ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להראות את היעילות הציטוטוקסית של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה. זה מושג על ידי מדידה ראשונה של הספיגה התוך תאית של הרגישות לאור M-T-H-P-C על ידי תאי אוסטאוסרקומה. בשלב השני, אור לייזר מופעל על התאים כדי להפעיל את ה-M-T-H-P-C ולייצר רדיקלי חמצן ציטוטוקסיים.

לבסוף, חילוף החומרים של התאים ומספר התאים נמדדים על ידי בדיקת טטרה אוליאום מסיס במים או WST אחד. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בבדיקת WST, כמו גם בספירת תאים ישירה, כדי למדוד את הציטוטוקסיות של הטיפול הפוטודינמי בתאי האוסטאוסרקומה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול באוסטאוסרקומה מכיוון שהיא מאפשרת מדידת יעילות הטיפול הפוטודינמי במבחנה ודומה לטכניקה המשמשת כיום בחולים.

כדי להשוות את ספיגת ה-M-T-H-P-C בין שורות תאי אוסטאוסרקומה מתחילים בציפוי של 0.2 כפול 10 ל-Hoss השישי ו-143 תאי B לבאר. בטריפליקט בשש צלחות באר תן לתאים להיצמד למשך הלילה לשטף של 80 עד 90%, ולאחר מכן למחרת, דגר על התאים עם ריכוז קבוע של M-T-H-P-C לפרקי זמן שונים בחושך כדי להעריך את הספיגה התלויה בזמן של הרגישות לאור על ידי התאים. לאחר הדגירה, שאפו את המדיה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS, ואז נתקו את התאים עם 0.5 מיליליטר של טריפסין EDTA וספרו אותם.

לאחר מכן, סובב את התאים למשך חמש דקות בטמפרטורה של 400 פעמים G וטמפרטורת החדר. שאפו את המדיום והשעו מחדש את הגלולה ב- PBS לצפיפות סופית של פעמיים כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר. פיפטה 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של 96.

צלחת היטב ומדוד את הקרינה של התאים בספקטרופוטומטר פלואורסצנטי המוגדר לעירור של 417 ננומטר, ופליטה של 652 ננומטר. לאחר מכן הכינו עקומה סטנדרטית על ידי ציפוי של 100 מיקרוליטר של ריכוזי אפס עד ארבעה מיליגרם למיליליטר של M-T-H-P-C בשלוש עותקים. בצלחת 96 בארות ולמדוד את הקרינה כפי שהודגם זה עתה כדי ליצור עקומה סטנדרטית לחישוב יחידת הקרינה היחסית של כל תא המכיל באר מהלוח שנמדד קודם לכן.

כדי למדוד את הפוטוטוקסיות של הרגיש לאור זרע תחילה 3000 תאים לבאר במשולש לכל ריכוז M-T-H-P-C בצלחת של 96 בארות, כולל תאי בקרת רעילות כהה לכל ריכוז PHOTOSENSITIZER. תנו לתאים להיצמד למשך הלילה לשטף של 50 עד 60% למחרת. דגרו על התאים עם טווח של ריכוזי M-T-H-P-C בחושך במשך חמש שעות לאחר הדגירה.

שאפו את המדיום ושטפו את התאים פעמיים עם PBS והוסיפו מדיה טרייה ללא M-T-H-P-C ואז ספציפיים לספקטרום הספיגה M-T-H-P-C, תוך לבישת הגנה מתאימה לעיניים. הגדר לייזר דיודה של 652 ננומטר להספק של 21.88 מילי-וואט לסנטימטר מרובע בגובה של 13.5 סנטימטרים. מרחק מהתאים כדי לקבל מנת אנרגיה של חמישה ג'אול לסנטימטר מרובע.

לאחר מכן האירו את התאים למעט תאי בקרת הרעילות הכהים למשך 230 שניות לאחר ההארה. שמור את התאים בחושך על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של wst, מגיב אחד לכל 100 מיקרוליטר של מדיום שלוש שעות לאחר הוספת המגיב האחד למדוד את הספיגה של הבארות הבודדות ב -415 ננומטר.

לבסוף, חשב את מספר התאים ששרדו בנוסף לבדיקת WST אחת. ספירה ישירה של התאים היא שיטה שנייה למדידת רעילות התאים. כדי לחשב את אחוז התאים הקיימאים, זרעו פעמיים 10 עד התאים הרביעיים לבאר ב -2 24 צלחות באר ותנו להם להיצמד למשך הלילה.

למחרת דגרו על התאים במשך חמש שעות בחושך עם M-T-H-P-C והאירו אותם כפי שהודגם זה עתה. שמור על תאי בקרה כהים בחושך לאחר 24 שעות, אסוף את הסופרנטנט, שטוף את התאים פעם אחת עם PBS וטריפסין עיני הם לבסוף מסובבים את התאים ומשהים את הכדור ב-200 מיקרוליטר של מדיום טרי לספירה. התוצאות המוצגות בגרף זה מראות בפאנל העליון את הספיגה של M-T-H-P-C באופן תלוי זמן עם עוצמת הקרינה של תרחיף התא המייצגת את הרמות התוך תאיות של ה-M-T-H-P-C.

בחלונית התחתונה. ניתן להעריך את ספיגת ה-M-T-H-P-C התלויה במינון על ידי מדידת הקרינה של M-T-H-P-C עם ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי. גרף זה ממחיש את הספיגה של ריכוז קבוע של M-T-H-P-C באופן תלוי זמן עם עוצמת הקרינה של תרחיף התא המייצגת את הרמות התוך תאיות של ה-M-T-H-P-C.

בגרף זה מודגמת ספיגת M-T-H-P-C תלוית מינון ב-Haass ו-143 תאי B לאחר דגירה של חמש שעות. הספיגה בקו התאים הגרורתי הגבוה 143 B הייתה גבוהה משמעותית מאשר בקו התאים המארח ההורי הגרורתי הנמוך. מודגמת רעילות כהה תלוית מינון של תאי האוסטאוסרקומה.

143 תאי B טופלו במינונים שונים של M-T-H-P-C והושוו לתאים שלא טופלו ונצפתה ירידה תלוית מינון של הפעילות המטבולית ומספר התאים שנמדדה על ידי בדיקה אחת. ירידה בכדאיות התאים זוהתה בריכוז M-T-H-P-C השווה וגבוה מ-2.5 מיקרוגרם למיליליטר. בגרף התחתון מודגמת הרעילות התלויה במינון של M-T-H-P-C.

התאים טופלו במינונים שונים של M-T-H-P-C והארה לאחר מכן בחמישה ג'אול לסנטימטר רבוע. נצפתה ירידה בפעילות המטבולית של התאים כמו גם ירידה במספר התאים. פיתוח טכניקה זו סלל את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן ליישם שיטות אלה על מודלים in vivo של אוסטאוסרקומה, כמו גם לחקירות פרה-קליניות אחרות.