Name: המוח פרוס Biotinylation: Ex Vivo גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: למד שיטת ביוטינילציה לכימות שינויים חריפים בחלבוני שטח תאי עצב בפרוסות מוח אקס ויו. השיטה מאפשרת לחקור תנועת חלבונים בממברנה פלזמטית בסביבה פיזיולוגית אמיתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי DA15169 וDA035224 לHEM

כל הטיפול בבעלי החיים וקצירת רקמה בוצע בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ועדת שימוש בבעלי חיים מוסדי טיפול בית הספר לרפואה של מסצ&#39;וסטס (IACUC), בעקבות # פרוטוקול A1506 אישר (Melikian, PI). פתרונות נדרשים נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF) - הפוך טרי מדי יום 125 mM NaCl, 2.5 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 2.4 מ&quot;מ CaCl 2, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, ו11 מ&quot;מ גלוקוז הערה: הכן ACSF כפתרון מניות 10x, למעט NaHCO 3 וגלוקוז. הפוך את הפתרונות עובדים 1x יומי מהמניות 10x, להשלים עם גלוקוז NaHCO 3 וטרי. ACSF-תוספת סוכרוז (SACSF) - הפוך טרי מדי יום 250 suc מ&quot;מעלה, 2.5 מ&quot;מ KCl, 1.2 מ&quot;מ אא 2 PO 4, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 2.4 מ&quot;מ CaCl 2, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, ו11 גלוקוז מ&quot;מ הערה: הכן SACSF כפתרון מניות 10x, למעט NaHCO 3 וגלוקוז. הפוך את הפתרונות עובדים 1x יומי מהמניות 10x, להשלים עם גלוקוז NaHCO 3 וטרי. Sulfo-N-hydroxysuccinyl-SS-ביוטין (sulfo-NHS-SS-ביוטין, פירס כימיקלים) פתרונות מניות צריכים להיות 200 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO והם עמידים להקפאה / הפשרה מחזורים מרובים. Aliquots מאוחסנים ב -20 ° C. אסתר succinyl היא הידרוליזה במהירות בתמיסה מימית, ולכן צריכים להיות מוכנים פתרונות לעבוד מייד לפני הגשת בקשה לפרוסות. פורסים להרוות פתרון ACSF בתוספת גליצין 100 מ&quot;מ ריפה תמוגה Buffer 10 מ&quot;מ טריס, 7.4 pH, 150 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0.1% SDS, 1% deoxycholate Na ריפה עם מעכבי פרוטאז (ריפה / PI) - הפוך טרי מדי יום ריפה בתוספת leupeptin 1 מיקרומטר, pepstatin 1 מיקרומטר, aprotinin 1 מיקרומטר, ופלואוריד sulfonyl 1 מ&quot;מ phenylmethyl. 1. הכן את פרוסות המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך SACSF 1x הטרי ו1x ACSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל SACSF על קרח בכוס קטנה. זה ישמש כדי להחזיק את מוח עכבר שזה עתה נקטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את ACSF וSACSF עם חמצן על ידי מבעבע עם O 95% / 5% 2/2 CO, 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש P30-38 עכברים לכדאיות רקמות אופטימליות. להקריב בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם ועריפת ראש, ומהירות להסיר את המוח לSACSF prechilled, מחומצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome רוטט, להפוך 300 חלקים במוח מיקרומטר באזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, פרוסות יכולות להיות גזורים נוספות לפני ההתאוששות להעשיר לאזורים מסוימים במוח או זכות נפרדת וההמיספרות עזבו לשימוש כבקרה ופרוסות ניסיוניות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר אש מלוטשת, להעביר פרוסות לרשת תחתית-תאים להגדיר ל24 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר פרוסות להתאושש במשך 40 דקות, ביום 31 במעלות צלזיוס בACSF מחומץ, עם בעבוע מתמיד, עדין. </li></ol> 2. טיפול תרופתי (במידת צורך) ופורסים Biotinylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התאוששות, לשטוף פרוסות 3x בprewarmed (37 מעלות צלזיוס), מבעבע ACSF מחומצן עם 95% / 5% O 2 / CO 2 כל הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תרכובות מבחן ודגירה עם חמצון מתמשך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוחיותכם, להוסיף 1/10 ה נפח של 10x תרופה מרוכזת, ומערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צלחות בעדינות באמבט מים בטמפרטורה הרצויה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול תרופתי שלאחר מכן, במהירותפרוסות צינה על ידי שטיפת 3x בACSF הקר כקרח. </li></ol> 3. משטח חלבונים Biotinylate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר sulfo-NHS-SS-ביוטין