Name: שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: למד שיטת חיתוך מכנית להרחבת כדוריות עצביות אנושיות תוך שמירה על מגע תא-לתא. טכניקה זו תומכת בגדילה לוגריתמית לטווח ארוך מעל 40 מסעות ללא פירוק אנזימטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר Soshana סוונדסן לביקורת ועריכת דוח זה קריטי. עבודה זו תרמה לעל ידי NIH / NINDS 1U24NS078370-01 וCIRM DR2A-05,320.

יש המחברים אין לחשוף.

<img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. חיתוך סכמטי. הרחבת תאי גזע אליפטית / אב בתרבות בשיטת החיתוך המכני. שלבים קריטיים סקירה של הפרדיגמה הרחבת הקיצוץ מוצגת באיור 6. גודל כדור hNPC הוא אחד הקריט...

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed.

Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

יש היסטוריה של הרחבת תאי גזע עצביים מכרסמים בתרבות כמו גם monolayer 1-3 או 4-7 neurospheres המצרפי ארוכה. בנוסף, תאים אנושיים ותאים עצביים (hNPCs) מבודדים מאזורים השונים של מערכת העצבים המרכזית מתפתחת 8-17 הורחבו במבחנה. תאים אלה הם דו עוצמה, מסוגל להבדיל לשני האסטרוציטים ונוירונים והיה כלי שימושי מאוד בלימוד התפתחות עצבית 18,19 ו20,21 מנגנון מחלה. hNPCs גם הושתל לתוך מודלים של בעלי חיים רבים ושונים של מחלות מערכת עצבים מרכזיות עם רמות משתנות של אינטגרציה, הישרדות והשפעות פונקציונליות 22-24. באופן מסורתי, מכרסם או NPCs נגזר עוברי האנושי חשופים לגורמי גדילה - גורם לעתים קרובות אפידרמיס צמיחה (EGF) ו / או גידול פיברובלסטים גורם-2 (FGF-2) 25-28 - ושניהם 29 חסיד ושלושהמערכות אליפטית ממדיות בדרך כלל passaged באמצעות ניתוק האנזימטית לתוך השעיה תא בודד 30-34. השיטה סטנדרטית להרחבת תאים למחקר או לשימוש קליני היא כmonolayer חסיד בשל מניפולציה קלה. עם זאת, יש לנו הראינו כי hNPCs monolayer passaging וneurosphere עם האנזימטית או תמיסות כימיות הביאה להזדקנות המוקדמת 35. בנוסף, דיסוציאציה האנזימטית עלולה לגרום לרמות מוגברות של מומים בידול וkaryotypic מבוססים על נתונים הפגינו עם תאי גזע עובריים 36-38. למרות שהשיטה סטנדרטית של hNPCs passaging הפיקה בפועל ייצור טוב הנוכחיים מוצרי כיתה (cGMP) שהושקעו בשלב 1 בניסויים קליניים (בתאי גזע Inc, Neuralstem Inc), השיטה מותר רק כמה סיבובים של הגברה תא, המגביל את בנקאי פוטנציאלי. ברור, ניסויי מחקר גדולים וניסויים קליניים בעתיד יכולים להפיק תועלת מהיכולתלהפיץ תאים בכמויות גדולות ועם הזדקנות מתעכבת כדי לאפשר צמיחה בקנה מידה גדולה ובבנקאות סלולרי. כדי לענות על צורך זה, פיתחנו רומן ודרך אוטומטית של neurospheres שלמות מכאנית passaging ידי &quot;לקצוץ&quot; אותם לקבוצות קטנות כדי לשמור על קשר תא אל התא. בשיטה זו גדלה מאוד תרבות תוחלת החיים 39 והשעיה שלהם מאפשרת שימוש יעיל יותר של שטח חממה בהשוואה לתרבויות monolayer, כפי שניתן לראות בשיטת תרבות bioreactor 3D אלטרנטיבית 40. פרוטוקול הקיצוץ בתנאי מאפשר לייצור של בנקים בקנה מידה גדולה ממדגם העובר אחד גדול יותר ממעבר 10, הישג סביר בשיטות passaging סטנדרטיות. בעוד ששיטה זו לhNPCs passaging היא בלתי שגרתית, הוא גדל ב פופולריות והיה לאחרונה, שפורסם עם סוגי תאים אחרים כגון תאי גזע עצביים שמקורם עוברי אנושי ותאי גזע pluripotent מושרה, המאפשרים התרחבות בקנה מידה גדולה עבור יישומים שונים, כולל בvדוגמנות המחלה itro 41-46. חשוב מכך, בנק תאים בדרגת cGMP hNPC כבר הופק בשיטת החיתוך, הוכחת כי הטכניקה יכולה להיות מיושמת כלפי יישומים קליניים בעתיד.

