Name: ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: חקור את היעילות הציטוטוקסית של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה. השיטה כוללת מדידת ספיגת הפוטוסנסיטייזר M-T-H-P-C והערכת שרידות התאים לאחר הטיפול באמצעות מבחן WST-1 וספירה ישירה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לbiolitec המחקר GmbH (Jena, גרמניה) לחביבות לתת לנו ניסוח mTHPC liposomal, עם תודה מיוחדת לסוזנה Grafe וארנו Wiehe לעזרתם ומומחיות טכנית. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרסטין ריידי, שנוצר חלק גדול מהתוצאות והיה coresponsible לפרסומו 11. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מSchweizerischer Verein Balgrist, אוניברסיטת ציריך, ציריך Krebsliga כמו גם על ידי מענק מל &#39;וולטר וקרן יוהנה וולף, ציריך, שוויץ ומענק מEuroNanoMed ERA-NET / SNF שוויצרי הקרן הלאומית למדע 31NM30-131004/1. עבודה זו נתמכה גם על ידי תכנית (מאוד מיוחדת לרפואה) לשלד ושרירי אונקולוגיה של ציריך Kanton HSM.

1. השוואה בין הספיגה של mTHPC בנמוכה ביותר בהתאמה וגרורתי HOS ושורות תאי 143B OS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תרבית תאים המכיל DMEM, Ham F12, וסרום חום מומת עוברי עגל ב4.5:4.5:1 יחס. הערה: ניסוח liposomal של mTHPC נ.ב. היה מומס במים בריכוז סופי של 1.5 מ&quot;ג / מיליליטר mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HOS פלייט 0.2 x 10 6 ותאי 143B / גם ב6 צלחות היטב (triplicates עבור כל תנאי) ולתת לתאים לדבוק לילה. שים לב: המספר צריך להיות מותאם לשורות תאים בודדות. Confluency של 80-90% הוא מתאים ביותר בעת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוז קבוע של mTHPC לתקופות זמן שונה (ספיגה תלויה בזמן), או עם עלייה בריכוזים של mTHPC במהלך פרק זמן קבוע (ספיגה תלויה במינון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם mTHPC עבור p זמן מסויםoints או ריכוזים של mTHPC. שים לב: במחקר זה, הן את HOS ושורות תאי 143B הודגרו עם 0.6 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC עבור 0, 2.5, 5, או 10 שעה, או עם 0, 0.6, 2.5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC במשך 5 שעות. פרקי הזמן שיושמו ומינונים עשויים להשתנות תלוי בשורה של התאים המשמשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכור תמיד לעבוד בחושך או בתנאי תאורה מעומעמים כדי למנוע חשיפה לאור ישירה של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה של התאים בתנאים מצויינים, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. בשלב הבא, לנתק את התאים עם 0.5 מיליליטר טריפסין / EDTA ולספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוק, צנטריפוגה התאים ב XG 400 למשך 5 דקות, לשאוב את המדיום וresuspend תאי PBS לצפיפות סופית של 200,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של ההשעיה התא שהושגה פיפטה 100 μl (כלומר 20,000 תאים) בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של תאים אלה בספקטרופוטומטר הקרינה. ההגדרהשל מדידות הקרינה mTHPC הם: 417 ננומטר לעירור ו652 ננומטר לפליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לחשב את כמות mTHPC המופנם לכל תא, לנרמל את יחידת הקרינה היחסית (RFU) למספר התא ונפח תא כדלקמן: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומת סטנדרט באמצעות ריכוזים שונים של mTHPC ב-PBS 0-4 מיקרוגרם / מיליליטר (מדידות בשלושה עותקים לשימוש). פיפטה של ​​דילול כל 100 μl בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של הבארות תוך שימוש בהגדרות שתוארו בשלב 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את RFU (המתקבל ל20,000 תאים) על ידי שיפוע העקום הסטנדרטי ליניארי של mTHPC, אשר נותן את הריכוז של mTHPC (במיקרוגרם / מיליליטר) בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים ריכוז mTHPC זאת על ידי 10 כדי לקבל את הסכום הכולל של mTHPC בבאר אחת (במיקרוגרם, המייצג את ההשעיה תא 100 μl) ולחלק את הערך הזה בנפח של 20,000 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הנפח עם הנוסחה לתחום: (4/3 π x) xr 3. השג את הרדיוס r על ידי מדידת הקוטר של 20 תאים trypsinized תחת מיקרוסקופ, וחלוקת ערך זה על ידי 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לנרמל את כל הערכים לאלו שהושגו עבור תאי HOS לאחר 10 שעות