ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לצפות בביטוי גני זמני של רפורטר מתויג ב-GFP בתאי אפיתל של עלי טבק. מטרה זו מושגת תחילה על ידי תכנון קונסטרקט DNA שיבוטא בכלורופלסטים ובפרוקסיסומים. לאחר מכן, הקונסטרקט נבנה באמצעות הגברה ב-PCR והרכבת גיבסון (Gibson assembly).

בשלב הבא, נעשה שימוש ברובה גנים (gene gun) כדי להחדיר את הסמי constructs לתאי האפידרמיס של עלה טבק. בסופו של דבר, הדמיה של עלה הטבק באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית חושפת ביטוי של GFP בכלורופלסט ובפרוקסיסום. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיクלונינג קלאסי, הוא שאינה דורשת אנזימי הגבלה, ולפיכך, ניתן לשבט כל רצף שניתן להגביר באמצעות PCR.

בשל הגמישות של התכנון הגנטי, היישומים של טכניקות אלו מתרחבים לקנה מידה גדול יותר. הנדסה גנטית של צמחים חקלאיים: התחילו פרוטוקול זה על ידי קביעת האתרים בתוך תא הצמח עבור ביטוי החלבון הסופי. בעבודה זו, המטרה היא לכוון את הביטוי לכלורופלסט, לפרוक्सीסום ולציטוזול.

בשלב הבא, תכננו את מבנה הביטוי. המבנה חייב להכיל פרומוטור, גן שניתן לזיהוי וטרמינטור בתוך פלסמיד אחד. במקרה זה, הפרומוטור הקונסטיטוטיבי P end cup two מניע את הביטוי של GFP, שאחריו מופיע הטרמינטור Nolene Synthe או nos t.

שימו לב שבניסוי זה, נבחן סדרה של תגי trit, אחד, שניים ושלושה, המובעים בקצה הטרמינלי של GFP לצורך ביטוי בכלורופלסטים ובפרוקסיסומים. שיטת ה-Gibson assembly מבוססת על פעולתם של מספר אנזימים בתערובת מוכנה מראש, המעכלת חלקית את הקצוות של DNA דו-גללי ומסייעת להיבדיקה (annealing) של זוגות בסיסים משלימים מרצפי DNA סמוכים. למבנה הסופי יש שלושה חלקים שיש להגביר בארבע תגובות PCR לפני ה-Gibson assembly.

התגובות הראשונה והשנייה מגבירות וקטור פלסמיד של 8,000 base pair, PORE, המכיל GFP NOS T וסמן עמידות ל-cany. סמן העמידות מהווה נקודה טובה לפיצול של ה-DNA הגדול הזה לשני תבניות קטנות יותר שקל יותר להגביר באמצעות PCR. התגובה השלישית מגבירה את הפרומוטור P end cup two, והתגובה הרביעית מגבירה את triag one תוך שימוש בתוכנה לעיצוב in silico כגון ape design, כאשר המבנה מתוכנן בסיס אחר בסיס, כך שקיים חפיפה של 50 base pair בין כל חלק.

בעת הזמנת פריימרים עבור PCR, ניתן להשתמש בחפיפה של 50 זוגות בסיסים, כך שכל פריימר יהיה באורך של 25 זוגות בסיסים לכל כיוון. לאחר ביצוע PCR להגברה של כל רכיב, טהרו את תוצרי ה-PCR בנפרד ודללו אותם במים מזוקקים דה-יוניים. אם תבנית ה-PCR הייתה מיני-פרפ (mini prep) מ-e coli, טיפול באנזים ההגבלה DpnI יסיר את ה-DNA של התבנית המזהמת. לאחר מכן, מדדו את הריכוזים של כל אחד מקטעי ה-DNA.

כוון את ריכוז הווקטור לכ-150 nanograms per microliter עבור כל מבנה המיועד להרכבה, כולל ביקורת; הוצא מנת חלקיקים של 15 microliter של תערובת ה-Gibson Assembly מהמקפיא והפשר אותה על קרח. באמצעות הכלי הפתוח למקורות בכתובת @gibbon.org, קבע את הנפחים הדרושים לכמויות שוות של מולים (equimolar) עבור כל אחד מהקטעים.

הוסיפו את הנפח המחושב של כל אחד מהמקטעים ל-15 מיקרוליטר של תערובת Gibson. הכינו בנוסף ביקורת של ה-DNA של הווקטור בלבד. הנפח הכולל של כל תגובה צריך להיות 20 מיקרוליטר.

השתמש במים כדי להתאים את הנפח במידת הצורך. דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 50 עד 55 °C למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, החזר את המבחנות לקרח.

הוציאו מבקיעם של מינוס 80 מעלות צלזיוס מבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המכילה תמינה מסחרית של 200 µL של חיידקי e coli מוסמכים לטרנספורקציה בעזרת calcium chloride, וחממו אותה קלות ביד. לאחר מכן, הוסיפו את כל 20 µL של התגובה אל ה-e coli. גרעו את התרביות על קרח למשך 30 דקות, לאחר מכן העבירו אותן למקבץ מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס ובצעו הלם תרמי למשך 60 שניות.

אין להשתמש בתאים בעלי כשירות אלקטרופורית (electro competent cells). ריכוז המלח הגבוה יחסית וריכוז ה-DNA הנמוך עלולים לגרום לקריצה (arc) בתאים. לאחר התהליך (transformation), החזירו את התרביות לקרח למשך שתי דקות, לאחר מכן הוסיפו 750 µL של מצע SOC או LB ואפשרו להם להתאושש במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C.

