Name: ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: חקור ביטוי גנים חולף בצמחי טבק באמצעות הרכבת גיבסון והאקדח הגן. השיטה מאפשרת מיקוד לכלורופלסטים ופרוקסיזומים ללא שימוש באנזימי חיתוך, עם ויזואליזציה במיקרוסקופ קונפוקלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות לג&#39;ן שין של בית החולים כלליים מסצ&#39;וסטס לתרומה הנדיבה של שתילי Nicotiana benthamiana. ג&#39;ן בוש עזר לנו מאוד בייעוץ בגידול צמחים והקמת אזור חדר צמיחה. טום פראנטה של ​​מכון Wyss הציעה את העזרה מכרעת עם מיקרוסקופיה confocal. המחברים מבקש להודות במיוחד לדון אינגבר של בית החולים לילדים בבוסטון ומכון Wyss לתרומתו הנדיבה של אקדח גן והציוד נלווה. מימון לפרויקט זה סופק באמצעות הסכם שיתוף פעולה עם משרד אנרגיה של סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם (ARPA-E פרס # DE-000,079) לPAS, JCW, וMDM, ובאמצעות Chimerion ביוטכנולוגיה, Inc לMJV.

1. עיצוב של רצפים לחלופין-איחו לאברון מרובה מיקוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את האתרים לביטוי חלבון סופי. לעבודה זו, העניין הוא במיקוד הכלורופלסט, peroxisome, וcytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בספרות כדי לזהות רצפי חלבונים ו-DNA הידועים למקד חלבונים לאברונים של עניין. במקרה זה הכלורופלסט מיקוד רצף מmethyltransferase L-isoaspartate thaliana ארבידופסיס 6,15, וperoxisome מיקוד רצף מthaliana ארבידופסיס synthase S-אלנטואין כמו transthyretin-16,17 נקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את משטר שחבור-חלופי שצריך למקד את החלבונים המעניינים את האברונים הנכונים. עבור עבודה זו, אחוי אתרים כפי שנצפה במערכת ארבידופסיס טבעית 6. רצף ה-mRNA מחדש עוזב את אתרי אחוי הטבעיים, אבל רצפים הונחו peroxis הכלורופלסט או קידודשת מיקוד תגים בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1). </li></ol> 2. עצרת גיבסון של חלקי DNA ראה גם איור 2. שיטת ההרכבה גיבסון תלויה בפעולה של אנזימים שונים בתמהיל שהוכן מראש, ל1) בחלקו לעכל את הקצוות של גדילי הדנ&quot;א של פעמיים כדי להפוך את הגדילים יחיד ו2) זוגות בסיסים חינם לחשל שכני חלקי DNA. זה מאפשר לשיבוט של שברי DNA ללא מגבלות של אתרי הגבלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר על מנת שהאלמנטים במבנה פלסמיד דנ&quot;א. כדוגמא יש TriTag-1 אלמנטים של: א) וקטור פלסמיד (נקבובית, המכיל מבנה GFP הידוע לעבודה במפעלים, סמן התנגדות kanamycin, ומקורותיה של שכפול ל, E. coli ו Agrobacterium tumefaciens מארחים) ב) רצף אמרגן, (P ENTCUP2, הוצג להיות מכוננים בצמחים), ג) הכלורופלסט מיקוד רצף (CTS), ג) peroxisome סדרה של אתרי אחוי כפי שתואר לעיל 6 מיקוד רצף (PTS), וד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את הבסיס לבסיס המבנה עם בתוכנות עיצוב סיליקו. הקוף הוא חבילת תוכנה חופשית בקוד פתוח שימושית עבור עבודה זו. הערה: TriTag-1, יש לו את הסדר: וקטור פלסמיד, אמרגן, ATG, אתר אחוי תורם, רצף יעד הכלורופלסט, אתר תורם אחוי, באתר ניטראלי, אתר acceptor אחוי, רצף יעד peroxisome, אתר acceptor אחוי, ה-GFP ככלול בוקטור פלסמיד . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב בסיליקון ומבנה ה-DNA כזה שיש חפיפה 50 BP-בין כל חתיכה בעת הזמנת פריימרים עבור ה-PCR. אפשר להשתמש בחפיפת 50 נ&quot;ב כפריימרים: 25 נקודות בסיס לכל כיוון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לעקוב אחר מקורו של כל אחד מהחלקים ברצף. האם זה כמו: פלסמיד להיות מבוגרים וminiprepped; רצף ליניארי שניתן להשתמש בו כתבנית PCR; או רצף שצריך להיותמסונתז באופן מסחרי? מספר חברות מציעות שירותי סינתזת דנ&quot;א בעלות נמוכה עבור ברים &lt;500 נ&quot;ב. במקרה זה, TriTag עצמו הוא 437 נ&quot;ב אז זה היה יתרון להזמין אותו באופן מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאות הטובות ביותר תגיע אם כל המקטעים הנן PCR מוגברים ומטוהרים מתבנית ה-DNA שלהם. סמן ההתנגדות הוא מקום טוב כדי לחלק את ה-DNA הזה הגדול לשתי תבניות קטנות יותר, כי הם יותר בקלות מוגברת-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזים הגבלת הגבלת DpnI חותך DNA מפוגל. אם תבנית PCR הייתה miniprep מE. coli, טיפול DpnI יסיר את תבנית ה-DNA המזהמת. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל רצפי DNA בנפרד וelute במים, TE או הצפת EB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק וקטור נקבובית 1, ~ 3,000 BP (חיצים ירוקים). PCR מוגבר וDpnI טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור נקבובית חלק 2, ~ 3,000 BP (חיצים שחורים). PCR מוגבר וDpnI טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TriTag להוסיף, 437 נ&quot;ב (חיצים כחולים). הזמין באופן מסחרי. Resuspend בDDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמרגן ENTCUP P, ~ 750 נ&quot;ב (חצים כתומים). PCR מוגבר וDpnI טופל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הריכוזים של כל אחד מחלקי ה-DNA. לשאוף 150 ng / μl של חתיכות הווקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של תמהיל ההרכבה גיבסון מהמקפיא ולהפשיר על קרח. זה זמין מסחרי, אלא גם פשוט לעשות במעבדה של 12-14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישנם שני שלבים למתכון הזה: תערובת צמיגה 5x אב ו15 aliquots 1.33x תגובה בגודל μl. מיקס מאסטר 5x מכיל: 3 מיליליטר 1 M טריס-HCl pH 7.5, 300 μl 1 M MgCl 2, 600 μl 10 מ&quot;מ של כל dNTP, 