של דגירה (ספיגה תלויה במינון) או מטופלים עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC (ספיגה תלויה בזמן), שנקבעו ל100%. </li></ol> 2. מדידה של phototoxicity של PS במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 3,000 תאים / היטב בצלחת 96 היטב (triplicates עבור כל ריכוז של mTHPC משומש) ולתת להם לדבוק בלילה. כמו כן להכין צלחת 96 היטב נוספת ולטפל בתאים כמתואר בהמשך, אבל אז לשים אותם בצד להדמיה בניגוד שלב. שים לב: המספר צריך להיות מותאם לכל שורת תא בודדת. Confluency של 50-60% בעת הניסוי הוא אידיאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכור להוסיף את שליטת הרעילות הכהה המתאימה של תאים לכל אחד מריכוזי mTHPC.se הם תאים שיהיה הודגרו בהעדר או הנוכחות של ריכוזים נבחרים של mTHPC, אבל לא יהיה מואר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוזים שונים של mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר) בהתאם לשורות התאים ו לשמור אותם בחושך במשך 5 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בסעיף 1.3.2 הערה: זמן הדגירה לפני התאורה תלויה בשורת התאים ועל PS בשימוש, ולכן מומלץ לבדוק את הריכוזים שונים ובנקודתי זמן שונות בניסויים נפרדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה לתקופה הזמן המצוינת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף בינוניים טרי חדש ללא mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר את התאים עם לייזר 652 ננומטר דיודה, ספציפי לספקטרום ספיגת mTHPC (ראה איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הלייזר ל21.88 mW / 2 סנטימטר כוח בגובה של 13.5 dista סנטימטרNCE מהתאים, על מנת לקבל את מנת אנרגיה של 5 J / 2 סנטימטר. להאיר את התאים ל230 שניות. אל להאיר את תאי שליטת רעילות הכהים (עם ובלי mTHPC). שים לב: תמיד להרכיב משקפיים כדי להגן על העיניים מפני אור הלייזר המשמש לעירור של PS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הארה, לשמור על התאים בחושך ב37 º C למשך 24 שעות. בהמשך לכך, להוסיף tetrazolium מסיס במים מגיב (WST-1) (10 μl/100 μl של מדיום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש שעות לאחר התוספת של המגיב WST-1, למדוד את הספיגה של בארות בודדות של צלחת 96 היטב ב415 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את אחוז התאים ששרדו, קבע את הממוצע של הערכים שהתקבלו עבור תאי mTHPC שאינו מטופלים עבור כל תנאי ל100% (המוארים כלומר, ללא mTHPC וnonilluminated, ללא mTHPC). </li></ol> 3. הערכה של מספר סלולרי על ידי ספירת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע 20,000 /ll בצלחת 24 גם ולתת להם לדבוק בלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור שעה 5 עם mTHPC (0.001, 0.003, 0.15, 0.6, ו1.25 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהאיר אותם כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המדיום, לשטוף את תאי פעם עם PBS, trypsinize אותם ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וresuspend התאים 200 μl של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים בתא נויבאואר. </li></ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
<li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li>
<li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li>
<li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li>
<li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li>
<li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li>
<li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysical+parameters%2C+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li>
<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
<li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li>
<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד עניינים.

כדי להשיג cytotoxicity האופטימלי בתגובה לPDT, זה הכרחי כדי לבחור את הגדרות לייזר אור הנכונות ובזמני דגירה. הנהלים שתוארו כאן הם עקביים ויעילים כדי לקבוע ספיגת PS ולכמת cytotoxicity PDT מושרה במבחנה. שימוש באורכי גל הקליטה הספציפי של mTHPC PS, ספיגת PS הסלולרית ניתן לקבוע באופן ישיר, וPS יכול להיות מופעל כדי ליצור מיני חמצן תגובתי ציטוטוקסיות. שימוש בהגדרה זו במבחנה, ניתן להתאים את כל הפרמטרים כג...

