנסיגה הבסיסיים והניסיוניים.</li>
	<li>בצע את כל המדידות בחדר שקט ומבוקר טמפרטורה, ובאותה שעה ביוםה-14.</li>
	<li>הנסיין המתעד את המדידות צריך למקם כל עכבר בתאים נפרדים של בית פולימתיל מתאקרילט (PMMA) מרובה יחידות המוגדר על מעמד רצפת רשת. מכסים את התאים במכסי PMMA מחוררים, ומניחים חפץ כבד מעל, כדי למנוע מעכברים לברוח. הנח חומר סופג מתחת למעמד כדי לספוג/לאסוף פסולת מופרשת. אפשר לעכברים להתאקלם במשך 15 דקות בתאים לפני הערכת סף הנסיגה הבסיסית או הניסיונית 6,7,10.</li>
	<li>הכפות האחוריות של העכברים צריכות להיות נגישות בקלות דרך פתחי רצפת הרשת; לכן, הניחו את מעמד רצפת הרשת בגובה נוח על עגלה עם בלמים, או על ספסל יציב הנגיש מכל הצדדים.</li>
	<li>במהלך המדידות, ייתכן שיהיה צורך להסיח את דעתם של עכברים באמצעות כדור מזון15 הממוקם ממש מחוץ לתא המדידה או רעש קל מאוד המופק על ידי הקשה או הפעלת עט לאורך רשת התיל של רצפת החדר לפני, אך לא במהלך, המדידה. זה גורם לעכבר להחזיק מעמד, מה שמאפשר לנסיין להתחיל לבצע מדידות ביתר קלות.</li>
</ol>
4. הערכת סף נסיגה של כפות אחוריות בסיסיות
<ol>
	<li>יש לבצע את הסט הראשון של מדידות הבסיס 48 שעות לפני מתן הטיפול. אפס את הגשושית בעת הרכבת הקצה הקשיח. בעזרת שתי ידיים, הרם את הגשושית לאט כדי לעורר את האמצע (אזור כרית כף הרגל) של הכף האחורית השמאלית או הימנית (אם שתי הכפות קיבלו את אותו טיפול).</li>
	<li>הגדל את הלחץ בהדרגה עד שנצפו התנהגויות תגובה נוסיספטיביות מוגדרות כגון נסיגת כפות אחוריות, ליקוק כפות אחוריות או קפיצת ארבע כפות6,10. הנחו את החוקר השני לתמלל את הלחץ שעורר את ההתנהגות הנצפית.</li>
	<li>מדוד את סף הנסיגה של העכבר הממוקם בתא הסמוך. המשך עד שתעריך את סף הנסיגה של כל עכבר פעם אחת. חזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות, כך שכל עכבר נמדד פי 5 כפי שתואר קודם לכן10.</li>
	<li>עבור כל עכבר, חשב את הערך החציוני של 5 המדידות, ולאחר מכן חשב כמה כל ערך חורג מהחציון. בחר 3 ערכים החורגים הכי פחות, וממוצע אותם כדי לקבל סף משיכה בסיסי כפי שתואר קודם לכן10. בהדגמה זו, המדידה תוקננה על ידי שימוש ב-3 מתוך 5 ערכים; בעוד שהמספרים הספציפיים של המדידות יכולים להשתנות בהתאם לתכנון הניסוי, חשוב לוודא שכל העכברים נדקרים מספר שווה של פעמים כדי להעריך את קווי הבסיס.</li>
	<li>חזור על המדידות הבסיסיות 24 שעות לאחר מכן. בצע 5 מדידות לכל עכבר, וממוצע את 3 הקרובות ביותר לחציון כדי לקבל סף נסיגה בסיסי.</li>
	<li>כדי לחשב את סף הנסיגה הבסיסי הממוצע של עכבר, ממוצע את סף הנסיגה הבסיסי שלו שנלקח ב-48 ו-24 שעות לפני הטיפול. אם סף הנסיגה הממוצע של קו הבסיס נמוך מ-3.50 גרם, או אם שני ערכי הסף הבסיסיים שונים ב-2.00 גרם או יותר, אל תכלול את העכבר בניסוי. קריטריונים אלה מבטיחים שלכל העכברים בניסוי יש תגובות בסיס עקביות, וסף נסיגה בסיסי גבוה מספיק המאפשר צפייה בסף נמוך יותר לאחר הטיפול.</li>
	<li>הערה: סף ההחרגה יהיה תלוי ברקמה הנבדקת, בזן בעלי החיים הנחקר ובסוג הקצה בו נעשה שימוש. לדוגמה, מצאנו ש-3.5 גרם הוא אמת מידה שימושית לרקמת כף הרגל האחורית ND4, אך אזורים רגישים יותר כמו הרכס האנו-גניטלי זקוקים לסף הרחקה נמוך יותר (Chatterjea, לא פורסם).</li>
	<li>הקצה עכברים לקבוצות טיפול כך שבסיס הנסיגה הממוצע של קבוצות הניסוי יהיה דומה ככל האפשר לפני מתן הטיפולים.</li>
</ol>
הערה: ניתן לבצע מדידות בסיסיות לפני 48 שעות לפני הניסוי. עם זאת, יש להשלים לפחות 2 סטים של מדידות בסיסיות במרווחי זמן קבועים לפני תחילת הטיפולים.
5. הערכת סף נסיגה ניסיונית של כפות אחוריות
<ol>
	<li>העריכו את סף נסיגת הכפות האחוריות (רגישות מכנית) לאחר הטיפול בנקודות זמן מתאימות שנקבעו על ידי תכנון הניסוי. החזירו עכברים לכלובים שלהם עם גישה למזון ומים מיד לאחר השלמת המדידות.</li>
	<li>בצע את השלבים המתוארים לעיל; בצע 3 במקום 5 מדידות כדי להפחית את האפשרות לגירוי יתר של רקמת הכף האחורית (המטופלת) במיוחד אם יש להעריך את הרגישות במספר נקודות זמן. אם שתי מדידות מתוך השלוש שנלקחו שונות ביותר מ-2.00 גרם, בצע מדידה רביעית.</li>
	<li>חשב את הממוצע של 3 מדידות כדי לקבל סף נסיגה ניסיוני עבור כל עכבר. עבור כל עכבר שעבורו נלקחו 4 מדידות, חשב את הממוצע של שלושה החורגים הכי פחות מהחציון, על מנת לקבל את סף הנסיגה הניסיוני.</li>
	<li>כדי להשיג סף נסיגת דלתא עבור כל עכבר בנקודת זמן מסוימת, הפחיתו את קו הבסיס מסף הנסיגה הניסיוני. חזור על הפעולה עבור כל העכברים וכל נקודות הזמן הניסיוניות9.</li>
	<li>לבצע ניתוח סטטיסטי מתאים על הנתונים שנאספו. כאן השתמשנו ב-JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) כדי לבצע ניתוח פוסט-הוק חד-כיווני של ANOVA ו-Tukey HSD.</li>
</ol>