300 μl 1 M DTT, 1.5 גרם PEG-8000, 20 NAD מ&quot;ג, וDDH 2 O ל 6 מיליליטר. הכן 320 aliquots μl (18) ולהקפיא את כולם מלבד אחד ב -20 ° C. הפתרון יהיה די צמיג. תווית &quot;חיץ איזותרמה 5X&quot; אלה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחד שנותר (320 μl), להוסיף 1.2 μl T5 exonuclease, 20 μl Phusion גבוהה FIDelity DNA פולימראז, 160 תקי DNA אנזים μl וDDH μl 700 2 O. הכן 15 aliquots μl (~ 80) על קרח בצינורות PCR ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע כרכים בסכומים equimolar של כל אחד מהקטעים. יש כמה מחשבונים באינטרנט, ובכלל זה Gibthon.org. לא צריך להיות בסך הכל 5 μl של כל חתיכות ה-DNA. הוסף אותם לμl 15 גיבסון לערבב aliquot. אם זה דורש נפחים קטנים מדי לפיפטה, לדלל את שברי DNA ו / או להשתמש aliquot יותר מאחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשכח להכין את שליטה של ה-DNA הווקטור בלבד (למשל חלק DNA המכיל את סמן עמידות לאנטיביוטיקה) ומרכיב את עוצמת הקול עם מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינורות בCycler תרמית בC ° 50-55 ל30-60 דקות. החלף על קרח ולהפוך לE. coli באמצעות תאים כימיים המוסמכים חום הלם. אין להשתמש בתאי electrocompetent. ריכוז מלח הגבוה וריכוז ה-DNA הנמוך יחסיתעלול לגרום לתאים לקשת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלתי את כל 20 μl להכנה מסחרית של 200 סידן כלוריד μl E. המוסמך coli. לדגור על קרח 30 דקות ושניות 60 הלם חום על 42 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לקרח 2 דקות, להחיל SOC μl 750 או מדיום LB ולשחזר רועדים בדקות 30 צינור microcentrifuge ב 37 ° C. פלייט את התערובת ודילולים מתאימים בLB + קאן (או אנטיביוטיקה מתאימה אחרת). הדבר עלול לגרום ברקע גבוה יותר (ומספר גבוה יותר של אירועי רקומבינציה יעד הלא) מאשר שיבוט מבוסס קשירה מסורתי אבל כדאי להקרין על 10 מושבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר שיבוט באמצעות רצף ולאחסן aliquot ב -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic Transfection של טבק עם אקדח הגן זוהי טכניקה שהיא הוקמה בשנת יופיטר 18,19. שלבים עיקריים והבדלים מתוארים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 50-100 מיליליטר E. שיתוףli או 200 מיליליטר Agrobacterium. תרבות prep-מקסי. ריכוז של כ -1,500 ng / μl נדרש כדי להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כדורי אקדח גן כפי שתואר לעיל. לטעון אותם לתוך אקדח הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור transfection של רקמת אפידרמיס עלה ניקוטיאנה benthamiana טבק, לבחור עלה גדול קרוב לבסיס של מפעל ישן של 3 חודשים. בזהירות לחתוך אותו ולמקם אותו בצד תחתון על מגבות נייר רטובות בצלחת פטרי 15 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הלחץ הוא לאקדח הגן ל200-250 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכוון אקדח הגן בין צלעות בצד התחתון של עלה, כ 3-5 סנטימטר מעליו. שחרר את הבטיחות ולספק את החלקיקים לעלה. כל כדור ניתן להשתמש פעמיים באותו המקום על העלה. אם מתפוצץ העלה, לבטל ולהתחיל חדש עלים יש קצת שונות בקשיחות עלים בשל תנאי גידול, כגון גיל, לחות, וכו &#39;לקבלת עלה 12-סנטימטר, מצפים שיתאימו לכ 6 יריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את העלה, מכוסה בחלקו העליון שלצלחת פטרי ל2-3 ימים באור נמוך על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את העלה במיקרוסקופ לנתח מצויד בקרינת UV, ולחפש את תאים בודדים להביע GFP. לנתח 5-10 חלקי מ&quot;מ של עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את העלים בשקופית מיקרוסקופ גם עמוק מתחת ~ 200 μl 0.1% טריטון X-100. חומר הניקוי מסייע במניעת בועות אוויר מלהרכיב על פני השטח, ושקופיות מיקרוסקופ גם עמוקות מאפשרת לאזור הדמיה רקמות גדול יותר. </li></ol> 4. מיקרוסקופיה confocal של רקמות transfected הנחיות אלו משתנות בהתאם לכל מכשיר, ולכן זה חיוני כדי לקבל הכשרה כמו שצריך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי גילוי הקרינה, הגדר את עירור הלייזר ל489 ננומטר, ולהגדיר את הגלאים מכפיל ל500-569 ננומטר לקרינת ה-GFP ו630-700 ננומטר auto-הקרינה כלורופיל. תאי תמונה באמצעות מטרת מים טבילת 40X. </li></ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
<li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+plant+splicing+code%3A+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li>
<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
<li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li>
<li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5%27-+and+3%27-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li>
<li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li>
<li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li>
<li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5%27+mRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, אסטרטגיות פשוטות מתוארות לאיתור חלבון מהונדס בודד לתאים סלולריים מרובים בצמחים. המטרה הייתה לתכנן מבנה שיבטא את הגן יחיד באברון יותר מפעם אחת בbenthamiana Nicotiana. אסטרטגיות כוללות תכנון רציונלים של בונה DNA מבוסס ה-GFP, הרכבה גיבסון, משלוח של פלסמידים לתאים עלה עם אקדח הגן, והתבוננות בתוצאות עם מיקרוסקופיה confocal. שלושה תגים קצרים, N-מסוף שונים נועדו להכלורופלסט בו זמנית, peroxisome וcytos...