המצב של היום של טיפול האמנות של אוסטאוסרקומה (OS), גידול עצם עיקרי, כולל שילוב של כימותרפיה adjuvant הניאו וניתוח. משטר טיפול זה גילה עלייה בשיעור ההישרדות של חולים עם מחלה מקומית מכ 20% לפני השימוש בכימותרפיה, כדי כיום בין 60-70% 3, 4. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, ההישרדות הכוללת של חולים עם מחלת OS מקומית התייצבה 4, 5. יתר על כן, 30-40% מהחולים האלה להשנות תוך 3 שנים לאחר אבחון וחולים עם מחלה גרורתית ימשיכו להיות הישרדות עניות של 20-30% 4, 6, 7. כדי לשפר את התוצאה של חולים אלה, אסטרטגיות טיפוליות חדשות צריכים להיות מפותחות. טיפול פוטודינמי (PDT), טיפול נגד סרטן ולא רומן, משתמש באור באורך גל מסוים לעירור של photosensiTizer (PS), אשר מצטבר בתאים הסרטניים לאחר הזרקתה למחזור הדם. אור עירור הלייזר של PS מייצר רדיקלים בנוכחות החמצן, אשר לגרום לתגובה ציטוטוקסיות בתאים סרטניים ומוות של תאים. חוץ ממנגנון עיקרי זה, שני PDT נוסף עורר תהליכים ביולוגיים יתרמו לצמיחת גידול מופחתת: PDT גורם להתכווצות כלי דם והיווצרות קרישי דם על נימי הדם הזעיר וגידול, וכתוצאה מכך היפוקסיה מקומית ואנוקסיה בתוך הגידול, מה שמוביל לאוטם גידול. לבסוף, PDT נפצע ותאים סרטניים מתים לעורר תגובה חיסונית מקומית, תכונה ייחודית למדי של PDT. זה כולל את מערכת המשלימה והפעלה של אנטיגן הצגת תאים דנדריטים 8. לכן, תנאים שנוצרו להצגת אנטיגנים סרטניים עם ההפעלה הבאה של תאי הלימפה, מה שמובילים לחסינות ספציפית גידול. עד כה, PDT כבר בשימוש לטיפול בסוגים שונים של גידולים ברקמות רכים וhyperplאסיה של, כגון keratosis actinic, ושטו בארט, גידולי Endobronchial, סרטן שלפוחית ​​השתן, קרצינומה של תאים הבזליים, וטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר 2. הטיפול ידוע לגרום נמק בקנה מידה מקומי, גדול עם מעט תופעות לוואי בלבד, ולכן יש לו הפוטנציאל למיגור רקמת גידול באופן סלקטיבי. למרות יתרונות אלה, היישום של PDT נשאר מבחינה טכנית תובעני יותר מהממשל של תרופות כימותרפיות. על מנת להשיג יעילות מרבית, ריכוז PS, זמן חשיפה לאור וסך העברת אנרגיית אור צריך להיות מותאם. ניתן לעשות זאת בניסויי vivo, אבל, בגלל המספר הגדול היחסי של פרמטרים שצריכים להיות מותאמים, הוא יעיל יותר בהתחלה כדי לקבוע תנאים אופטימליים במבחנה. בניסויים שתוארו להלן, שבדקנו את היעילות במבחנה של PDT באמצעות CHL PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyphenyl)אורין, מקוצר mTHPC (איור 1 א). mTHPC הוא החומר הפעיל במוצר הרפואי Foscan, אשר משמש כיום במרפאת לטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר. זהו אחד נ.ב. החזק ביותר, גרימת נזק לתאים מסיביים כבר בריכוזים נמוכים, וזה הודגם להיות עדיף על PS האחר במונחים של רקמת חדירה 9, 10. ספקטרום בליעת האור שלו (איור 1) מראה שתי פסגות בולטות, אחד ב417 ננומטר ושני ב652 ננומטר, המשמשות ללוקליזציה רקמות של צבירת PS ולזירוז PDT, בהתאמה. נכון לעכשיו, ניסוח liposomal לmTHPC הוא בפיתוח. כאן, אנו מתארים את הנהלים לכמת את הספיגה של ניסוח liposomal זה, ולבצע PDT בשתי שורות תאי מערכת הפעלה אנושיות; HOS גרורתי הנמוך ותאי 143B גרורתי גבוהים. חלק מהנתונים שהוצגו כאן כבר דיווחו 11 קודם לכן. הגישת דואר המתוארת כאן מאפשרת לנו לחקור את ההשפעה של פנוטיפ גרורתי ביעילות PDT. 143B תאים, הזריקו orthotopically לגפיים האחורי של עכברי SCID חסרים חיסוניים לגרום לגידולי intratibial גרורות ראשוניים, מודל חיקוי המחלה הגרורה האדם באופן הדוק. לכן, בניסויים במבחנה המוצעים הם בצורה מושלמת מתאימים כדי להעריך את ההגדרות אופטימלי PDT להיות מאוחר יותר נעשה שימוש בניסויי in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH , פרייבורג, גרמניה</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH, פרייבורג, גרמניה</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי מושבת בחום</td><td>GIBCO, באזל, שוויץ</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH, ינה, גרמניה</td><td></td><td>מכיוון שהנוסחה הליפוזומלית הזו מקורה במחקר & D אין מספר קטלוגי זמין כרגע. מלאי: 1.5 מ"ג/מ"ל; מסופק בתערובת 9:1 של דיפלמיטואיל פוספטידילכולין (DPPC) ודיפלמיטואיל פוספטידילגליצרול (DPPG; >טוהר 99%)</td></tr><tr><td>Spectramax Gemini XS קורא צלחות</td><td>מכשירים מולקולריים, Sunnyvale, CA</td><td>ID# 861</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceralas PDT 652 nm לייזר</td><td>biolitec AG, Jena, גרמניה</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט טטרזוליום מסיס במים (WST)</td><td>Roche Diagnostics AG, רוטקרויץ, שוויץ</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה<em&gt; במבחנה</em