<table><tbody><tr><td>, 50 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית, Class II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>4 רגל או 6 רגל דגם.&nbsp; דגם 6 רגל מומלץ; מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>להבים, Double-edge Prep</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>מספר יצרנים/ספקים.&nbsp; זהירות:</td></tr><tr><td>מדיה להקפאת תאים</td> חדים <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO,</td></tr><tr><td>צנטריפוגה ללא סרום, דלי נדנדה עם תוספות 15 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים, 15 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים, 50 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>מספר יצרנים/ ספקים</td></tr> קצב <tr><td>מבוקר מקפיא</td><td>פלנר</td><td>Kryo 750</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>Cryovials, 2 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430488</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>בקבוק תרבות, מאוורר, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>בקבוק תרבות, מאוורר, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>בקבוק תרבות, מאוורר, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>בקבוק תרבות, מאוורר, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>מסנן, 0.22 ומיקרו; m, מצורפת, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>מסנן, 0.22 ומיקרו; m, מצורפת, 150 מ"ל</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>מסנן, 0.22 ומיקרו; m, מצורפת, 500 מ"ל</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>מסנן, 0.22 ומיקרו; m, מצורפת, 50 מ"ל</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>נייר סינון, 8.5 ס"מ עיגולים</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים, דפוס סטנדרטי - משונן/מעוקל/18 ס"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>תא הקפאה, איזופרופיל אלכוהול</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>אינקובטור, 37 & deg; C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 סדרה</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>Hemacytometer, Phase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>McIlwain קוצץ רקמות</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD</td><td>&nbsp; נדרש שינוי צלחת פטרי.&nbsp; &nbsp; זהירות:&nbsp; להב נע וחד.</td></tr><tr><td>מיקרופיפטור 1-10 ו-mu; l</td><td>גילסון</td><td>F144562</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>Micropipettor, 100-1,000 &mu; l (ערכת התחלה)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>Micropipettor, 2-20 &mu; l (ערכת התחלה)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>Micropipettor, 20-200 &mu; l (ערכת התחלה)</td><td>גילסון</td><td>F167700</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>Nutdriver, ניתן לחיטוי, 5/16 אינץ'</td> <td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>פיפט פסטר, Fisherbrand מחובר כותנה</td><td></td><td>13-678-8B</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, זכוכית, חיטוי</td><td>קורנינג</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>פיפט אייד</td><td>דראמונד</td><td>4-000-101</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>דיסק שים</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>משתנה</td><td>מספר יצרנים/ספקים טיפים</td></tr><tr><td>לפיפט מחסום סטרילי, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>טיפים לפיפט מחסום סטרילי, 1,000 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>טיפים לפיפט מחסום סטרילי, 20 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>טיפים לפיפט מחסום סטרילי, 200 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות סטריליות, ניילון נצמד, 10 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>13-676-10J</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות סטריליות, עטיפת פלסטיק, 2 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>13-675-3C</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות סטריליות, ניילון נצמד, 25 מ"ל</td><td>פישרברנד</td><td>13-676-10K</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות סטריליות, עטיפת פלסטיק מלאה, 5 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>שקיות עיקור, 19 x 33 ס"מ</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>מסננת, 40 ומיקרו; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות, 60 מ"מ</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>מתלים צינורות, משתלבים ארבעה כיוונים</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>אב עצבי עיבוד ספציפי לתאים ריאגנטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע עצביים מדיום הרחבה (קו גבעול)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3194-500ML</td><td>חשוב להשתמש במותג Stemline</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה אנושית רקומביננטית (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>טריפאן כחול (0.4%)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8154-100ML</td><td>מספר יצרנים/ספקים</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td> <td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת הרחבת cgmp-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