בACSF הקר קרח מייד לפני התיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.75 מיליליטר sulfo-NHS-SS-ביוטין לפרוסות ודגירת פרוסות על קרח, 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות שלוש פעמים במהירות עם ACSF הקר כקרח, ואז דגירה של 10 דקות בACSF קר כקרח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות שלוש פעמים עם חיץ להרוות הפרוסה קר כקרח ודגירה עם 0.75 מיליליטר חיץ להרוות פרוס שתי פעמים, 25 דקות, על קרח כדי להרוות sulfo-NHS-SS-ביוטין בחינם. </li></ol> 4. הכן Lysates רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות שלוש פעמים בACSF קר כקרח ולהעביר כל פרוסה לצינור microcentrifuge באמצעות פיפטה פסטר אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות גלולה פרוסה ידי צנטריפוגה XG 200, 1 דקות וACSF זהירות לשאוב הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 ריפה / PI הקרח קר μl ולשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה פעם דרך פיפס P200ette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה ניתקה פרוסה / ריפה לצינור טרי ודגירת 30 דקות, 4 ° C, מסתובבת, כדי להשלים תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה, 18,000 XG, 15 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוזי חלבון lysate באמצעות assay חלבון BCA, עם אלבומין בסרום שור (BSA) כסטנדרט. </li></ol> 5. לבודד חלבונים Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל ביד / סך הכל יחס חלבון. הערה: רמות ביטוי חלבון בודדות יכולות להשתנות במידה רבה על פני אזורים שונים במוח. אלא אם כן כל חלבון biotinylated בכמות נתונה של lysate הרקמה הוא נתפס, לא ניתן לזהות במדויק כל שינויים אפשריים בביטוי על פני השטח. לכן, קיים הכרח לקבוע באופן אמפירי את החרוז / סך הכל יחס חלבון האופטימלי לאזור חלבון / מוח בפרט לפני היציאה על מחקר biotinylation פרוסה חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 25 חרוזים agarose streptavidin μl עם כמות הולכת וגדלהים של lysate רקמות (מיקרוגרם 25-200 הטווח משוער), ולאחר מכן להמשיך כמתואר בהמשך לכריכה, שלבי כביסה וelution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את להקות immunoreactive וכתוצאה מכך ולבחור יחס חרוז / lysate בטווח ליניארי של מחייב שיאפשר כימות מדויק של או להגדיל או להקטין את הביטוי פני חלבון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חרוזים streptavidin-Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע חרוז כולל דרוש לכל דגימות נפח. הכן מספיק חרוז נפח לסכום זה ועוד אחד (כלומר 4 דגימות נוספות ב25 μl / מדגם = 100 חרוזים μl = 125 חרוזים μl נוספים + אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ורטקס מניות חרוזים Streptavidin ו פיפטה את הנפח רצוי. אם באמצעות פיפטה P200, לחתוך את הקצה של הקצה כדי למנוע נזק חסימה או חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 3 פעמים ב0.5-1.0 מיליליטר ריפה / PI כדי להסיר חומרים משמרים, vortexing לאחר כל הוספת ריפה וחרוזים איסוף בין שוטף על ידי צנטריפוגה 18,000 XG, 1 דקות, ברוח חדרשבמקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את החיץ בין שוטף באמצעות פיפטה פסטר זכוכית שמחוברת לבקבוק ריק. טיפ P200 פלסטיק מצורף בסוף של הזכוכית פיפטה פסטר מספק שליטה עדינה יותר כאשר נשיפה. אין זה הכרחי כדי להסיר לחלוטין את כל המאגר לשתי שטיפות הראשונות, כפי שהוא מסתכן בחרוזי נשיפה לתוך פיפטה. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר עודפי חיץ ככל האפשר בלי נשיפת חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריפה / PI להביא חרוזים חזרה לנפח המקורי שלהם, pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend. הימנע vortexing בשלב זה, כפי שחרוזים יהיו להיצמד לקיר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים aliquot לתוך צינורות microcentrifuge באמצעות P200 עם הקצה החתוך. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים בין הדגימה כדי להבטיח חרוזים להישאר באופן שווה על תנאי ופורד בין הצינורות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני biotinylated להיקשר streptavidin חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ lysates תא לצינורות המכילים חרוזים agarose. עבור ניסויים whe<html> מחדש דגימות מרובות עוברות בהשוואה, הקפד להשתמש באותה הכמות של חלבון עבור כל דגימה להשוואות מדויקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריפה / PI נוסף כדי להביא לדגימות לנפח מינימאלי μl 200. זה מבטיח כי דגימות תהיה לערבב כראוי במהלך הדגירה וגם מאחדת את ריכוזי חלבון על פני דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינורות במסובבים צינור ומערבבים לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינורות נפרדים, לוותר מקביל של סך lysate משמש עבור כל נפח דגימה. לחלופין, אם כרכי המדגם הם גבוהים, כל חלק בסך הכל lysate נפח יכול להיות שמורות במקום, כדי להתאים כרכי עומס מקסימאלי על ג&#39;לי-SDS. אלה ישמשו כדי לנרמל את הביטוי על פני השטח לסך כמות החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה או נפח שווה של 2x או 1/5 בנפח של חיץ מדגם SDS-PAGE 6x וגם דגירה על 4 מעלות צלזיוס, במקביל לדגימות חרוז, או בחנות ב-20 ° C עד דגימות מנותחות. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Elute ולנתח דגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה 18,000 XG, 2 דקות, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים לשאוב supernatant ולשטוף שלוש פעמים עם 0.75 מיליליטר ריפה. כדי להקטין את איבוד חרוז, להשאיר את הראש נפח קטן של חיץ מעל חרוזים בין שוטף. לאחר לשטוף הסופי, להסיר כמה שיותר ריפה ככל האפשר, מבלי לשבש את גלולה חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute חלבוני biotinylated מחרוזי streptavidin על ידי הפחתת הצמדת דיסולפיד. הוסף 25 μl 2x-SDS צמצום חיץ מדגם, מערבולת היטב ולסובב את דגימות 30 דקות, בטמפרטורת חדר. שים לב: יש לי חלבוני קרום רבים יש נטייה גבוהה לצבירה כאשר מבושל בחיץ מדגם SDS-PAGE, קשה לפגוע ניידות electrophoretic שלהם. אם זה במקרה של החלבון הנחקר, להימנע מחימום דגימות, ובמקום זאת, elute לאט בטמפרטורת חדר. אם רותח הוא הכרחי (למשל, אם חלבון אחר העריך במקביל דורש רתיחה), samplחיץ דואר ניתן בתוספת 2 M אוריאה (ריכוז סופי) כדי למזער את הצבירה. אמנם יעיל בהפחתת הצטברות בחלק ממקרים, אוריאה לעתים קרובות פשרות הופעות להקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי immunoblot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר כוללת דגימות lysate ולסובב במקביל לדגימות חרוז, 30 דקות, בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים נפרדים על ג&#39;לי-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי חלבון (ים) של עניין על ידי immunoblotting. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הייה בטוח כי להקות מזוהות בטווח ליניארי של זיהוי לכימות נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שמגיב biotinylation לא קבל גישה לחלבונים תאיים באמצעות תאים פגועים / בסכנה. המטרה זו מושגת על ידי מיטב immunoblotting במקביל לחלבון תאיים ספציפי לסוג התא הנחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת צפיפויות להקה ולחשב צפיפות פני חלבון יחסית כאחוז מרמת ביטוי חלבון בסך הכל. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transport+by+insulin%3A+traffic+control+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li>
<li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li>
<li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-independent+endocytosis%3A+mechanisms+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li>
<li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li>
<li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li>
<li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area%3A+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons%3A+Behavioral+correlates+in+GluRA%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li>
<li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li>
<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical%2C+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
<li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li>
<li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li>
<li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li>
<li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
</ol>