<ol><li>Meetoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+diseases%3A+the+silent+global+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nurs%22%5BJournal%5D)">Chronic diseases: the silent global epidemic.</a> Br J Nurs. (21), 17-21 (2008).</li>
<li>Goldberg, D. S., McGee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+as+a+global+public+health+priority%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Pain as a global public health priority.</a> BMC Public Health. 11, 770 (2011).</li>
<li>Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+this+thing+called+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">What is this thing called pain.</a> J. Clin. Invest. 120 (11), 3742-3744 (2010).</li>
<li>Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+and+mechanisms+of+hyperalgesia+and+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia.</a> Physiol. Rev. 89 (2), 707-758 (2009).</li>
<li>Ren, K., Dubner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+immune+and+nervous+systems+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interactions between the immune and nervous systems in pain.</a> Nat. Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).</li>
<li>Cunha, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electronic+pressure-meter+nociception+paw+test+for+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">An electronic pressure-meter nociception paw test for mice.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 37 (3), 401-407 (2004).</li>
<li>Rudick, C. N., Bryce, P. J., Guichelaar, L. A., Berry, R. E., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cell-Derived+Histamine+Mediates+Cystitis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mast Cell-Derived Histamine Mediates Cystitis Pain.</a> PLoS ONE. 3, (2008).</li>
<li>Farmer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+vulvovaginal+fungal+infections+cause+persistent+pain+in+a+mouse+model+of+vulvodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Repeated vulvovaginal fungal infections cause persistent pain in a mouse model of vulvodynia.</a> Sci. Transl. Med. 3 (101), (2011).</li>
<li>Parada, C. A., Tambeli, C. H., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+role+of+peripheral+release+of+histamine+and+5-hydroxytryptamine+in+formalin-induced+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The major role of peripheral release of histamine and 5-hydroxytryptamine in formalin-induced nociception.</a> Neuroscience. 102 (4), 937-944 (2001).</li>
<li>Chatterjea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+degranulation+mediates+compound+48%2F80-induced+hyperalgesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mast cell degranulation mediates compound 48/80-induced hyperalgesia in mice.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 425, 237-243 (2012).</li>
<li>Oliveira, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mast+cells+in+a+mouse+model+of+postoperative+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Involvement of mast cells in a mouse model of postoperative pain.</a> Eur. J. Pharmacol. 672 (1-3), 88-95 (2011).</li>
<li>Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+constriction+of+the+sciatic+nerve+and+pain+hypersensitivity+testing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats.</a> J. Vis. Exp. (61), (2012).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J. Neurosci. Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Akunne, H. C., Soliman, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+modulation+of+pain+responsiveness+in+the+aged+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Serotonin modulation of pain responsiveness in the aged rat.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 48 (2), 411-416 (1994).</li>
<li>Detloff, M. R., Fisher, L. C., Deibert, R. J., Basso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+tactile+sensory+testing+after+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic tactile sensory testing after spinal cord injury in rats.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Cunha, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+neutrophils+in+the+development+of+mechanical+inflammatory+hypernociception%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crucial role of neutrophils in the development of mechanical inflammatory hypernociception.</a> J Leukoc. Biol. 83 (4), 824-832 (2008).</li>
<li>Lavich, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+infiltration+is+implicated+in+the+sustained+thermal+hyperalgesic+response+evoked+by+allergen+provocation+in+actively+sensitized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Neutrophil infiltration is implicated in the sustained thermal hyperalgesic response evoked by allergen provocation in actively sensitized rats.</a> Pain. (1-2), 125-121 (2006).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%26%2334%3Btunable%26%2334%3B+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as &#34;tunable&#34; effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+degranulation+activates+a+pain+pathway+underlying+migraine+headache%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache.</a> Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).</li>
<li>Bonavita, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+and+snake+venom+metalloproteinases+to+the+hyperalgesia+induced+by+Bothrops+jararaca+venom+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells and snake venom metalloproteinases to the hyperalgesia induced by Bothrops jararaca venom in rats.</a> Toxicon. 147 (8), 885-893 (2006).</li>
<li>Zychar, B. C., Dale, C. S., Demarchi, D. S., Gonçalves, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+metalloproteases%2C+serine+proteases+and+phospholipases+A2+to+the+inflammatory+reaction+induced+by+Bothrops+jararaca+crude+venom+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Contribution of metalloproteases, serine proteases and phospholipases A2 to the inflammatory reaction induced by Bothrops jararaca crude venom in mice.</a> Toxicon. 55 (2-3), 227-234 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים לחשוף.