טכניקת הרחבת תא לצבור מספר גדול של תאים מדגימה אחת עבור ניסויי מחקר וניסויים קליניים תרוויח הקהילה בתאי גזע באופן משמעותי. שיטות הרחבה הנוכחיות רבות מייגע ויקרות, ואלה הקשורים ניתוק מוחלט עלולים לגרום לכמה סוגי גזע ותאים ובתאים לעבור התמיינות או הזדקנות מוקדמת. כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו שיטת passaging מכאנית אוטומטית המכונה &quot;קיצוץ&quot; כי הוא פשוט ולא יקר. טכניקה זו מונעת ניתוק כימי או אנזימטי לתאים בודדים, ובמקום זאת מאפשרת להרחבה בקנה מידה גדולה של תרבויות מושעים, אליפטית, כי לשמור על קשר עם תא / תא קבוע. שיטת הקיצוץ יש בעיקר נעשתה שימוש בתאים עובריים שמקורם במוח עצבי אב או neurospheres, ולאחרונה יצאה לאור לשימוש בתאי גזע עצביים שמקורם בתאי גזע pluripotent עובריים ומושרים. Involv ההליךes זריעת neurospheres על גבי צלחת פטרי תרבית רקמה ולאחר מכן עובר להב חד, סטרילי דרך תאי יעילות אוטומציה של התהליך המייגע של ידני מכאני מתנער בכל תחום. השעיית תאים בתרבית מספקת יחס שטח לנפח חיובי פני השטח; כפי שניתן גדלו מעל 500,000 תאים בתוך neurosphere אחד של פחות מ 0.5 מ&quot;מ קוטר. בבקבוק T175 אחד, מעל 50 מיליון תאים יכולים לגדול בתרבויות השעיה לעומת רק 15 מ&#39;בתרבויות חסיד. חשוב מכך, הליך הקיצוץ נעשה שימוש בפרקטיקת ייצור טוב הנוכחית (cGMP), המאפשר ייצור כמות המוני של מוצרי תא כיתה קלינית.

<img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> מספרים סלולריים איור 5. נציגי נתונים.) תחזית של hNPCs הקפוא ב p19, ולאחר מכן הפשירו והתרחבו כmonolayer חסיד באמצעות ניתוק האנזימטית בהשוואה לneurospheres passaged באמצעות שיטת החיתוך. יום 0 מייצג כאשר התאים היו מופשרים בp20. ב &#39;) נציג תמונות של תחומים מראש לקצוץ, 10X. C) נציג תמו...