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים סכסוך שעם העבודה הזאת.

למרות ידע רב שנים שסחר endocytic ביקורתי איתות הסינפטי משפיע במוח, זה הוכיח מאתגר למדוד כמותית שינויים בביטוי פני חלבון בתאי עצב בוגרים. בעבודה זו, אנו מדווחים גישה אמינה לתייג חלבון משטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות. יש הכנות פרוסה מוח בעל היסטוריה ארוכה של שירות עבור קלטות אלקטרו, כפי שהם שומרים על קשרים סינפטיים ותא כדאיות עד שעות לאחר ההכנה שלהם. יתר על כן, יכולה להיות מותאמים אסטרטגיות חיתוך לשמר קשרים סינפטיים מסוימים בין אזורי מוח השונים של עניין. <p class="jo...

סחר endocytic הוא מנגנון סלולארי בכל מקום שמכוונן מצגת קרום הפלזמה של מגוון רחב של חלבוני קרום נפרד. אנדוציטוזה מספקת חומרים מזינים חיוניים לסביבה תאית 1 וdesensitizes איתות קולטן בתגובה לקולטן הפעלה 2. Endocytic מחזור חזרה לקרום הפלזמה יכולה בנוסף לשפר את האיתות תאית על ידי הגדלת רמות ביטוי חלבון על פני תא 3. יתר על כן, הפרעות סחר קרום הם מעורבים במספר רב של מחלות ומצבים פתולוגיים 4,5, והדגישו את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים בסחר endocytic חלבון. בעוד חלבונים רבים לנצל מנגנונים קלאסיים clathrin תלוי הפנמה, הרכבה ראיות בשנים האחרונות מוכיח כי מנגנוני endocytic clathrin עצמאי מרובים לשלוט בפוטנציאל endocytic של מערך הולך וגדל שלחלבונים 6,7. לכן, הצורך לחקור את מנגנוני endocytic הקלת סחר במערכות רלוונטיות פיסיולוגיות גדל במידה ניכרת. במוח, סחר endocytic של קולטנים, תעלות יונים ומובילי הנוירוטרנסמיטר יש תפקיד עיקרי בהקמת פלסטיות הסינפטית 8-11 ותגובה לתרופות של התעללות 12-15, סופו של דבר משפיעות על רגישות עצבית ותגובות הסינפטי. עד כה רוב מחקרי סחר עצביים להסתמך על שני מערכות ביטוי Heterologous או נוירונים בתרבית ראשוניים, אף אחד מהם עשוי באופן מהימן משקפים מנגנונים במשחק בנוירונים בוגרים. כאן אנו מדווחים גישה המשתמשת biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו רמות חלבון פני השטח בפרוסות מוח חריפות הנגזרות ממכרסמים מבוגרים. שימוש בגישה זו, אנו מציגים נתונים שמראים כי טרנספורטר דופאמין striatal העכבר במהירות מפנים מחדשsponse ל-C phorbol תיווך אסתר החלבון kinase הפעלה (PKC).

<table><tbody><tr><td>סולפו NHS-SS-ביוטין</td><td>פירס</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין אגרוז</td><td>פירס</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר ללא IgG, ללא פרוטאז</td><td>סיגמא</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr>חתך <td></td><td></td><td></td><td>מיקרוטום רוטט</td></tr> שונים <tr><td>אמבט מים רועדים</td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מוסיף תחתית רשת Millicell (8 & מיקרו; m גודל נקבוביות)</td> <td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>ניתן לכבס אותם ביד ולעשות בהם שימוש חוזר</td></tr></tbody></table>

המוח פרוס biotinylation:<em&gt; ex vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