מדידת השינויים בתגובות הגמילה היא כלי חשוב המשמש להערכת שינויים ברגישות המישוש במודלים של כאב ודלקת של מכרסמים. כאן אנו מדגימים את התועלת של מכשיר פון פריי אלקטרוני לביצוע הערכה זו. ישנם מספר יתרונות לטכניקה זו: 1) אנו יכולים להעריך במהירות את תגובות הנסיגה ללחץ המופעל עבור עכברים מרובים במספר נקודות זמן קרובות למדי זו לזו, 2) אנו יכולים להשתמש בקצה יחיד כדי להפעיל לחץ רציף וספציפי על אזור קטן של רקמה, 3) אנו יכולים למדוד במדויק את הלחץ המדויק המופעל כדי לקבל תגובת נסיגה, ו-4) אנו יכולים ליישם בקלות חתכים בסיסיים חזקים, קריטריונים להחרגה ובקרות פנימיות כדי להבטיח שהערכות התנהגותיות יהיו מדויקות ואובייקטיביות ככל האפשר.
השלבים הקריטיים להבטחת התוצאות הטובות ביותר עבור בדיקת EvF הם כיול מוקדם של המכשיר ושיטות מדידה עקביות. כמפורט בסעיף הפרוטוקול, יש לטפל במכשיר בזהירות ולהבטיח כיול נכון לפני ובמהלך השימוש. לפני ביצוע מדידות כלשהן, יש לאשר את קריאות משקל הבדיקה כדי להבטיח תפקוד אופטימלי של המכונה. אם הקריאות משתנות באופן משמעותי או אם קריאות משקל הבדיקה אינן מדויקות, יש לפנות מיד ליצרן כדי לכייל את המכשיר. עם זאת בחשבון, מומלץ להחזיק מכשיר פון פריי אלקטרוני לגיבוי, במידת האפשר, כדי לא לפגוע בניסויים רגישים לזמן עקב צורך בלתי צפוי בכיול המכשיר. יתר על כן, חוקר יחיד ומאומן היטב צריך לבצע את כל המדידות הבסיסיות והניסיוניות עבור מחקר נתון או סדרת ניסויים תוך שהוא נשאר עיוור לקבוצות הטיפול. יש להעריך עכברים בחדר שקט, להחזיק בטמפרטורה קבועה, להתאקלם בתאי ה-EvF למשך 15 דקות לפחות אך לא לרסן אותם בתא יותר מהנדרש (במיוחד אם נלקחות מדידות מרובות ביום אחד) כדי למזער שינויים התנהגותיים הנגרמים על ידי מתח ואי נוחות.
מדידות EVF מציעות שיפורים משמעותיים ביחס לטכניקות ה-CvF הקיימות. חוקרים יכולים להפעיל לחץ רציף ואינם צריכים לעבור בין קצות במשקלים שונים כפי שנעשה בניסויי נימה CvF6. זה מוביל לפחות דקירות ברקמה, וזה רלוונטי במיוחד במקרה של רקמה מודלקת או פצועה. ניתן למדוד לחץ מדויק שבו מתרחשת נסיגה לעומת שימוש במדידות נסיגה של 50% המוגבלות גם על ידי משקלי נימה זמינים המשמשים במדידות CvF13. מכיוון שניתן ליישם קריטריונים רציונליים ואחידים (כפי שנדון לעיל), ניתן להקצות עכברים לקבוצות ניסוי כך שלכל הקבוצות יש קווי בסיס ממוצעים דומים בתחילת הניסוי. מדידות EvF מעריכות את השינויים בתגובה ההתנהגותית לגירוי נתון, ולא את התגובות המוחלטות עצמן. לכן, השינוי של כל עכבר בתגובה הנוסיספטיבית נמדד כהבדל בין הנסיגות הניסיוניות האישיות והבסיסיות שלו, ובכך מספק בקרות פנימיות לכל מדידה שנעשתה.
אולי המגבלה המשמעותית ביותר של EvF היא שבדומה למקבילו הידני, אותו חוקר חייב לבצע את כל המדידות עבור סדרה מסוימת של מדידות בסיסיות וניסיוניות. זה הופך את הרחבת הטכניקה למאתגרת מבחינת זמן, כוח אדם וציוד. אנו מוצאים כי ניתן למדוד ~20 עכברים בכל פעם (תלוי בתצורת תאי הבדיקה) תוך 30-45 דקות או פחות במספר נקודות זמן בתנאי שיש לפחות 45 דקות בין המדידות. שיקול קשור בהקשר זה הוא עקומת הלמידה של נסיינים בודדים. יש לבסס עקביות פנימית לפני שחוקר בודד יכול לצאת לניסוי בקנה מידה מלא וזה דורש שעות רבות של תרגול ייעודי הכולל מדידות תגובה חוזרות ונשנות עד להשגת העקביות הרצויה. בנוסף, שימוש בחיתוכים בסיסיים מרמז שלא ניתן לכלול את כל העכברים המבוססים על ניסוי; אנו מוצאים ש-25-30% מהעכברים המבוססים על כל ניסוי אינם נכללים בדרך כלל.
במונחים של שינויים ויישומים עתידיים, מדידות התנהגותיות של EvF מוסיפות ממד רב עוצמה למגוון רחב של מודלים של דלקת כדי לנתח כאב חריף ו/או כרוני במקביל שיכול לעמוד בבסיס פתולוגיות דלקתיות. בארס, מצאנו כי שינויים בולטים ומהירים ברגישות המישוש ליוו את התוצאות הצפויות של נפיחות רקמות, גיוס לויקוציטים ודגרנולציה של תאי פיטום בכפות האחוריות של עכברים זכרים ND4. ממצאים אלה מאששים תצפיות קודמות לגבי תרומתם של מתווכי תאי פיטום לרגישות תרמית בחולדות20 ורגישות מכנית הנגרמת על ידי ארס B. jararaca בעכברים שוויצריים ND4 שנמדדו באמצעות CvF21. ניתן לשנות בקלות את פרוטוקול ה-EvF לשימוש ברקמות שאינן כף הרגל האחורית, למשל בטן7 ורכס אנו-גניטלי8 שבו משתמשים כיום ב-CvF. ניתן להתאים בקלות מודלים של מכרסמים של אלרגיות, ריפוי פצעים, נוירופתיות ופתולוגיות אחרות כדי לכלול מדדים של רגישות מכנית ברקמות כולל ומעבר לכף האחורית.
לסיכום, EvF היא טכניקה שימושית ויעילה המעדכנת גישה קלאסית למדידת כאב במכרסמים ומהווה כלי חדש וחשוב בחקירת המנגנונים הבסיסיים המורכבים של כאב במגוון רחב של מודלים של מחלות.