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך מכאנית רומן המאפשרת ההתרחבות של אגרגטים גזע ותאים אב עצביים כדוריים ללא ניתוק להשעית תא בודד. שמירה על קשר תא / תא מאפשרת צמיחה מהירה ויציבה במשך 40 מעברים.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מעבר (passage) יעיל של הנוירוספירות, כך שמגע בין תא לתא יישמר לאורך כל תקופת חייהם של התאים המטופחים. טכניקה זו יוצרת תנאי הרחבה הנדרשים עבור תאי אב עצביים אנושיים. דבר זה מושג על ידי שילוב של עד שני בקבוקי T 1 75 של אותם תאים, והעברתם לשפופרת קונית, מה שמאפשר את העברת הספירות לצחנת פטרי כשלב שני, המרכז את הנוירוספירות התלויות למסה ניתנת לניהול על צחנת הפטרי, דבר המאפשר ללהב לחתוך את ה-H NPCs לצבירים קטנים.בשלב הבא, הנוירוספירות שעברו מעבר או קיצוץ מושחיתות מחדש כדי להוציא את התאים ממעט של פטרי ולהעבירם לבקבוקי תרבית חדשים. התוצאות המתקבלות מראות כי טכניקת הקיצוץ מספקת אסטרטגיית גידול לטווח ארוך, כפי שעולה מעקומות ההתרחבות המדגימות קצבי גדילה לוגריתמיים לטווח ארוך בהשוואה לתאים שעברו מעבר בגישה האנזימטית הסטנדרטית. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית עבור הספירה.שלבי העיבוי קשים לתיאור בכתב. קיימים גם מספר טריקים המסייעים בתהליך. אם עודפי מדיום לא יוסרו לחלוטין מפתחרי פטרי, הספירות פשוט יידחפו בתוך המדיום במקום להתפצל לצב soon קטנים יותר.יש להתחיל את הפרוצדורה בבדיקת צבע המצע של הבקבוק המכיל H NPCs. סרקו את הבקבוק תחת מיקרוסקופ כדי לתבונן בתאים. במידת האפשר, השתמשו בסימן רדיקלי כדי לבחון את גודלן של מספר ספירות.אם לספירות רבות יש קוטר של 300 micrometers ומעלה, המשיכו בתהליך הקיצוץ וקצצו את התאים מדי שבעה עד 10 ימים. לאחר מכן, החזירו את הבקבוק למדגרה והכינו את מכשיר הקיצוץ. הפעילו את מתג החשמל של מכשיר הקיצוץ.בתוך ה-BSC, הגדירו את עובי הקיצוץ ל-200 micrometers ואת כוח הלהב ל-180 מעלות או למצב השעה תשע. לאחר מכן, ודאו שכפתור המהירות האוטומטי מסובב נגד כיוון השעון עד הסוף. לאחר מכן העבירו את כפתור שחרור השולחן ימינה ככל האפשר, וודאו שתושבת הפלטה יציבה.סובב את זרוע המניפולטור הידנית עם כיוון השעון כדי להרים את הזרוע למפלס המקסימלי שלה. לאחר מכן, העבר באופן אספטי להב קיצוץ סטרילי בעל שני קצוות אל בורג זרוע הקיצוץ. באמצעות פינצטה, הנח את התפס מעל הלהב.החלק המעוקל של התפס חייב להיות מעל הקצה העליון של הזרוע. לאחר מכן, החזיקו את התפס על הזרוע והדקו את האום על הבורג. בעזרת מברג האומים הסטרילי, השאירו את האום רפוי ברבע סיבוב.בפרוצדורה זו, העבירו את הכמות המומלצת של מצע תחזוקה אל הבקבוק החדש. לאחר מכן, העבירו באופן אספטית את התאים מהאינקובטור אל ה-BSC. הישענו את הבקבוק על מעמד מבחנות והמתינו עד שהספרואידים ישקעו בבקבוק.לאחר שהמשקע שקע, שאבו עד 12 milliliters של supernatant. בעזרת פיפט סרולוגית של 10 milliliters, שטפו את כל הכדורים שאינם נאחזים היטב מפני השטח של הבקבוק.חזור על הפעולה לפי הצורך ואפשר לכדורים לשקוע בין השטיפות. לאחר מכן, העבר את הנפח המומלץ של המדיום המותנה לבקבוק החדש. לאחר מכן העבר את כל שארית המדיום המותנה והכדורים לשפופרת קונית חדשה של 15 milliliter.המתינו עד שהספרואידים ישקעו והשליכו את הבקבוק המשומש. לאחר מכן, העבירו באיטיות את התאים מהמבחנה הקונית בנפח 15 milliliter אל פיתרי של 60 millimeter או לדיסק shim בנפח הנמוך ביותר האפשרי. שמרו את המצע המותנה שנותר, שכן הוא ישמש לשטיפת התאים מהצלחת לאחר תהליך הקיצוץ.נסו למזער את שטח הפנים המכוסה על ידי המצע והספירות בצלחת. לאחר מכן, התחילו בריכוז מאגר הספירות על ידי העברה של הנוזל העליון בחזרה לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. הסירו כמה שיותר מצע מחלקו העליון של מאגר תאי הספירות באמצעות מיקרופיפטור בעל טיפ עם מחסום אירוסול.עד שלא ניתן יהיה להסיר את המדיום ללא הכדורים, פזרו את התערובת. השתמשו בצד של טיפ המטפטה כדי להגדיל את שטח הפנים, הטו מעט את צלחת הפטרי והשתמשו בצד של טיפ המטפטה כדי להחליק בעדינות את כל הכדורים לצד אחד של התערובת. לאחר שכל התאים הועברו, הטו לאט את צלחת הפטרי לכיוון ההפוך כדי לאפשר למדיום להיפרד מהכדורים.לאחר מכן, העבירו את המדיום המנוקה בחזרה לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. השתמשו בדופן קצה הפפיטה כדי להחליק בעדינות את כל הכדורים בחזרה למרכז צלחת הפטרי, כך שקוטר השלולית יהיה 0.5 עד 2.4 סנטימטרים.חשוב לשמור על עומק נמוך של בריכת הכדוריות. אם הבריכה תהיה עמוקה מדי, הכדוריות יידחקו הצידה במהלך הקיצוץ. כעת, העבירו את צלחת הפטרי למחזיק הצלחות ואבטחו אותה תחת וויי מחזיק הצלחות.השתמש בכפתור שחרור השולחן כדי להחליק את תפס הפלטה שמאלה, כך שהלהב יהיה רחוק מהספירות ונעול במקומו. לאחר מכן, הורד את זרוע הקוצץ על ידי סיבוב כפתור המניפולטור הידני עם כיוון השעון, עד שהלהב ייסגר בנקישה באופן שטוח על על פני צלחת הפטרי. לחץ מטה על תושבת הזרוע תוך כדי הידוק האום.לאחר מכן לחצו על כפתור האיפוס. ברגע שהמערכת יציבה, החזיקו את פטריית הפטרי ביד אחת תוך סיבוב כפתור המניפולטור של הזרוע האוטומטית עם כיוון השעון ל-90 מעלות או למצב השעה 12, והתחילו בקיצוץ; הפסיקו כאשר כל הכדורים קוצצו. סובבו את מחזיק הצלחת ב-90 מעלות.לאחר מכן שחררו את הבורג, הורידו את הזרוע והדקו שוב את האום. חזרו על תהליך הקיצוץ. לאחר מכן, העבירו באופן אספטי את צלחת הפטרי מתושבת הצלחות אל מרחב העבודה ב-BSC.העבירו 1 ml של מצע מותנה (conditioned media) אל הספירות הקצוצות. לאחר מכן, השעיו בעדינות והעבירו את הספירות הקצוצות לשפופרת קונית חדשה בנפח 15 ml. השתדלו להימנע מיצירת בועות וחזרו על הפעולה מספר הפעמים הדרוש כדי לאסוף את כל הספירות הקצוצות.מדדו את נפח המצע המותנה (conditioned media) והספירות הקצוצות. הוסיפו את הכמות המתאימה של מצע תחזוקה כדי להגיע לנפח המוצע בטבלה 2, עמודה E. לאחר מכן, העבירו את תרחיף הספירות לכל בקבוק חדש; העבירו את תרחיף הספירות לבקבוק אחד בכל פעם וערבבו מחדש את הספירות בין ההעברות. הנפח הסופי בכל בקבוק צריך להיות שווה לנפח המוצע בטבלה 2, עמודה F. הניחו את ה-h NPCs הקצוצים באינקובטור.איור זה מציג את מספרי התאים החזויים של H NPCs שהוקפאו במעבר 19, ולאחר מכן הופשרו והורחבו כשכבה הדבקה (monolayer) באמצעות דיסוציאציה אנזימטית, בהשוואה לנוירוספירות שעברו מעבר בשיטת הקיצוץ (chopping method). להלן תמונות מייצגות של ספירות לפני קיצוץ ואחרי קיצוץ בהגדלה של 10x. תמונה זו מציגה H NPCs שהופשרו במעבר 29, אשר נזרעו למשך יום אחד ונצבעו ל-nest וביטוי, בעוד שתמונה זו מציגה H NPCs שהופשרו במעבר 29, אשר נזרעו למשך שבעה ימים ללא גורמי גדילה ונצבעו ל-GFAP ו-beta three tubulin.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בטכניקת הקיצוץ האוטומטית להעברה (passage) של HBCs, השומרת על מגע בין תאים לאורך כל חיי התאים והתרבית. ניתן להתאים פרוצדורה זו למגוון רחב של סוגי תאים, כגון תאי גזע עצביים המופקים מתאים פלוריפוטנטיים או קרדיוספירות (cardiospheres).