עבודה זו היא פרויקט הנדסי / ביולוגיה סינתטית מטבולים שבי תאי צמח שהונדסו חלבון כתב באברונים מרובים אבל עם רק לבנות DNA בודד. גישה אחת כדי למקד את החלבונים למיקום אחד או יותר כרוכה בעותקים מרובים שיבוט גנטיים, המכיל פפטיד לוקליזציה שונה. כל עותק חייב להיות מוצג על ידי retransformation רצוף, או לחלופין, על ידי backcrossing התמרות אחת 1. זה כרוך בשיבוט נוסף, והוא מוגבל על ידי תג לוקליזציה אחד לתחנה סופית. דרך נוספת בתרגום חלבון למקומות רבים היא באמצעות שחבור חלופי 2-5. RNA הוא עיבד מגן יחיד, אך עותקים שונים של התמליל מעובדים בצורה שונה, לעתים קרובות בצורה יותר מפעם אחת לכל תא. זה יכול לגרום לRNA שליח יותר מפעם אחת בתא עיבד מגן יחיד. Messenge שונה אלהRNAs r יכול לקודד לisoforms שונה של אותו החלבון, או במקרה של frameshift, חלבון אחר לגמרי. למרות ששחבור חלופי כבר תואר בספרות במשך שנים רבות, את מנגנוני פעולה ותורמים שימור אתרים ואחוי קולט הם רק שהובהרו לאחרונה 6. האתרים אלה נמצאים בתארו טובים יותר, הם נפתחים הזדמנויות להנדסה. מהנדסים מטבולי צמח מתמודדים עם אתגר כשלבטא חלבון באברונים מרובים. לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר רב של פעמים, כל אחד עם רצף אות נפרד לכוון אותו לאברון של עניין. לגן יחיד בשלושה אברונים, זה פשוט שלושה גנים. אבל למסלול מטבולים של שישה גנים, זה מתרחב ל18 גנים, מאמץ שיבוט משמעותי. שילוב של רצפי לוקליזציה מרובים לתוך סימן יחיד, לחלופין-איחה גןificantly מפחית את המאמץ הזה. לדוגמא, photorespiration הנדסה מחדש 7,8 וסינתזת isoprenoid 9,10 כרוך הן כלורופלסטים וperoxisomes. במקרה שלנו לקחנו את היתרון של אתרי אחוי כפי שנצפה במערכת thaliana ארבידופסיס טבעית שתואר לעיל 6. אנחנו באופן רציונלי מחדש את רצף ה-mRNA עוזב את אתרי אחו הטבעיים בלבד, אלא להציב רצפים שמקודדים הכלורופלסט או תגי מיקוד peroxisome בתוך אינטרונים לחלופין-איחו (איור 1). החלבון לידי ביטוי עשוי או לא עשוי להיות תג, תלוי אם מראש mRNA שמקודד אותו היה נכרת כאינטרון (1G דמויות ו1H). לקבלת מידע נוסף על העיצוב של המבנים שהוצגו בעבודה זו, עיין במאמר הנלווה 11. בגלל זה הוא עדיין מאמץ משמעותי שיבוט, הרכבה גיבסון, שיטה חדשה לשיבוט בונה DNA, הוא used בבנייה. שיטת גיבסון יכולה לשמש לכל רצף, ללא קשר לאתרי הגבלה (איור 2) 12-14. התערובת הספציפית של אנזימים מאפשרת לצעד אחד, הרכבה בידוד תרמית. בשיטה זו, מספר חלקי DNA ליניארי פעמיים תקועים הם תוכננו כך שיש להם רצפים חופפים של ~ 50 נ&quot;ב. תערובת אנזים ההרכבה גיבסון באופן חלקי מעכלת את חלקי DNA ליניארי, חושף גדילים בודדים של רצפים הומולוגיים. רצפים חד גדילים החלקיים אלה מחדש annealed בתערובת התגובה, וכתוצאה מצעד אחד,, תגובה מהירה, רצף עצמאי ללא קשירה subcloning. עבודה זו מתארת ​​1) מבני שחבור לחלופין תכנון רציונלים לביטוי בכלורופלסטים צמח, peroxisomes, וcytosols, 2) השיבוט שלהם תוך שימוש בשיטה ללא קשירה החדשה של ההרכבה גיבסון, 3) המשלוח שלהם לתאים עלה טבק עם אקדח הגן, ו 4) תוצאות מראים מיקוד אברון, כפי שנצפה עם ה-GFPומיקרוסקופיה confocal.

