Name: עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: למדו זיהוי וספירה של תאי גידול מחוללים (CTC) מדגימות דם אנושיות ומודלים של עכברים באמצעות מערכת CellSearch. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולרי לבחירת טיפולים ממוקדים בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון אונטריו לחקר הסרטן (# 08NOV230), קרן קנדה עבור חדשנות (# 13199), סרטן ערמונית קנדה, Janssen אונקולוגיה, התכנית למלחמה בסרטן האזורית בלונדון, ותמיכת תורמים מג&#39;ון ודונה בריסטול דרך קרן לונדון למדעי בריאות (לALA). LEL נתמך על ידי בנטינג פרדריק ומלגות לתארים מתקדמים צ&#39;רלס בסט קנדה דוקטורט פרס. ALA נתמך ניו פרס חוקר CIHR ופרס חוקר מוקדם ממשרד אונטריו של מחקר וחדשנות על ידי.

כל המחקרים בבני האדם שתוארו בכתב היד הזה בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי אדם מחקר האתיקה מועצת המנהלים של האוניברסיטה המערבית. כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מערב השימוש בבעלי חי ועדת המשנה. 1. CTC ספירה סטנדרטית מדגימות דם חולה באמצעות CSS 1. איסוף דם אדם לדוגמא והכנה לעיבוד בכלי ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות phlebotomy אספטיים סטנדרטיות, לצייר מינימום של 8.0 מיליליטר של דם אדם לתוך צינור CellSave 10 מיליליטר (להלן כצינור CTC חומר משמר), המכיל חומצת אתילן diaminetetraacetic (EDTA) וחומר משמר סלולארי קניינית. הפוך 5x הצינור כדי למנוע קרישת דם. דוגמאות יכולות להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסנות בטמפרטורת חדר למשך עד 96 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Removריאגנטים CSS דואר מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה חד פעמית 10 מיליליטר וpipettor אוטומטית, לאסוף 7.5 מיליליטר של דם מצינור משמר CTC ולוותר לאט דם לתוך צינור עיבוד שכותרתו כראוי הכנת מכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 6.5 מיליליטר של חיץ דילול מדגם זה. מערבבים על ידי היפוך 5x מדגם. צנטריפוגה מדגם ב XG 800 עבור 10 דקות עם הבלם במצב &quot;כבוי&quot;. בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לטעון את כל דגימות המטופל על המערכת לעיבוד. דגימות חייבות להיות מעובד בתוך 1 שעות של הכנה. </li></ol> 2. בקרת הכנה לעיבוד בכלי ההכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת בקבוקון השליטה ולהפוך 5x לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הפקק מבקבוקון השליטה ולמקם את צינור עיבוד הפוך הכנת מכשיר על גבי הבקבוקון הסיר את המכסה. בתנועה אחת מהירה, להפוך אתלשלוט בבקבוקון, ויוצקים את התוכן לתוך צינור העיבוד. אמנם הפוך, בעדינות קפיצית הצדדים של בקבוקון השליטה לשחרר את כל תכנים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את בקבוקון שליטה ההפוכה מצינור העיבוד, הבטחה כי נוזל לא הולך לאיבוד ומניח בצד. בעזרת פיפטה 1,000 μl, לאסוף כל תוכן שנותר מהבקבוקון ואת המכסה ובעדינות פיפטה לתוך צינור העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה כדי לטעון את השליטה על המערכת לעיבוד. </li></ol> 3. סריקה לדוגמא על כלי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות המופיעים על מסך על מכשיר ההכנה לפרוק את כל הדגימות מהמערכת. באופן רופף כובע כל מחסנית מכשיר מגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ואניncubate בחושך לפחות 20 דקות בטמפרטורת חדר. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כלי הניתוח ולאתחל את המנורה. ברגע שחמם (~ 15 דקות), טענת את מחסנית אימות מערכת על גבי מכשיר הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת QC. בצע את ההוראות המופיעים על מסך כדי לבצע את אמצעי בקרת איכות הנדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם על כלי הניתוח ובחר את כרטיסיית בדיקת החולה. כל המידע שנשמר ממכשיר ההכנה יוצג. לחץ על התחל כדי לאתחל סריקת מדגם. המערכת תבצע מיקוד גס וגילוי קצה של מחסנית המכשיר המגנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כל הקצוות לפי