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

בשנים האחרונות, חל קושי במציאת טיפולים יעילים יותר נגד סרטן עם תופעות לוואי מערכתיים פחות. לכן הטיפול פוטודינמי הוא גישה חדשנית לטיפול סלקטיבית יותר גידול. טיפול פוטודינמי (PDT), שעושה שימוש בפוטוסנסיטייזר רעיל (PS), אשר, על הפעלה עם אור באורך גל מסוים בנוכחות חמצן, יוצר רדיקלים שיעוררו תגובה ציטוטוקסיות 1. למרות אישורה לפני כמעט עשרים שנה על ידי ה-FDA, PDT הוא כיום משמש רק לטיפול במספר מצומצם של סוגי הסרטן (עור, שלפוחית ​​השתן) ומחלות nononcological (פסוריאזיס, keratosis actinic) 2. היתרון העיקרי של השימוש בPDT הוא היכולת לבצע טיפול מקומי, המונע תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, היא מאפשרת טיפול בגידולים באתרים עדינים (למשל סביב עצבים או כלי דם). הנה, intraoperatיישום ive של PDT נחשב באוסטאוסרקומה (OS), גידול של העצם, כדי למקד את לוויני גידול ראשוניים נשאר מאחור בגידול רקמות לאחר כריתת גידול כירורגית. הטיפול שמטרתו להפחית את מספר הישנויות ולצמצם את הסיכון לגרורות (לאחר ניתוח). במחקר הנוכחי, אנו מציגים במבחנה נהלי PDT להקים הגדרות PDT אופטימליות לטיפול יעיל של שורות תאים בשימוש נרחב מערכת הפעלה המשמשות לשחזר את המחלה האנושית בעכברי מודל OS intratibial מבוססים היטב. הספיגה של mTHPC נ.ב. נבדקה בספקטרופוטומטר וphototoxicity היה עורר עם עירור אור הלייזר של mTHPC ב652 ננומטר כדי לגרום למוות של תאים הוערך עם assay WST-1 ועל ידי הספירה של תאים ששרדו. הטכניקות הוקמו תאפשר לנו להגדיר את הגדרות PDT אופטימליות למחקרים עתידיים במודלים של בעלי חיים. הם כלי קל ומהיר להערכת היעילות של טיפול פוטודינמי <em&gt; במבחנה לפני יישום in vivo.