<table><tbody><tr><td>פריימרים אוליגונוקלאוטידים</td><td>IDT</td> <td>(מותאם אישית)</td> <td>עיצוב במיוחד לבניית</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td> <td>(מותאם אישית)</td> <td>500 bp oligonucleotides</td></tr><tr><td>תוכנת ApE</td><td>U יוטה</td> <td>(הורדה)</td> <td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>משמש לטיהור מוצרי PCR</td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה לסיבוב QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>משמש להכנת כמויות מתאימות לשיבוט של פלסמיד</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix עם מאגר GC</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>משמש להגברת PCR של גן מעניין</td></tr><tr><td>תערובת תגובת הרכבה של גיבסון</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>תערובת מאסטר של 9 המרכיבים הבאים</td></tr><tr><td>: 1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>תערובת dNTP</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>תערובת הרכבה של גיבסון</td></tr><tr><td>פולימראז</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>גיבסון תערובת הרכבה</td></tr><tr><td>Taq DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>גיבסון תערובת הרכבה</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>אתר אינטרנט כדי לפשט את החישובים</td></tr><tr><td>פלסמיד פלוס ערכת מקסי</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>משמש להכנת DNA לכדורי אקדח גנים</td></tr><tr><td>מערכת אקדח גנים</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>כולל את כל החלקים הדרושים</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>מתנת ג'ן שין, מיקרוסקופ קונפוקלי MGH</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>הדמיה של תאים שנוצרו</td></tr><tr><td>שקופיות באר עמוקות</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>71561-01</td><td>משמש להדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>עורך פלסמיד (ApE) </td><td>אוניברסיטת יוטה </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>גיבתון: מחשבון</td><td></td><td></td> קשירה <td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