צורך באמצעות מקשי הכיוון. בחר קבל. המערכת תבצע להתמקד בסדר ולהתחיל סריקת מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה בעקבות סריקת התוצאות צריכה להיות מאומתת באמצעות הקריטריונים שהוגדרו לתאים זינקו ב גבוה (CK + DAPI + CD45 - APC +) ונמוך (CK + DAPI + CD45 - FITC + ריכוזים). מדגם מטופל בעקבות סריקת התוצאות צריך להיבדק לCTCs נתפס באמצעות הקריטריונים המוגדרים CTC (CK + DAPI + CD45 -). </li></ol> 2. אפיון CTC לסמנים המוגדר על ידי משתמש באמצעות CSS 1. הכנת סמנים מוגדר משתמש ומכשיר האתחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן של עניין באמצעות ונד ראשי נוגדן ממס לריכוז הרצוי בכוס מגיב סמן באמצעות הנוסחה הבאה, שבו ריכוז העבודה הוא הריכוז של הנוגדנים לאחר בנוסף למדגם וריכוז המניות הוא הריכוז של נוגדנים ב כוס מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, להתאים את כמויות הנוגדנים כפי שמתואר בטבלה 1. מניחים את הכוס מגיב סמן למקום 1 במחסנית מגיב וload המחסנית על CSS. ריכוז מניות = (ריכוז עבודה x 850 μl) / 150 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם, להכין את הדגימות, ולטעון את מכשיר ההכנה כפי שמתואר בתקן הנ&quot;ל CTC ספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS. כדי לאפשר תוספת סמן מותאמת אישית, בחר מוגדר משתמש Assay כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי מכשיר ההכנה. קלט את שם הסמן ובחר שמור. כדגימות הועמסו על המכשיר, המפעיל יתבקש לציין שאמור לקבל סמן מותאם אישית על ידי בחירה כן או לא בהתאם לצורך. </li></ol> 2. סריקת מדגם של סמנים מוגדרי משתמש בכלי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS </sטרונג&gt; פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. כדי לאתחל את ערוץ FITC, בחר CellSearch CTC כזהות קיט תחת סעיף בדיקת הפרוטוקולים. מתפריט זה, מחקר CTC בחר, לחץ על לחצן ערוך ולהגדיר את זמן החשיפה בהתאם לצורך. מומלץ כי זמן חשיפה של 1.0 שניות לא יהיה חריגה בעת שימוש בערכת CSS CTC כמו זה יכול להגדיל לדמם דרך לערוצי ניאון אחרים מנוצלים לזיהוי CTC. </li></ol> 3. עיבוד של CSSProtocol התקן לשימוש במודלים פרה מאוס ** מעובד מתוך Veridex עכבר / עכברוש CellCapture ערכה (כבר לא זמין באופן מסחרי) 1. עכבר של אוסף דם ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף דם, לרוץ ~ 30 μl של 0.5 M EDTA קדימה ואחורה באמצעות מחט G 22, משאיר כמות קטנה של EDTA ברכזת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לאסוף מינימום של 50 μl של דם עכברים מעכברים שהוזרק בעבר עם תאים סרטניים אנושיים דרך נתיבים, וריד זנב, או intracardiac orthotopic. לאסוף דם מוריד saphenous (לניתוח CTC סידורי) או על ידי לנקב לב (לניתוח CTC מסוף). הסר את המחט ולוותר על דם לתוך צינור איסוף דם microtainer EDTA 1 מיליליטר. מערבבים על ידי היפוך או צינור בעדינות קפיצי למניעת קרישת דם. דם עשוי להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסן בטמפרטורת חדר למשך עד 48 שעות הבאות התוספת של נפח שווה של חומר משמר סלולארי CytoChex. </li></ol> 2. CTC העשרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ריאגנטים CSS מהמקרר ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המקבילה של 50 μl של דם לזרימת x 75 מ&quot;מ 12 cytometry צינור. הוסף 500 μl של חיץ דילול מדגם זה, שוטף את כל דם שנשאר על הדפנות של הצינור. במידת צורך, ספין צנטריפוגות קצרניתן להשתמש בם כדי לאסוף את כל דם שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת ferrofluid אנטי EpCAM ולהוסיף 25 μl לכל דגימה על ידי הצבת קצה פיפטה ישירות לתוך המדגם. הוסף 25 μl של מגיב שיפור לכידת ומערבולת בעדינות לתערובת. דגירה דגימות בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינורות מדגם לתוך המגנט ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק. </li></ol> 3. CTC מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב 50 μl של חומצות גרעין דאי, 50 μl של הכתמה מגיב, 1.5 μl של אנטי עכבר CD45-APC, 