מחלות כרוניות לא מדבקות אחראיות לחלק לא פרופורציונלי של נטל התמותה והתחלואה האנושית1. כאב כרוני מוכר יותר ויותר כמרכיב חשוב בנטל המחלה העולמי2. זה סיפק תנופה גדולה לחידושים במניעה, ניהול וטיפול בכאב. יחד עם זאת, ישנן ראיות רבות לכך שהביולוגיה הבסיסית של הכאב היא מורכבת3. המנגנונים העומדים בבסיס כאב מגן, כמו גם כאב לא מסתגל וכרוני מצביעים על יחסי גומלין מורכבים בין מערכת החיסון למערכת העצבים3,4. הבהרת מנגנונים אלה דורשת גישות ניסיוניות כמותיות קפדניות וניתנות לשחזור מניתוח מולקולרי לניתוח התנהגותי.
מודלים של מכרסמים לא יסולא בפז באפיון שחקנים מולקולריים של כאב דלקתי ונוירופתי5. הפחתת הזמן והעוצמה של תגובות שצוינו בעבר לגירויים מזיקים משמשת למדידת מצבי כאב בבעלי חיים אלה מכיוון שנבדקים מכרסמים אינם מסוגלים לדווח על תחושת כאב6. תגובות משתנות לטמפרטורה ולחץ משמשות בדרך כלל כמדדים לרגישות רקמות במודלים של מכרסמים של כאב דלקתי שיכול להיגרם על ידי זיהום7,8, חשיפה כימית6, 9,10, חתך כירורגי11, כמו גם כאב נוירופתי הנגרם על ידי קשירת עצבים12.
רגישות מכנית, או תגובה לגירוי לחץ, נמדדת לעתים קרובות באמצעות חוטי פון פריי קלאסיים (CvF) - סדרה (למשל 0.4-15 גרם13) של קצוות משוקללים המיושמים ידנית על רקמת הבדיקה במרווחים סדרתיים עד להתנהגויות כאב בבקרות לעומת נבדקי ניסוי. ישנן שיטות שונות לשימוש בקצות או בשערות אלה כדי להעריך רגישות מכנית6,13; השיטה הנפוצה ביותר היא כדלקמן. טיפ עם לחץ מסוים (בתוך הסדרה; לדוגמה, 2 G, 13) נבחר כנקודת התחלה, וסף הנסיגה של חולדה או עכבר של 50% (עוצמת הגירוי הנדרשת כדי לייצר תגובה 50% מהפעמים שהקצה מוחל על הרקמה) נקבע על ידי תנועה למעלה ולמטה במשקל הקצה בהתבסס על הצגת התנהגויות תגובה שצוינו קודם לכן13. לאחר מכן מושווים סף גמילה מוחלט של 50% לקבוצות הטיפול בין נקודות הזמן הבסיסיות ואחרי הטיפול. טכניקה ידנית זו גוזלת זמן רב למדי. בנוסף לזמן המוגבר שמבלה כל נבדק בתא פון פריי, זה גם מגדיל את מספר הפעמים שקצות בדיקה במשקלים שונים מוחלים על רקמות דלקתיות וגורמים לאי נוחות רבה יותר למכרסמים במחקר. יתר על כן, סף נסיגה של 50% מחושב ומושווה בין קבוצות מכרסמים; התגובות האישיות של נבדקי הניסוי בדרך כלל אינן מנורמלות לתגובות הבסיס האישיות הלא מטופלות שלהם, למעט, למיטב ידיעתנו, יוצא מן הכללאחד 6. כתוצאה מכך, נבדקים מכרסמים אינם מדווחים בדרך כלל ככאלה שהוקצו לקבוצות טיפול על בסיס תגובות בסיס עקביות בטווח שנקבע בעבר וגם נבדקים בודדים אינם מוערכים על בסיס קבוצה מיושמת באופן עקבי של קריטריוני אי הכללה המאפשרים לתקנן את תגובות הבסיס עבור כל קבוצה מסוימת של מחקרים ובדיקות.
כאן, אנו מציגים שיטה חלופית למדידת רגישות המישוש של כף הרגל האחורית של העכבר בעקבות חשיפה לארס Bothrops jararaca באמצעות מכשיר פון פריי אלקטרוני (EvF). קוניה ועמיתיוהיו חלוצים בשימוש בטכניקות EvF במכרסמים והשוו באופן שיטתי את יעילות CvF ו-EvF כדי להוכיח ש-EvF מספק מדד "רגיש יותר, אובייקטיבי וכמותי" של רגישות למישוש במודלים של מכרסמים של כאב דלקתי. בקצרה, במדידות EvF, קצה פוליפרופילן פון פריי לא היגרוסקופי בקוטר אחיד (0.8 מ"מ) בעל קשיחות מתאימה לרקמה הנבדקת מחובר לבדיקה אלקטרונית וקריאה המציגה את הכוח/משקל שבו המכרסם נסוג מהקצה. ישנם מספר הבדלים חשובים בין מדידות CvF ו-EvF. ראשית, תהליך מדידת התגובות הבסיסיות והניסיוניות באמצעות EvF יעיל מאוד מכיוון שניתן להפעיל לחץ על הכף האחורית בכוח הולך וגובר עד שיש תגובה ואין צורך לשנות טיפים כמו ב-CvF; בעלי חיים מבלים פחות זמן כלואים בתאי הבדיקה ולכן הם פחות לחוצים ונוחים יותר במהלך הניסוי. שנית, EvF מאפשר קלות יחסית ביישום של קריטריוני אי הכללה רציונליים עבור נבדקי המחקר בצורה של טווחים של סף בסיס מקובל. זה מאפשר סטנדרטיזציה של תגובות בסיסיות בתוך ובין קבוצות טיפול. שלישית, תגובת הנבדק לאחר טיפול ניסיוני מושווה תמיד לתגובת הבסיס האישית שלו, מה שיוצר בקרות פנימיות חשובות למדידות. רביעית, הדיוק של ספי הנסיגה נרשם ברמת רזולוציה גבוהה יותר מכיוון שניתן להפעיל לחץ ברציפות ולא במרווחים זמינים בצורה של משקולות של חוטים ידניים. כמו במבחני CvF מתוכננים היטב, ניסויים מבוססי EvF מבוצעים גם עם אותו חוקר (עיוור לטיפול) שמפעיל את הכוח ומתעד את התנהגויות התגובה. חשוב לציין שטכניקה זו דורשת זמן ומאמץ מצד החוקרים כדי לבסס עקביות פנימית של המדידות ודורשת תכנון ניסויים כך שיינתנו קצבאות מתאימות לעכברים שייתכן שיהיה צורך לשלול עקב תגובות בסיס לא עקביות.
הערכה קלה ליישום, יעילה ומבוקרת היטב של רגישות מכנית מקלה על הוספת הערכה התנהגותית למודלים של אירועים דלקתיים כגון ארס - הדוגמה שהשתמשנו בה כאן כדי להמחיש את היכולות והעוצמה של מדידות EvF במדידת שינויים ברגישות המישוש. מצאנו כי עכברים שוויצריים זכרים ND4 הראו רגישות מכנית מוגברת בעקבות הזרקת ארס שמקורו בצפע הבור הדרום אמריקאי Bothrops jararaca בכפה האחורית. תגובות התנהגותיות לוו בבצקת, זרם של נויטרופילים ודה-גרנולציה של תאי פיטום ברקמה הפגועה.