בשלב הבא, יש לזרוע את התערובת על מצעי LB עם קנימיצין או אנטיביוטיקה מתאימה אחרת, להדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה ולסרוק 10 מושבות באמצעות רצף (sequencing). שימו לב כי שיטה זו עשויה להוביל לרקע גבוה יותר ולמספר רב יותר של אירועי רקומבינציה שאינם המטרה בהשוואה לשיטות שיבוט מסורתיות המבוססות על ליגציה. טרנספקציה ביוטית של טבק באמצעות תותח גנים תוארה בעבר ב-JoVE.

כאן נסקרים שלבים מרכזיים והבדלים לעומת פרוטוקולים קודמים. לאחר הגברה ובידוד של הקונסטרקטים, הכין תחמושת לרובה גנים כפי שמתואר במאמר של JoVE מאת woods ו-zeto, וטען אותה לרובה הגנים לצורך טרנספקציה של רקמת אפידרמיס של עלה טבק מסוג Nico Tania Benham Miana. בחר עלה גדול הקרוב לבסיסו של צמח בן שלושה עד חמישה חודשים.

הניחו אותו בזהירות, כאשר הצד התחתון פונה למעלה, על ניירות ספיגה רטובים בתוך צלחת פטרי של 15 סנטימטרים, תוך ענידה מיגון עיניים ואוזניים מתאים. הגדירו את לחץ ההליום של תותח הגנים ל-200 עד 250 PSI. כוונו בזהירות את תותח הגנים בין הצלעות בצד התחתון של עלה, בגובה של כ-שלושה עד חמישה סנטימטרים מעליו. שחררו את הנעילה והעבירו את החלקיקים לעלה.

השתמשו בכל קליט פעמיים באותו מיקום על העלה. עברו למיקום אחר וחזרו על התהליך אם העלה התפוצץ, השליכו אותו והתחילו עם עלה חדש. קיימת שונות בחוזק העלה עקב תנאי גידול כגון גיל, לחות וכדומה.

לאחר השלמת כל ההזרקות, כסו את העלה ואחסנו אותו למשך יומיים עד שלושה ימים בתאורה נמוכה על השולחן. בחנו את העלה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי המצויד בפלואורסצנציית UV וחפשו תאים בודדים המבטאים GFP. כאשר נמצאו תאים המבטאים GFP, השתמשו במספרי ניתוח כדי לחתוך בזהירות מקטעי עלה באורך של 5 עד 10 מילימטרים.

טבול מיד כל פרגמנט עלה בודד בתוך באר של סלייד מיקרוסקופ עמוק המכיל כ-200 µL של 0.1% Triton X 100. הדטרגנט מסייע במניעת היווצרות בועות אוויר על הפני השטח, וסלייד המיקרוסקופ העמוק מאפשר דימות של שטח רקמה גדול יותר; דמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בפילטרים המתאימים ובעדשת שיקוע במים 40x. במחקר זה, שלוש קונסטרוקציות שונות של GFP המכוונות לאבוןלים הושוו ל-GFP ללא תגית ול-rubis.Coag.

מיקרוסקופיה קונפוקלית של GFP שימשה לזיהוי פלואורסצנציית GFP בתאים בודדים שעברו טרנספורמציה זמנית בניסויי ביקורת שבהם בוטא GFP ללא תגית. פלואורסצנציה נצפית רק בגרעין ובציטוזול, אך לא בכלורופלסט, אשר מזוהה על ידי האוטופלואורסצנציה האדומה של כלורופיל, כפי שניתן לראות בדוגמה זו של תא שעבר טרנספקציה של Rubis Oag המכוון לכלורופלסט בלבד. מבנה ה-GFP בוטא באורגנלות הגדולות.

התא מוקף בקו לבן. הצבע הצהוב מצביע על אזורי קולוקליזציה של המבנה עם כלורופיל, דבר המעיד על כך שהמבנה מופנה לכיוון הכלורופלסט, כפי שרואים בתמונה זו של תא בודד שטרנספקציה של triag one; ביטוי של GFP נראה בכלורופלסט, בפריפריה, בציטוסול ובאורגנלים נקודתיים קטנים הנחשבים כפרוקסיסומים. באופן דומה, תאים שעברו טרנספקציה של triag two מבטאים אף הם GFP בכלורופלסט, בציטוסול ובפרוקסיסומים; triag three, המורכב מאות פרוקסיסום המוטמע בתוך אזור בעל מורכבות נמוכה של רצף הכלורופלסט, ממוקם אך ורק בכלורופלסט ובפרוקסיסום.

שימו לב שתא זה נמצא בשכבת עלה שונה. איור זה מסכם את הביטוי שנצפה במחיצות של תא אפיתליאלי טיפוסי בעלה טבק. הגדלים והמיקומים היחסיים בתוך התא מוצגים, יחד עם רמות הביטוי היחסיות שנצפו באמצעות טרנספקציית Gene Gun ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

שימו לב כי ה-GFP שאינו מתויג ממוקם בציטוזול ובגרעין, בקרת ה-PIMT two GFP ממוקמת בכלורופלסט, ו-triag one GFP, triag two GFP ו-Triag 3G FP ממוקמים בכלורופלסט ובפרוקסיסום כפי שצפה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן בניית פלסמיד באמצעות הרכבת גיבסון (Gibson assembly), העברתו בליסטית לעלי טבק, ותצפית על ביטוי GFP בתוך שלושה ימים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשתמש ב-150 nanograms per microliter של DNA של וקטור עבור הרכבת הגיבסון, וב-1500 nanograms per microliter של מבנה ה-DNA הסופי להכנת כדורי פגזי ה-gene gun. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו טרנספקציית agrobacterium כדי להשיג ביטוי גנים יציב במקום ביטוי זמני.