a-cgmp-applicable-expansion-method-for-aggregates-human-neural-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

סרטון זה מדגים את הדור של תאי אב עצביים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים ומהונדסים. hPSCs מתמיינים לתאי אב עצביים באמצעות מדיום התמיינות עצבי. בעוד התמיינות מושרית בתאים שאינם טרנסגניים באמצעות מולקולות קטנות, hPSCs טרנסגניים מתמיינים על ידי הוספת אנטיביוטיקה המשרה את המקדם עבור גורם שעתוק ספציפי התמיינות עצבית.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים לתאי אב עצביים

הליך זה מניב נוירונים telencephalic על ידי עובר מחסומים שדומים לאלו שנצפו בהתפתחות האנושית. התאים מותרים באופן ספונטני כדי להבדיל, חשופים לגורמים שדוחפים אותם לכיוון השושלת העצבית, מבודדים, ומצופים על coverslips כדי לאפשר בידול מסוף והתבגרות.

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Organoids מוחי לייצג מערכת מודל חדש לחקור מוקדם המוח האנושי לפיתוח במבחנה. מאמר זה מספק את המתודולוגיה מפורט לייצר ביעילות organoids הומוגנית מסוג הקדמי הגבי מתאי גזע pluripotent המושרה האנושי כולל שלבים קריטיים איפיון ואימות.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

כאן אנו מציגים את שיטת מודל אנושי במבחנה של פציעה מתיחה בתבנית 96-ובכן בציר הרלוונטי לפגיעה טראומה. זה כולל שיטות בדיית לוחות מתיחה, לכימות את העלבון מכני culturing, ופצעו תאים, הדמיה, ניתוח תוכן גבוהה לכמת פגיעה.

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאי עצב פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים בביוריאקטור תרחיף תלת-ממדי של ספסל.

ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

למד שיטת חיתוך מכנית להרחבת כדוריות עצביות אנושיות תוך שמירה על מגע תא-לתא. טכניקה זו תומכת בגדילה לוגריתמית לטווח ארוך מעל 40 מסעות ללא פירוק אנזימטי.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

גלה סרטונים נוספים