<table><tbody><tr><td>עכברים זכרים שוויצריים ND4</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>עכברים ששימשו כאן היו בני 8-12 שבועות ושוכנו ושימשו בהתאם להנחיות IACUC של מכללת מקאלטר.</td></tr><tr><td>מזרק אינסולין 3 מ"ל/100 עם 29 גרם 1/2 במחט</td><td>BD</td><td>BD309301</td><td>יש להשליך לאחר כל שימוש למיכל המתאים.</td></tr><tr><td>B. jararaca ארס</td><td>Sigma</td><td>V5625</td><td>זהירות: חומר רעיל. יש ללבוש הגנה על העיניים והעור. יש להמיס במי מלח סטריליים של 0.9%.</td></tr><tr><td>מכשיר פון פריי אלקטרוני; בדיקה = טווח 90 גרם</td><td>IITC</td><td>2394</td><td>זז בעדינות וודא שהוא תמיד אופקי. לאפס את הבדיקה, לחץ על "תוכנית" ו"נקה". למעבר ממצב הגדרה להפעלה, לחץ על "פונקציה" (לקריאת "MH") או "MAX".</td></tr><tr><td>מעמד רשת + תאי PMMA</td><td>IITC</td><td>410</td><td>הנח על משטח ספסל יציב או עגלה עם ארבעה גלגלים על מנת לגשת לכל הצדדים.</td></tr><tr><td>קצוות קשיחים אלקטרוניים של פון פריי בלבד, טווח 90 גרם</td><td>IITC</td><td>2390</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

מדידת שינויים הנגרמים על ידי דלקת בסף נסיגת כפות הרגליים האחוריות מלחץ מכני היא טכניקה שימושית להערכת שינויים בתפיסת הכאב אצל מכרסמים. ניתן למדוד את סף הגמילה תחילה בנקודת ההתחלה ולאחר מכן לאחר תרופות, ארס, פציעה, אלרגן או דלקת מעוררת אחרת על ידי הפעלת כוח מדויק על אזורים ספציפיים מאוד בעור. מכשיר פון פריי אלקטרוני מאפשר הערכה מדויקת של ספי משיכת כפות הרגליים האחוריות של העכבר שאינם מוגבלים על ידי גדלי החוטים הזמינים בניגוד למדידות פון פריי הקלאסיות. הקלות והמהירות של המדידות מאפשרות שילוב של הערכה של תוצאות רגישות מישוש במודלים מגוונים של כאב דלקתי ונוירופתי מהיר, שכן ניתן לבצע מדידות מרובות תוך פרק זמן קצר. ניתן לשלוט באופן פנימי במדידות ניסיוניות עבור נבדקים בודדים של מכרסמים כנגד תגובות בסיס בודדות וקריטריוני אי הכללה שנקבעו בקלות כדי לתקנן תגובות בסיסיות בתוך ובין קבוצות ניסוי. לפיכך, מדידות באמצעות מכשיר פון פריי אלקטרוני מייצגות שינוי שימושי של הבדיקות הקלאסיות המבוססות היטב המבוססות על נימה של פון פריי עבור אלודיניה מכנית של מכרסמים שניתן ליישם גם על מודלים אחרים של יונקים לא אנושיים.