סחר endocytic מוסדר הוא המנגנון המרכזי המאפשר מגוון רחב של אירועי neuromodulatory, על ידי השליטה באופן דינמי קולט, ערוץ יון, והצגה פני תא טרנספורטר בזמן בקנה מידה דקות. יש מגוון רחב של מנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבונים בודדים. מחקרים חוקרים את הבסיס המולקולרי של סחר הסתמכו בעיקר על biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו שינויים בביטוי פני חלבון קרום בתגובה לגירויים אקסוגניים ומניפולציה גנטית. עם זאת, גישה זו הייתה מוגבלת בעיקר לתאים בתרבית, אשר לא יכול לשקף נאמנה את המנגנונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במשחק בנוירונים בוגרים. יתר על כן, גישות תאים בתרבית עשויות לזלזל הבדלי אזור ספציפי במנגנוני סחר בנשים. כאן, אנו מתארים את הגישה המרחיבה biotinylation פני תא להכנת פרוסה המוח החריף. אנחנולהוכיח כי שיטה זו מספקת גישה באיכות גבוהה למדידת שינויים מהירים ברמות פני חלבון קרום בנוירונים בוגרים. גישה זו עלולה להיות כלי רחב בתחום הסחר בendocytic העצבית.

טרנספורטר דופאמין העצבי הפנים בתגובה להפעלת PKC בשורות תאי 16-20. למרות דיווחים רבים הוכחת הפסדי משטח DAT-Induced PKC במגוון רחב של שורות תאים ומערכות ביטוי, זה כבר מאתגר כדי לאשר את הממצא הזה בנוירונים דופאמין בתרבית 21-23. אנחנו השתמשנו פרוסות של הסטריאטום עכבר כדי לבדוק ישירות אם DAT מפנים בתגובה להפעלת PKC בנוירונים דופאמין המבוגרים. בעקבות הכנת פרוסה, פרוסות היו התפצלו לפתע לאורך קו האמצע ופרוסות ממטוסים זהים טופלו ± 1 מיקרומטר phorbol אצטט Myristate-13 ...

