שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעביר ביעילות את הנוירוספרות כך שמגע בין תא לתא יישמר לאורך כל חיי התאים המתורבתים. טכניקה זו יוצרת תנאי התפשטות הנדרשים לתאי אב עצביים אנושיים. זה מושג על ידי שילוב של עד שתי צלוחיות T 1 75 מאותם תאים, והעברה לצינור חרוטי, המאפשר העברת הכדורים לצלחת פטרי כצעד שני המעובה לנוירוספירות תלויות למסה הניתנת לניהול על צלחת הפטרי, המאפשרת ללהב לחתוך את ה-H NPCs לאשכולות קטנים.

לאחר מכן, הנוירוספרות המועברות או הקצוצות מושהות מחדש על מנת להסיר את התאים מצלחת הפטרי ולהיכנס לתוך הצלוחיות החדשות. מתקבלות תוצאות המראות שטכניקת הקיצוץ מספקת אסטרטגיית צמיחה ארוכת טווח המבוססת על עקומות ההתפשטות המדגימות שיעורי צמיחה לוגריתמיים ארוכי טווח בהשוואה לתאים שעברו בגישה האנזימטית הסטנדרטית. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית ככדור.

קשה לתאר שלבי עיבוי בכתב. ישנם גם מספר טריקים שיסייעו בתהליך. אם המדיה העודפת לא תוסר במלואה מצלחת הפטרי, הכדורים פשוט יידחפו במדיה במקום להתפצל לאשכולות קטנים יותר.

התחל הליך זה על ידי התייחסות לצבע המדיה של הבקבוק של H NPCs. סרוק דרך הבקבוק תחת מיקרוסקופ כדי להתבונן בתאים. במידת האפשר, השתמש ברדיקל כדי לבחון את גודלם של מספר כדורים.

אם כדורים רבים בקוטר של 300 מיקרומטר ומעלה, המשיכו בתהליך הקיצוץ וקוצצים את התאים כל שבעה עד 10 ימים. לאחר מכן החזירו את הבקבוק לחממה והקימו את המסוק. הפעל את מתג ההפעלה של המסוק.

ב-BSC, הגדר את עובי הקיצוץ ל-200 מיקרומטר ואת כוח הלהב ל-180 מעלות או למצב השעה תשע. לאחר מכן, ודא שכפתור המהירות האוטומטי מסתובב נגד כיוון השעון ככל האפשר. לאחר מכן הזז את כפתור שחרור השולחן ימינה ככל האפשר, וודא שמחזיק הצלחת יציב.

סובב את מניפולטור הזרוע הידני בכיוון השעון כדי להרים את הזרוע לרמה המקסימלית שלה. לאחר מכן, העבירו באופן אספטי להב חיתוך פיפיות סטרילי על בורג זרוע המסוק. בעזרת זוג מלקחיים, הנח את האבזם מעל הלהב באמצעות המלקחיים.

החלק המעוקל של האבזם חייב להיות מעל הקצה העליון של הזרוע. לאחר מכן, החזק את האבזם על הזרוע והדק את האום על הבורג. כאשר נהג האגוז הסטרילי משאיר את האום רבע סיבוב משוחרר.

בהליך זה, העבר את הכמות המומלצת של אמצעי תחזוקה לבקבוק החדש. לאחר מכן העבירו את התאים באופן אספטי מהחממה ל-BSC. נשען את הבקבוק על מתלה צינורות ואפשר לכדורים להתיישב בבקבוק.

אחד התיישב. שואף עד 12 מיליליטר של סופרנטנט. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, יש לשטוף את כל הכדורים הדבוקים באופן רופף מעל פני הבקבוק.

חזור על הפעולה לפי הצורך ואפשר לכדורים להתיישב בין רנס. לאחר מכן, העבירו את הנפח המוצע של המדיה המותנית לבקבוק החדש. לאחר מכן העבירו את כל המדיה והכדורים המותנים הנותרים לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.

הניחו לכדורים להתיישב והשליכו את הבקבוק המשומש. לאחר מכן, העבירו לאט את התאים מהצינור החרוטי של 15 מיליליטר אל צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר או דיסק שיים בנפח הנמוך ביותר האפשרי. שמור את המדיה הממוזגת שנותרה מכיוון שהיא תשמש לשטיפת התאים מקציצת המנה לאחר הקצוץ.