מתן מקומי של ארס B. jararaca גורם לשינויים ברגישות המגע של כף רגל אחורית ובבצקת רקמה בעכברי ND4 Swiss זכרים.
1.5 שעות לאחר מתן 45 µg/kg של ארס B. jararaca, עכברים זכרים מסוג ND4 Swiss משכו את כפות רגליהם האחוריות בלחץ הנמוך ב-3.0 g מהקו הבסיס (Figure 1A). נסיגת הקו הבסיס עבור כל הקבוצות התרחשה בלחץ מופעל של ~4.5 g; לאחר הטיפול בארס, עכברים ניסיוניים משכו את כפות רגליהם האחוריות בלחץ מופעל של 1-1.5 g (נתונים לא מוצגים). עכברי ביקורת שטופלו בסליין הראו הפחתה מועטה או ללא הפחתה בתגובה ללחץ בהשוואה לקו הבסיס בכל נקודות הזמן שנבדקו. ספי תגובה מופחתים בעכברים המטופלים נשמרו בבירור ב-3 ו-6 שעות לאחר ההרעלה (Figure 1A) ולא היו ניתנים להבחנה מקבוצות הביקורת עד לשעה ה-24 (נתונים לא מוצגים). כפות הרגליים האחוריות של העכברים המורעלים הראו בצקת רקמה המאפיינת דלקת. 1.5 שעות לאחר מתן הארס, כפות רגליים אחוריות מטופלות, שנמדדו כפי שמתואר בעבר10, היו עבות ב-1.5 mm לעומת קו הבסיס; הבצקת נשמרה לאורך 3 ו-6 שעות (Figure 1B). לעומת זאת, כפות רגליים שטופלו בסליין לא הראו נפיחות או שינוי בעובי לאורך תקופת הניסוי. עבור הניסוי המייצג המוצג כאן, נעשה שימוש ב-21 עכברים עבור מדידות קו הבסיס ו-14 נבחרים להכללה בניסוי. אלו הוקצו לקבוצות טיפול כך שתגובות נסיגה ממוצעות בקו הבסיס היו סביב 4.5 g עבור כל קבוצה ככלל.
שינויים ברגישות למגע המושרים על ידי ארסי B. jararaca מלווים בדגראנולציה של תאי מאסט ובהזרמת נויטרופילים לכפות הרגליים האחוריות של עכברי ND4 Swiss זכרים.
בנוסף לרגישות מגע מוגברת ובצקת ברקמות, הערכנו גם את חדירת הנויטרופילים (איורים 2A-B) ואת דגרנולציית התאיים המאסטים (איורים 2C-D) בכפות הרגליים האחוריות של עכברים שהורעלו לעומת עכברים שטופלו בתמיסת סליין. נויטרופילים הם התאים הדלקתיים הראשונים המגויסים למקום הפגיעה ממערכת הדם, והם ידועים כמתווכים של תגובות נוציצפטיות דלקתיות10,16,17. תאים מאסטים הם תאי זקינה השוכנים ברקמה18, ודגרנולציית תאים מאסטים נקשרה לתגובות נוציצפטיות בכפות הרגליים האחוריות של עכברים10 ובקרומי העטיפה של המוח (dura mater) של חולדות19.
כאן, מצאנו כי זרימת נויטרופילים לתוך כפות הרגליים האחוריות שהוחדרו בארס גברה פי 1,000 כמעט בהשוואה לכפות רגליים אחוריות שטופלו בתמיסת סלין (איור 3A), כפי שהוערך על ידי ספירה של חתכים סגיטליים של רקמת כף הרגל בעובי 4 µm, המוטמעים בפאראפין וצבועים ב-hematoxylin-eosin10, שנלקחו 1.5 שעות לאחר מתן הארס מעכברים שהורדמו.
בכפות רגליים שטופו בתמיסת מלח, תאי מאסט פלנטריים ברקמת כף הרגל האחורית היו ברובם שלמים או הראו דגרנולציה קלה (איור 3B). לעומת זאת, בכפות רגליים אחוריות שחדר אליהן ארס נצפתה דגרנולציה מתונה ונרחבת של 15-20% מתאי המאסט (איור 3B). חתכי הרקמה שתוארו לעיל נצבעו ב-toluidine blue ומספר הגרנולות הנראות נספר לכל תא מאסט שנצפה כדי לקבוע את מצב הדגרנולציה, כפי שמתואר בספרות10.
<img alt="B. jararaca venom effect graphs: A) Mechanical threshold, B) Paw width over time. Statistical data.
" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
איור 1. מקומי *B. jararaca* מתן ארס גורם לשינויים ברגישות מכנית של כף הרגל האחורית ולהבכה (edema) ברקמות בעכברים זכרים מסוג ND4 Swiss. ספי thresholds של משיכה בבסיס (baseline) ורוחב כף רגל בבסיס נמדדו 48 ו-24 שעות לפני הזרקה תוך-פלנטרית (intra-plantar) *B. jararaca* רעל (Bjv; 45 µg/kg) או טיפול בחומר נשיאה (סאליין) (10 µlספי thresholds של נסיגה הוערכו בנקודות זמן של 1.5, 3 ו-6 שעות לאחר הטיפול (A). Aרוחב כף רגל ממוצע (רוחב ממוצע של כף הרגל השמאלית והימנית של עכבר) באזור מרכז כף הרגל (mid-plantar region) נמדד באמצעות קליבר דיגיטלי בנקודת הבסיס ולאחר מכן בפרקי זמן של 1.5, 3 ו-6 שעות לאחר הטיפול, כדי לקבוע את רמת הבשקת הרקמה כפי שתואר בעבר10 (B). רמות המובהקות הושוו לעכברים שטופלו ב-Sal (* = p &lt; 0.05, ** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; 0.001 בהתאמה). n = 10-11 עכברים לכל קבוצת טיפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="השוואה היסטולוגית של השפעות תמיסת סליין ו-B. jararaca, תחת הגדלה של 400x ו-1000x." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 2"> 
איור 2. רגישות מכנית המושרית על ידי ארס של B. jararaca מלווה בדגראנולציה של תאי מאסט ובזרימה של נויטרופילים לכפות הרגליים האחוריות של עכברי זכר מסוג ND4 Swiss. 3 עכברים לטיפול הומתו באמצעות CO2 ב-1.5 hr לאחר הטיפול וכפות הרגליים האחוריות שלהם הוצאו, נשמרו בפורמלין 10% למשך 24 hr, הועברו לאתנול 70%, עברו דקלקציה למשך 1-2 שבועות ב-EDTA 15%, ונטמנו בפראפין. חיתוכים סגיטליים בעובי 4 µm נצבעו בהמטוקסילין-אוזין (A-B) ובכחול טולואידין (C-D) לצורך ויזואליזציה של נויטרופילים (A-B) ותאי מאסט (C-D), בהתאמה. התמונות נרכשו בהגדלה של 400X ו-1,000X כפי שצוין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>. 
<img alt="נויטרופילים ודגרנולציה על ידי ארס של B. jararaca; גרף עמודות; ניתוח השפעת הארס." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51212/51212fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 3"> 
איור 3. רגישות מכנית המושרית על ידי ארס של B. jararaca מלווה בעליות משמעותיות ברמות דגרנולציה של תאי מאסט ובהזרמת נויטרופילים לכפות הרגליים האחוריות של עכברי ND4 Swiss זכרים.נויטרופילים ותאי מאסט בחתכי רקמה צבועים נספרו באמצעות מיקרוסקופ Olympus CX21LED. נויטרופילים נספרו ב-3 כפות רגליים אחוריות לטיפול, מהעקב ועד הבהונות, בשדות ראייה סמוכים בהגדלה של 400X (A). תאי מאסט נספרו ב-3 כריות כף רגל לטיפול, ומצב הדגרנולציה שלהם דורג על פי מספר הגרנולות הגלויות מחוץ לגבול התא: שלמים (0), קלה (0-10), בינונית (10-20), נרחבת (21+), כפי שתואר בעבר10 (B). כדי למנוע ספירה כפולה של אותם תאים, החוקרים שהעריכו את מספר הנויטרופילים ואת רמות הדגרנולציה של תאי המאסט בחתכי כף הרגל האחורית השתמשו ברשת רשומה על רטיקל העין. החוקרים היו מסווגים באופן עיוור לטיפוליםs. מובהקויות מושווים לעכברים שטופלו ב-Sal (* = p &lt; 0.05, ** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; 0.001 בהתאמה). n =3 עכברים לכל קבוצת טיפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51212/51212fig3highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר</a>.

מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד תגובות רגישות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים. הדבר מבוצע תחילה על ידי הנחת בעלי החיים על רצפת רשתית ומתן זמן להתרגלו כאשר הם מוכנים. קצה פוליפרופילן מופעל על הצד התחתון של כף הרגל האחורית, והלחץ מוגבר בהדרגה.כאשר נצפית התגובה ההתנהגותית המתאימה, הגירוי מוסר. לאחר איסוף ערכי הבסיס, בעלי החיים מקבלים התערבות ניסיונית לפני המשך הבדיקות. לבסוף, מושווים שינויים בספי תגובת נסיגת כף הרגל האחורית בין קבוצות הטיפול כדי לקבוע את השפעת טיפול מסוים על שינויים ברגישות מגע ללחץ.כאב הוא מרכיב מרכזי בדלקת. חשוב למדוד ולאפיין כאב בהקשרים שונים. שיטה פשוטה יחסית זו להערכת כאב ניתנת ליישום במודלים רבים ושונים של דלקת.את הפרוצדורה תדגים טיאנה, טכנאית מחקר במעבדה שלי, מדיסון מאק, שהייתה מעורבת בעבודה זו כסטודנטית לתואר ראשון, ואקילה סייקס, סטודנטית לתואר ראשון במעבדה שלי. נתחיל בהכנת מכשיר הבדיקה כדי לאפשר גישה קלה לכפות הרגליים האחוריות.הניחו תאי בידוד בודדים על גבי רצפת רשת. רצפת הרשת צריכה להיות בגובה נוח ועל משטח יציב. לאחר מכן, הניחו את מכשיר Von Frey האלקטרוני על גבי משטח העבודה.יש לוודא שהגשושית והכבל מחוברים כראוי ליחידת התצוגה ולהדליק את המכשיר במצב הגדרה (setup mode). יש לאפס את התצוגה ולהניח בעדינות את משקולת הבדיקה המסופקת על קונוס גשושית ה-Von Frey. רשמו את ערך התצוגה וחזרו על הליך זה שוב בסיום הבדיקה; אם קיים פער בין שני הערכים, ייתכן שיהיה צורך לכייל את המכשיר מחדש.בחרו טיפ פוליפרופילן בגודל המתאים לרקמה לבדיקה. טיפים קשיחים מתאימים לרקמה פחות רגישה ועמידה יותר של כף הרגל האחורית. הרכיבו בעדינות את הטיפ על קונוס הגשש.כעת עברו ממצב הגדרה (setup mode) למצב פעולה (operation mode). פעולה זו תציג את הלחץ המקסימלי המופעל כאשר הגשוש נסוג. נדרשים שני חוקרים כדי למדוד את ספי תגובת הנסיגה של כף הרגל האחורית.אחד להפעלת המכשיר וביצוע המדידות, ואחר לרישום המדידות הללו, וזאת כדי להפחית הטיות. החוקר המפעיל את ה-anesthesi TER צריך להיות מסומך (blinded) לגבי הטיפולים וכן לגבי ערכי סף הנסיגה הרשומים. יתרה מכך, כדי להבטיח עקביות בין המדידות, אותו אדם צריך לרשום את כל ערכי הבסיס וערכי סף הנסיגה.48 שעות לפני הטיפול, נרשמות המדידות הראשונות של קו הבסיס. הנח חומר סופג מתחת למעמד כדי לאסוף את הפסולת המופרשת. לאחר התקנת הראש ואיפוס הגשושית, על החוקר המבצע את המדידות להניח את העכברים בתאים נפרדים.כסו את התאים במכסים מחוררים והניחו חפץ כבד מעליהם. כדי למנוע מהעכברים לברוח, אפשרו להם להתרגל לתא במשך 15 דקות לפני ההמשך. באופן כללי, מי שאינם מנוסים בטכניקה זו יתקשו ביישום הדרגתי של לחץ מוגבר וביצירת עקביות פנימית במדידותיהם; תרגול הוא חיוני להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.כאשר הדבר מוכן, השתמש בשתי ידיים כדי להרים את הגשוש באיטיות ולגרות את כרית כף הרגל של אחת הרגליים האחוריות, השמאלית או הימנית. הגבר את הלחץ בהדרגה עד להופעת התנהגות נוציצפטיבית. התנהגויות אלו מזוהות על ידי הרחקה של כף הרגל האחורית, ליקוק של כף הרגל האחורית, או קפיצות של כף הרגל.הנח את החוקר השני לרשום את הלחץ שעורר את ההתנהגות שנצפתה. במהלך המדידה, מומלץ לעודד את העכבר להישאר ללא תנועה על ידי הנחת פלטת מזון ממש מחוץ לתא או הפקת רעש קל, כגון נקישה עדינה, לפני ביצוע המדידה. המשך לעכבר הבא עד שכל העכברים נבדקו פעם אחת, וחזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות.לאחר איסוף חמישה ערכי בסיס, חשבו ממוצע עבור כל עכבר. חזרו על מדידות הבסיס לאחר 24 שעות והשתמשו בערכים אלה כדי לחשב ממוצע נוסף. כדי להבטיח תגובות בסיס עקביות בכל העכברים, הסירו בעלי חיים עם סף נסיגה ממוצע בבסיס הנמוך מ-3.5 grams או עם ספי בסיס הנבדלים בשני grams או יותר.לבסוף, חלקו את העכברים לקבוצות טיפול נפרדות כך שממוצע בסיס הסף למשיכה של כל קבוצה יהיה דומה ככל האפשר. במקרה זה, ספי משיכה נמדדו לאחר הזרקת הרעל לכף הרגל האחורית, ROS raca. עכברים שקיבלו תמיסת סליין כביקורת הראו שינוי מועט בהשוואה לבסיס בכל נקודות הזמן.נקודות שנבדקו הראו כי התגובות הנוציספטיביות בעכברים שעברו טיפול נשמרו בבירור עד שש שעות. בנוסף, בצקת רקמה, המאפיינת דלקת, הייתה ניכרת בכפות הרגליים האחוריות שטופלו ברעל, אך לא באלו שטופלו בתמיסת סליין. שינויים ברגישות למגע שגרם הרעל לוו בהגעה של נויטרופילים פי כמעט 1000.בהשוואה לכפות רגליים אחוריות שטופלו בתמיסת סליין, תאי המסט הפלנטריים ברקמת כף הרגל האחורית היו במינם שלמים או הראו דגרנולציה קלה. לעומת זאת, בכפות רגליים אחוריות מזדווגות נצפתה דגרנולציה מתונה ונרחבת של 15% עד 20% מתאי המסט. ניתן להתאים טכניקה זו להערכת רגישות מכנית או מגעית במגוון רחב של רקמות מלבד כף הרגל האחורית.לפיכך, ניתן לשלב טכניקה זו במודלים רבים ושונים של דלקת וכאב במכרסמים.