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת שינויים חריפים בחלבוני פני השטח של נוירונים. בהכנות של פרוסות מוח ex vivo, הדבר מושג תחילה על ידי הכנת פרוסות מוח חריפות חיות. לאחר מכן, הפרוסות מטופלות בתרופות הנחקרות.לאחר מכן, חלבוני פני השטח של התא מסומנים באמצעות ריאגנטים לצביעה שאינם חודרים לממברנה. לבסוף, חלבונים שביוטינילו על פני השטח מבודלים באמצעות strep avidin וכרומטוגרפיית זיקה. לבסוף, נעשה שימוש ב-immunoblotting כדי לכמת שינויים בביטוי חלבונים על פני השטח בעקבות טיפולים תרופתיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תיווך מבוסס תאים, הוא שמעבר של חלבונים עצביים נבחן in situ במקום במערכות ביטוי הטרולוגיות או בתרביות של נוירונים ראשוניים. באופן כללי, מי שאינו מכיר את השיטה יתקשה להכין פרוסות מוח חיות. כדי להכין פרוסות מוח, התחל בהכנה של נוזל חוט שדרה מלאכותי (aCSF) טרי ושל aCSF מועשר בסוכרוז (S-aCSF) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, קירר.ב-S-A-C-S-F על קרח משתמשים ב-95% oxygen עם 5% carbon dioxide כדי להרוויע את התמימות בחמצן באמצעות בובלינג למשך 20 דקות על קרח. לאחר הקרבת עכברים בני P 30 עד 38 על ידי פריקה צווארית ועריפת ראש והוצאה מהירה של המוחות, הניח אותם ב-S-A-C-S-F מחומצן ומקורר מראש באמצעות מיקרוטום רוטט. בצע חיתוכי מוח בעובי 300 micron באזור העניין ובמידת הצורך, הפרד בין ההמיספרות הימנית והשמאלית כדי להשתמש בהן כפרוסות ביקורת ופרוסות ניסוי בהתאמה.העבירו את הפרוסות באמצעות פיפטת פסטור עם קצה מוקשח באש לתאי החזקה בעלי תחתית רשת המכילים A CSF מחומצן. אפשרו לפרוסות להתאושש במשך 40 דקות בטמפרטורה של 31 degrees Celsius עם בועיות אוויר עדינות ורציפות. לאחר האינקובציה, העבירו את הפרוסות לתאי רשת בודדים.בפלטות של 24 בארות, שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-A CSF מחומצן שחומם מראש עם בועות קבועות. בבדיקת תרכובות, הוסיפו נפח של עשירית מנפח התמיסה של תרופה בריכוז 10x וערבבו על ידי היפוך עדין לאחר ניעור עדין של הפלטות באמבט מים בטמפרטורה הרצויה. השתמשו ב-A CSF קר מאוד כדי לצנן במהירות את הפרוסות על ידי שטיפתן שלוש פעמים כדי לעכב חלבוני פני שטח.הכינו תמיסה טרייה של sulfa N-H-S-S-S biotin בריכוז 1.0 mg/mL ב-A CSF קר מאוד. הוסיפו 0.75 mL מהתמיסה לפרוסות והדגירו על קרח למשך 45 דקות. לאחר שטיפה מהירה של הפרוסות שלוש פעמים ב-A CSF קר מאוד, הדגירו אותן ב-A CSF קר מאוד על קרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-slice quench buffer קר מאוד והדגירו אותן עם 0.75 mL של slice quench buffer פעמיים, למשך 25 דקות בכל פעם על קרח, כדי לנטרל suo N-H-S-S-S biotin חופשי לצורך הכנת ליזאטים של רקמה. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-A CSF קר מאוד לפני העברת כל פרוסה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה מסוג pasti שעברה ליטוש באש.שקע בעדינות את הפרוסות באמצעות צנטריפוגה במהירות של 200 G למשך דקה אחת ושבב בזהירות את ה-CSF שנותר. לאחר מכן, הוסף 400 µL של RIPA קר, והשתמש בפיפט P200 כדי לפרק את הרקמה על ידי פיפוט למעלה ולמטה פעם אחת להשלמת הליזיס. העבר את הרקמה המופרדת למבחנה נקייה והדגרה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן בצע צנטריפוגה מסתובבת במהירות של 18,000 G למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.כדי לשקע את השאריות התאיות, יש לבודד את החלבונים הביוטיניליים ולנתח אותם באמצעות immuno blot. על פי הפרוטוקול הכתוב, נשא הדופמין העצבי עובר הפנמה בתגובה להפעלה של PKC בשורות תאים. למרות דיווחים רבים המראים אובדן של נשאי דופמין פעילים או אובדן מהשטח הפנימי המושרה על ידי PKC במגוון שורות תאים ומערכות ביטוי, היה קשה לאשר ממצא זה בנורונים דופמינרגיים בתרבית; השתמשנו בפתחים של stri AAL מעכבר כדי לבחון ישירות האם dat עובר הפנמה בתגובה להפעלה של PKC בנורונים דופמינרגיים בוגרים כפי שנראה.כאן זיהינו ביטוי שטח חזק של DA בסטריאטום של עכבר תחת תנאי טיפול ב-basil או ב-vehicle, עם 81.4 ± 5.8% מסך ה-debt על פני השטח של התא עם הפעלת PKC באמצעות four ball 12. Myra State 13 acetate הפחית באופן משמעותי את ביטוי השטח של dat ל-60.8 ± 5.2% מסך ה-debt, מה שמתבטא באובדן של כ-30% מה-debt מממברנת הפלזמה. לעומת זאת, רק 1.6 ± 0.4% מסך ה-tyrosine hydroxylase עברו ביוטינילציה, באופן העולה בקנה אחד עם לוקליזצייתם התוך-תאית ומאשר שסוכן הביוטינילציה לא חדר לתוך התא של נוירונים דופמינרגיים.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן למדוד שינויים בביטוי של חלבונים בממברנה של טרמינלים עצביים שלמים.

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

דו"ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

שיטה זו מציגה טכניקה פשוטה לזיהוי של שחרור מונואמין אנדוגני באמצעות פרוסות מוח חריפות. ההתקנה משתמשת בלוח 48 באר המכיל מחזיק רקמות לשחרור מונואמין. מונואמין ששוחרר מנותח על ידי HPLC יחד עם זיהוי אלקטרוכימי. בנוסף, טכניקה זו מספקת שיטת סינון לגילוי סמים.

בסיס בסיס צלחת למדידת שחרור מונואמין אנדוגני בפרוסות מוח חריפות

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

למד שיטת ביוטינילציה לכימות שינויים חריפים בחלבוני שטח תאי עצב בפרוסות מוח אקס ויו. השיטה מאפשרת לחקור תנועת חלבונים בממברנה פלזמטית בסביבה פיזיולוגית אמיתית.

המוח פרוס Biotinylation:

גלה סרטונים נוספים