על מנת למקד את החלבון יחיד לאברונים subcellular מרובים, צמחים בדרך כלל לשכפל את הגנים הרלוונטיים, ולהביע את כל גן בנפרד באמצעות אסטרטגיות רגולציה מורכבות כולל יזמים ההפרש ו / או רצפי אות. מהנדסי חילוף חומרים וביולוגים סינטטיים מעוניינים במיקוד אנזימים לאברון בפרט מתמודדים עם אתגר: לחלבון שהוא להיות מקומי כדי אברון יותר מפעם אחת, המהנדס חייב לשכפל אותו הגן מספר פעמים. עבודה זו מציגה פתרון לאסטרטגיה זו: רתימת שחבור חלופי של mRNA. טכנולוגיה זו מנצלת הכלורופלסט הוקם ורצפי peroxisome מיקוד ומשלבת אותם לתוך mRNA יחיד שאיחה לחלופין. גרסאות אחוי חלקם נשלחו להכלורופלסט, כמה לperoxisome, וחלק לcytosol. הנה המערכת מיועדת למרובה אברון מיקוד עם שחבור חלופי. בעבודה זו, היה צפוי GFP להיות expressed בהכלורופלסט, cytosol, וperoxisome על ידי סדרה של 5 תגי mRNA &#39;נועדו באופן רציונלי. יש תגים אלה את הפוטנציאל להפחית את כמות הדרושה בעת שיבוט גנים Heterologous צריכים לבוא לידי ביטוי באברונים subcellular מרובים. המבנים עוצבו בעבודה קודמת 11, והיו משובטים באמצעות ההרכבה גיבסון, שיטת שיבוט עצמאית קשירה שאינו דורשת אנזימי הגבלה. פלסמידים התוצאה הוכנסו לתוך תאי עלה אפידרמיס ניקוטיאנה benthamiana עם פרוטוקול ג&#39;ין אקדח שונה. לבסוף, עלים הפכו נצפו עם מיקרוסקופיה confocal.