נסו למזער את שטח הפנים המכוסה על ידי המדיה והכדורים על הצלחת. לאחר מכן, התחל לעבות את מאגר הכדורים על ידי העברת הסופר נאטין בחזרה לצינור החרוטי של 15 מיליליטר. הסר כמה שיותר מדיה מהחלק העליון של מאגר תאי המדיה עם מיקרו פיפטר עם קצה מחסום אירוסול.

עד שלא ניתן להסיר מדיה ללא כדורים, ואז פרשו את הבריכה. השתמש בצד של קצה הפיפטה כדי להגדיל את שטח הפנים, הטה מעט את צלחת הפפטה והשתמש בצד של קצה הפיפטה כדי להחליק בעדינות את כל הכדורים לצד אחד של הבריכה. לאחר שכל התאים הועברו מחדש, הטו לאט את צלחת הפטרי לכיוון ההפוך כדי לאפשר למדיה להיפרד מהכדורים.

לאחר מכן, העבר את המדיה הנקייה בחזרה לצינור החרוטי של 15 מיליליטר. השתמש בצד של קצה הפיפטה כדי להחליק בעדינות את כל הכדורים בחזרה למרכז צלחת הפטרי. אז הבריכה בקוטר של 0.5 עד 2.4 סנטימטרים.

חשוב לשמור על עומק בריכת הכדור רדוד. אם הבריכה עמוקה מדי, הכדורים יידחפו הצידה במהלך הקיצוץ. כעת, העבירו את צלחת הפטרי למחזיק הצלחת ואבטחו אותה מתחת לווים של מחזיק הצלחת.

השתמש בכפתור שחרור השולחן כדי להחליק את מחזיק הצלחת שמאלה כך שהלהב יהיה נקי מהכדורים וננעל בהילוכים. לאחר מכן, הורד את זרוע המסוק על ידי סיבוב כפתור המניפולטור הידני בכיוון השעון עד שהלהב נצמד שטוח על צלחת הפטרי. לחץ כלפי מטה על תושבת הזרוע תוך כדי הידוק האום.

לאחר מכן לחץ על כפתור האיפוס. לאחר ייצוב צלחת הפטרי ביד אחת תוך כדי סיבוב כפתור מניפולטור הזרוע האוטומטי בכיוון השעון למצב 90 מעלות או 12 והתחל לקצוץ כאשר כל הכדורים קצוצים. סובב את מחזיק הצלחת 90 מעלות.

לאחר מכן שחרר את הבורג, הורד את הזרוע והדק מחדש את האום. חזור על הליך הקיצוץ. לאחר מכן באופן אספטי, העבירו את צלחת הפטרי ממחזיק הצלחת לחלל עבודה ב-BSC.

העבירו מיליליטר אחד של מדיה מותנית על הכדורים הקצוצים. לאחר מכן השעו בעדינות והעבירו את הכדורים הקצוצים לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. נסו להימנע מהיווצרות בועות וחזרו על הפעולה כמה פעמים שצריך כדי לאסוף את הכדורים הקצוצים.

מדוד את עוצמת הקול של המדיה המותנית והכדורים הקצוצים. הוסף את הכמות המתאימה של אמצעי תחזוקה כדי להשיג את הנפח המוצע בטבלה השנייה עמודה E.לאחר מכן, Eloqua את מתלה הכדור לכל בקבוק חדש רק מעביר את מתלה הכדור לבקבוק אחד בכל פעם ומשעה מחדש את הכדורים בין העברות. הנפח הסופי בכל בקבוק צריך להיות שווה לנפח המוצע בטבלה השנייה עמודה F. הנח את ה-h NPCs הקצוצים בחממה.

איור זה מציג את מספרי התאים הצפויים של H NPCs שהוקפאו במעבר 19, ואז הופשרו והורחבו כחד-שכבה דביקה באמצעות דיסוציאציה אנזימטית בהשוואה לנוירוספרות שהועברו בשיטת הקיצוץ. להלן התמונות המייצגות של כדורים קצוצים מראש וקצוצים בהגדלה של פי 10. תמונה זו מציגה את מעבר ההפשרה 29 NPCs H שצופו במשך יום אחד ונצבעו לקן ולביטוי, בעוד שתמונה זו מציגה את מעבר ההפשרה 29 NPCs H שצופו במשך שבעה ימים בהיעדר גורמי גדילה וצבועים עבור GFAP ובטא שלוש טובולין.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקת הקיצוץ האוטומטית כדי להעביר HBCs, השומרת על מגע בין תאים לאורך כל חיי התאים והתרבות. ניתן להתאים הליך זה למספר רב של סוגי תאים, כגון תאי גזע עצביים שמקורם בתאים פלוריפוטנטיים או כדורי לב.