measuring-changes-tactile-sensitivity-hind-paw-mice-using-an

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נתאר שתי שיטות בדיקה מישוש חושיות לתקופות חריפה או כרונית של פגיעה בחוט השדרה של חולדות. נהלים אלה תוקף יכול לזהות פיתוח ותחזוקה של allodynia כמו תחושות.

אקוטי וכרוני בדיקה חושי טקטילי לאחר פגיעה בחוט השדרה של חולדות

בגלל הפשטות של ניתוח תוצאות התנהגותיות חזקים, היצרות כרונית של עצב השת הוא אחד מראש יחסני במודלים של בעלי חיים של כאב נוירופתי. תוך 24 שעות לאחר הניתוח, רגישות יתר לכאב הוא הקים ניתן למדוד כמותית באמצעות פריי פון aesthesiometer (מבחן מכני) ו מטר כאבים plantar (מבחן תרמית).

היצרות כרונית של העצב Sciatic ואת רגישות יתר לכאב בדיקה אצל חולדות

כאב נוירופטי הוא תוצאה של פגיעה או מחלה המשפיעה על מערכת החושית. "מודל השרוול" בכאב עצבי בעכברים מורכב מההשתלה של שרוול פוליאתילן סביב הסניף הראשי של העצב השת. אלודיניה מכאנית נבדקה באמצעות חוטי פון פריי.

דגם השת עצב איזוק של כאב נוירופתי בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לקבוע ספי רטט איתור חד מישוש בשיטות פסיכו באדם.

מדידת סף זיהוי רטט מישוש מרחבי חדות בבני אדם,

ההערכה המדויקת של תגובת כאב במודל בעלי חיים נוירופתי חיוני לחקור הפתופיזיולוגיה של כאב מחלות ולפתח משככי כאבים חדשים. אנו מציגים שיטה אובייקטיבית רגיש כדי לקבוע את תפקוד חושי למכרסמים הינד כף של מערכת ניתוח הילוך אוטומטי.

אוטומטיות והרצתי ניתוח אצל עכברים עם פציעה כרונית הכיווץ

מחקר זה יוצר מודל ניסיוני של נוירופתיה טהור סיבים קטנים עם resiniferatoxin (RTX). מנה ייחודית של RTX (50 µg/kg) היא אופטימלית לפיתוח מודל נוירופתיה סיבים קטנים המחקה מאפייני המטופל יכול לעזור לחקור את המשמעות nociceptive המולקולרי שבבסיס כאב נוירופתי.

הקמת מודל העכבר של נוירופתיה סיבים קטנים טהור עם אגוניסט Ultrapotent פוטנציאלי קולטן ארעי Vanilloid סוג 1

במאמר זה אנו מספקים פרטים עבור שיטות ייצור, בקרת איכות של חלבון רקומביננטי פיוז'ן IL4-10. אנו גם מראים כיצד לבחון את היעילות של חלבון זה כדי לפתור כאבים במודל של עכברים של כאבים דלקתיים.

פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני

הניתוח המותאם הוא שיטה פשוטה למודל פגיעה עצבית חסכנית של עכבר או חולדה הדורשת רק קשירה אחת וחתך אחד כדי לפגוע הן בעצבים הפרוניאליים והן בעצבים הסוראליים.

מודל שונה של פגיעה עצבית ניצלת של כאב נוירופתי בעכברים

שיטות להשראת מודל כאב גב פשוטה ומהירה בעכברים ניתנות כאן באמצעות הזרקה תוך רצועה של מפעיל פלסמינוגן בשתן.

מודל כאב גב עכבר הנגרם על ידי מפעיל אורוקינאז

קשירת עצבים סיאטית חלקית גורמת לכאב נוירופתי כרוני מתמשך, המאופיין בתגובות מוגזמות לגירויים תרמיים ומכניים. מודל עכברי זה של כאב נוירופתי משמש בדרך כלל לחקר טיפולים חדשניים לניהול כאב. מאמר זה מתאר בפירוט את ההליך הכירורגי לשיפור התקינה והשחזור.

קשירת עצבים סיאטית חלקית: מודל עכברי של כאב נוירופתי כרוני לחקר ההשפעה האנטינוסיצפטיבית של טיפולים חדשניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת nociception בעכברים נגועים Trypanosoma evansi, באמצעות מכשיר פון פריי האלקטרוני ככלי, מדידת סף מכני של הכף האחורית ואת הקרביים.

פון פריי האלקטרוני קשור לסולם גרימס עכבר להערכת אלודיניה וכאב בעכברים נגועים בטריפנוסומה אוונסי

למדו למדוד תגובות נוקיצפטיביות ללחץ מכני בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מכשיר אלקטרוני פון פריי. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה ומדויקת של סף הנסיגה לפני ואחרי התערבויות דלקתיות.

מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

גלה סרטונים נוספים