מאמץ העיצוב היה תוצאה של תכנון משמעותי. רומן לפרויקט זה הוא השימוש בשחבור חלופי כדי ליצור מראש mRNA שמתורגם לחלבונים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. חלבונים אלה באים לידי ביטוי באברונים שונים, במקרה זה הכלורופלסט, peroxisome ו / או cytosol. מתאמנים גן ארבידופסיס טבעי שאיחה 6 לחלופין, והניח ידוע הכלורופלסט 6 וperoxisome 17 מיקוד רצפים באקסונים חלופיים (TriTag-1 וTriTag-2). TriTag-3 מורכב מאות peroxisome מוטבעת בתוך אזור נמוך מורכבות של רצף הכלור...

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג&#39;ין האקדח.

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לצפות בביטוי גני זמני של רפורטר מתויג ב-GFP בתאי אפיתל של עלי טבק. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תכנון קונסטרקט DNA שיבוטא בכלורופלסטים ובפרוקסיסומים. לאחר מכן, הקונסטרקט נבנה באמצעות הגברה ב-PCR והרכבת גיבסון (Gibson assembly).בשלב הבא, נעשה שימוש ברובה גנים (gene gun) כדי להחדיר את הסמי constructs לתאי האפידרמיס של עלה טבק. בסופו של דבר, הדמיה של עלה הטבק באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית חושפת ביטוי של GFP בכלורופלסט ובפרוקסיסום. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיクלונינג קלאסי, הוא שאינה דורשת אנזימי הגבלה, ולפיכך, ניתן לשבט כל רצף שניתן להגביר באמצעות PCR.בשל הגמישות של התכנון הגנטי, היישומים של טכניקות אלו מתרחבים לקנה מידה גדול יותר. הנדסה גנטית של צמחים חקלאיים: התחילו פרוטוקול זה על ידי קביעת האתרים בתוך תא הצמח עבור ביטוי החלבון הסופי. בעבודה זו, המטרה היא לכוון את הביטוי לכלורופלסט, לפרוक्सीסום ולציטוזול.בשלב הבא, תכננו את מבנה הביטוי. המבנה חייב להכיל פרומוטור, גן שניתן לזיהוי וטרמינטור בתוך פלסמיד אחד. במקרה זה, הפרומוטור הקונסטיטוטיבי P end cup two מניע את הביטוי של GFP, שאחריו מופיע הטרמינטור Nolene Synthe או nos t.שימו לב שבניסוי זה, נבחן סדרה של תגי trit, אחד, שניים ושלושה, המובעים בקצה הטרמינלי של GFP לצורך ביטוי בכלורופ

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

תיאור וירוס-Induced שיטה להשתקת (VIGS) הגן לדפוק למטה של ​​ביטוי...

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium בתיווך וירוס-Induced assay השתקה (VIGS) גנים כותנה. רעשן טבק וירוס (TRV) הנגזרות וקטורים VIGS נפרסו לגרום RNA השתקת GrCLA1 ​​כותנה, Cloroplastos alterados 1 הגן. פנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 ​​נצפתה בשלב שתיל בתוך 2 שבועות לאחר חיסון.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

וירוס-Induced השתקת הגן היא כלי שימושי לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות nonhost של צמחים. אנו מדגימים את השימוש בחיידקים פתוגנים המבטאים GFPuv בזיהוי גנים מושתקים צמחים רגישים לפתוגנים nonhost. גישה זו היא קלה, מהירה ומאפשרת הקרנה בקנה מידה גדולה ופרוטוקול דומה ניתן ליישם בחקר אינטראקציות צמח חיידק אחרים שונות.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

חקור ביטוי גנים חולף בצמחי טבק באמצעות הרכבת גיבסון והאקדח הגן. השיטה מאפשרת מיקוד לכלורופלסטים ופרוקסיזומים ללא שימוש באנזימי חיתוך, עם ויזואליזציה במיקרוסקופ קונפוקלי.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

גלה סרטונים נוספים