בעזרת הטכניקות כאן דיווחו, אנחנו בדקנו PDT מבוסס mTHPC בתאי מערכת הפעלה אנושיים. ראשית, הספיגה תלויה בזמן ובמינון של mTHPC נחקרה בHOS גרורתי הנמוך ובשורות תאי 143B OS גרורתי מאוד. ספיגת mTHPC יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת הקרינה של mTHPC עם ספקטרופוטומטר הקרינה (איור 2, לשכפל באישור מריידי et al. 11). איור 2 א ממחיש את הספיגה של mTHPC באופן תלוי בזמן. עוצמת הקרינה של ההשעיה התא מייצגת את הרמות תאית של mTHPC. איור 2</s...

הפרוטוקול דיווח כאן מאפשר ההערכה של היעילות של טיפול פוטודינמי (PDT) בשורות תאים ואופטימיזציה של הגדרות PDT לפני יישום הטיפול במודלים של בעלי חיים.

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להראות את היעילות הציטוטוקסית של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה. זה מושג על ידי מדידה ראשונה של הספיגה התוך תאית של הרגישות לאור M-T-H-P-C על ידי תאי אוסטאוסרקומה. בשלב השני, אור לייזר מופעל על התאים כדי להפעיל את ה-M-T-H-P-C ולייצר רדיקלי חמצן ציטוטוקסיים.לבסוף, חילוף החומרים של התאים ומספר התאים נמדדים על ידי בדיקת טטרה אוליאום מסיס במים או WST אחד. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקת WST, כמו גם בספירת תאים ישירה, כדי למדוד את הציטוטוקסיות של הטיפול הפוטודינמי בתאי האוסטאוסרקומה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול באוסטאוסרקומה מכיוון שהיא מאפשרת מדידת יעילות הטיפול הפוטודינמי במבחנה ודומה לטכניקה המשמשת כיום בחולים.כדי להשוות את ספיגת ה-M-T-H-P-C בין שורות תאי אוסטאוסרקומה מתחילים בציפוי של 0.2 כפול 10 ל-Hoss השישי ו-143 תאי B לבאר. בטריפליקט בשש צלחות באר תן לתאים להיצמד למשך הלילה לשטף של 80 עד 90%, ולאחר מכן למחרת, דגר על התאים עם ריכוז קבוע של M-T-H-P-C לפרקי זמן שונים בחושך כדי להעריך את הספיגה התלויה בזמן של הרגישות לאור על ידי התאים. לאחר הדגירה, שאפו את המדיה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS, ואז נתקו את התאים עם 0.5 מיליליטר של טריפסין EDTA וספרו אותם.לאחר מכן, סובב את התאים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 400 פעמים G וטמפרטורת החדר. שאפו את המדיום והשעו מחדש את הגלולה ב- PBS לצפיפות סופית של פעמיים כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של 96.צלחת היטב ומדוד את הקרינה של התאים בספקטרופוטומטר פלואורסצנטי המוגדר לעירור של 417 ננומטר, ופליטה של 652 ננומטר. לאחר מכן הכינו עקומה סטנדרטית על ידי ציפוי של 100 מיקרוליטר של ריכוזי אפס עד ארבעה מיליגרם למיליליטר של M-T-H-P-C בשלוש עותקים. בצלחת 96 בארות ולמדוד את הקרינה כפי שהודגם זה עתה כדי ליצור עקומה סטנדרטית לחישוב יחידת הקרינה היחסית של כל תא המכיל באר מהלוח שנמדד קודם לכן.כדי למדוד את הפוטוטוקסיות של הרגיש לאור זרע תחילה 3000 תאים לבאר במשולש לכל ריכוז M-T-H-P-C בצלחת של 96 בארות, כולל תאי בקרת רעילות כהה לכל ריכוז PHOTOSENSITIZER. תנו לתאים להיצמד למשך הלילה לשטף של 50 עד 60% למחרת. דגרו על התאים עם טווח של ריכוזי M-T-H-P-C בחושך במשך חמש שעות לאחר הדגירה.שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS והוסיפו מדיה טרייה ללא M-T-H-P-C ואז ספציפיים לספקטרום הספיגה M-T-H-P-C, תוך לבישת הגנה מתאימה לעיניים. הגדר לייזר דיודה של 652 ננומטר להספק של 21.88 מילי-וואט לסנטימטר מרובע בגובה של 13.5 סנטימטרים. מרחק מהתאים כדי לקבל מנת אנרגיה של חמישה ג'אול לסנטימטר מרובע.לאחר מכן האירו את התאים למעט תאי בקרת הרעילות הכהים למשך 230 שניות לאחר ההארה. שמור את התאים בחושך על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של wst, מגיב אחד לכל 100 מיקרוליטר של מדיום שלוש שעות לאחר הוספת המגיב האחד למדוד את הספיגה של הבארות הבודדות ב -415 ננומטר.לבסוף, חשב את מספר התאים ששרדו בנוסף לבדיקת WST אחת. ספירה ישירה של התאים היא שיטה שנייה למדידת רעילות התאים. כדי לחשב את אחוז התאים הקיימאים, זרעו פעמיים 10 עד התאים הרביעיים לבאר ב -2 24 צלחות באר ותנו להם להיצמד למשך הלילה.למחרת דגרו על התאים במשך חמש שעות בחושך עם M-T-H-P-C והאירו אותם כפי שהודגם זה עתה. שמור על תאי בקרה כהים בחושך לאחר 24 שעות, אסוף את הסופרנטנט, שטוף את התאים פעם אחת עם PBS וטריפסין עיני הם לבסוף מסובבים את התאים ומשהים את הכדור ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי לספירה. התוצאות המוצגות בגרף זה מראות בפאנל העליון את הספיגה של M-T-H-P-C באופן תלוי זמן עם עוצמת הקרינה של תרחיף התא המייצגת את הרמות התוך תאיות של ה-M-T-H-P-C.בחלונית התחתונה. ניתן להעריך את ספיגת ה-M-T-H-P-C התלויה במינון על ידי מדידת הקרינה של M-T-H-P-C עם ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי. גרף זה ממחיש את הספיגה של ריכוז קבוע של M-T-H-P-C באופן תלוי זמן עם עוצמת הקרינה של תרחיף התא המייצגת את הרמות התוך תאיות של ה-M-T-H-P-C.בגרף זה מודגמת ספיגת M-T-H-P-C תלוית מינון ב-Haass ו-143 תאי B לאחר דגירה של חמש שעות. הספיגה בקו התאים הגרורתי הגבוה 143 B הייתה גבוהה משמעותית מאשר בקו התאים המארח ההורי הגרורתי הנמוך. מודגמת רעילות כהה תלוית מינון של תאי האוסטאוסרקומה.143 תאי B טופלו במינונים שונים של M-T-H-P-C והושוו לתאים שלא טופלו ונצפתה ירידה תלוית מינון של הפעילות המטבולית ומספר התאים שנמדדה על ידי בדיקה אחת. ירידה בכדאיות התאים זוהתה בריכוז M-T-H-P-C השווה וגבוה מ-2.5 מיקרוגרם למיליליטר. בגרף התחתון מודגמת הרעילות התלויה במינון של M-T-H-P-C.התאים טופלו במינונים שונים של M-T-H-P-C והארה לאחר מכן בחמישה ג'אול לסנטימטר רבוע. נצפתה ירידה בפעילות המטבולית של התאים כמו גם ירידה במספר התאים. פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן ליישם שיטות אלה על מודלים in vivo של אוסטאוסרקומה, כמו גם לחקירות פרה-קליניות אחרות.

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא שיטה לא פולשנית ולא ניתוחית לטיפול בסרטן ריאות. פוטוסנסיטיזרים מצטברים באופן סלקטיבי ברקמת הגידול ומובילים למוות תאי הגידול בנוכחות חמצן ואורך גל תקין של אור. בסרטון פרוטוקול זה, שיטה מבוססת PDT משמשת להערכת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר פוטנציאלי בתאי סרטן ריאות.

בדיקת פוטוטוקסיות חוץ גופית: שיטה מבוססת PDT להערכת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר בתאי סרטן ריאות

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא שיטה לא פולשנית ולא ניתוחית לטיפול בסרטן ריאות. פוטוסנסיטיזרים מצטברים באופן סלקטיבי ברקמת הגידול ומובילים למוות תאי הגידול בנוכחות חמצן ואורך גל תקין של אור. סרטון זה מתאר את ניתוח היעילות נגד גידולים in vivo באמצעות photoensitizer המכיל ננו-חלקיקים בעכבר נושא גידול, כדי לקבוע את הפוטנציאל הפוטוטוקסי של הפוטו-נסיטייזר.

In Vivo Antitumor Efficacy Analysis of PDT: טכניקה לקביעת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר בעכברים נושאי גידול

כאן, ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של תאי הגידול, בשילוב עם מודל ממברנה כוריו-אלנטואית של עובר עוף (CAM) של גרורות, משמשים להערכת מטרות/סוכנים אנטי-סרטניים חדשים על יכולתם לעורר רגישות לתאי גידול לכימותרפיה הפוגעת ב-DNA.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא בחירה חלופית לטיפול בסרטן ריאות. כדי להגביר את ההשפעה הטיפולית של PDT, פותחו ננו-חלקיקים ממוקדי סרטן ריאות בשילוב עם כימותרפיה. הן במבחנה והן ב-vivo הוערכו יעילות אנטי-סרטנית של PDT עם ננו-חלקיקים מוכנים.

יעילות אנטי סרטנית של טיפול פוטודינמי עם ריאות חלקיקים סרטן ממוקד

הזרקה ישירה של נגזר סרטן שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שמוביל התכנות של מח העצם תמיכה התקדמות הגידול; עם זאת, אילו תאים לתווך את האפקט הזה לא ברור. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לחקור בתיווך EV הגידול-mesenchymal תאי גזע (MSC) אינטראקציות ויוו, חשיפת תפקיד מכריע עבור EV משכילים MSCs ב גרורות.

דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

טיפול פוטודינמי (PDT) היא הליך רפואי הכרוך דגירה של אפלייד exogenously פוטוסנסיטייזר (PS) ואחריו photoactivation אור גלוי כדי לגרום אפופטוזיס. אנו מציגים במבחנה PDT פרוטוקול שנועדו לדמות PDT בהם ניתן ללמוד הבדלים PS הדגירה ופרמטרים טיפול קל.

גישה במבחנה טיפול פוטודינמי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקת תאי intratibia osteosarcoma כדי ליצור מודלים עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה אורתוטופית ונגעים גרורות ריאתיות.

הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות

כאן אנו מתארים מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מוצלח של מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT) תוך שימוש בתרבית תאי HeLa דו-ממדית וורטפורפין כפוטוסנסיטייזר.

מכשיר טיפול פוטודינמי מבוסס דיודה פולטת אור הבנוי בתוך הבית להגברת ציטוטוקסיות של חוליות במודל תרבית תאים דו-ממדית

פרוטוקול זה מציג סדרה של ניסויים שאומצו להערכת פפטידים אנטי-סרטניים הניתנים להחלפה, שניתן להשתמש בהם בסינון פרה-קליני של תרכובות כאלה. זה כולל הערכת ציטוטוקסיות בתרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות, הערכת יעילות פוטואיזומריזציה של רקמת מודל (ex vivo) ויעילות in vivo .

הערכה חוץ גופית ו-in vivo של תרכובות פעילות ביולוגיות מבוקרות - תרופות מועמדות פוטנציאליות לפוטופרמקולוגיה של סרטן

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה לביסוס מודל עכבר קסנוגרפט (PDX) הנגזר ממטופל באמצעות רקמת אוסטאוסרקומה אנושית.

הקמת מודל עכבר Xenograft שמקורו במטופל עם רקמות אוסטאוסרקומה אנושיות

חקור את היעילות הציטוטוקסית של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה. השיטה כוללת מדידת ספיגת הפוטוסנסיטייזר M-T-H-P-C והערכת שרידות התאים לאחר הטיפול באמצעות מבחן WST-1 וספירה ישירה.

ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה

גלה סרטונים נוספים