5.0 μl של אנטי אנושי HLA-Alexa פלואוריד 488, ושל permeabilization 100 μl מגיב. לקבלת דוגמיות מרובה, ריאגנטים אלה עשויים להיות מעורבבים מראש ו206.5 μl של תערובת ניתן להוסיף לכל מבחנה. מערבולת בעדינות לתערובתדגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ דילול, מערבולת בעדינות, דוגמיות המקום אל המגנט, ודגירה של 10 דקות. בעוד צינורות המדגם עדיין במגנט, להשתמש פיפטה זכוכית כדי לשאוב בזהירות את הנוזל שיורית בלי לגעת בקיר של הצינור ליד המגנט וזורק. הסר את צינורות מדגם מהמגנט וresuspend ב350 μl של חיץ דילול. מערבולת בעדינות לתערובת. </li></ol> 4. טעינת התקנים מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קצה טעינת ג&#39;ל, מעביר בזהירות את כל הנפח מצינור המדגם לתוך מחסנית במכשיר המגנטי. התחל בתחתית המחסנית ולסגת באיטיות את הקצה כמדגם הוא לוותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הדגימה הועברה, באופן רופף מכסה את מחסנית המכשיר המגנטית והקש על המכשיר המגנטי באמצעות ידיים או במעבדת ספסל כדי לשחרר את כל בועות שנדבקו לקצוות של המחסנית, כמתואר בsection 3.1 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה באמצעות CSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פופ כל בועות באמצעות מחט G 22 סטריליים על ידי לכידתם בין פוע וקצה המחסנית. ברגע שכל הבועות הוסרו, בתוקף מכסה את המחסנית, להניח את המכשיר המגנטי שטוח, ודגירה בחושך לפחות 10 דקות. דגימות חייבות להיות נסרקו תוך 24 שעות של הכנה. </li></ol> 5. סריקה של דוגמאות מופרדים באופן ידני בכלי ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כלי הניתוח, אתחל את המנורה, ולבצע בקרת איכות ואימות מערכת כפי שתואר בסעיף 3.2 של התקן CTC הספירה מדגימות דם חולה תוך שימוש בפרוטוקול ה-CSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם על כלי הניתוח ובחר בכרטיסייה ההגדרות. נקה את כל הנתונים קיימים על כפתור נתוני מכשיר המגנטי על ידי לחיצה על הכפתור לדוגמא עיצוב. אפשר ערוץ FITCnd להגדיר את זמן חשיפה ל1.0 שניות כפי שתואר בסעיף 2.2 אפיון CTC לסמנים מוגדר משתמש באמצעות CSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית בדיקת החולה ובחר עריכה כדי קלט את המידע לדוגמה. בחר CellSearch CTC כזהות קיט ומחקר CTC כפרוטוקול בדיקה. קלט את המידע הדרוש שנותר כפי שצוין ככוכבית. שמור את המידע לדוגמא ולחץ על התחל. </li></ol>

<ol><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li>
<li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li>
<li>Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cell+%28CTC%29+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+%28CRPC%29%3A+a+single-centre+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li>
<li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+analysis%3A+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li>
<li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li>
<li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+detection+systems%2C+molecular+characterization%2C+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+liquid+biopsy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li>
<li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li>
<li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cytomet.+A%22%5BJournal%5D)">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li>
<li>Fehm, T., Müller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%3A+a+prospective%2C+multicenter+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients%3A+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li>
<li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment%3A+the+M77001+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li>
<li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li>
<li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metast%22%5BJournal%5D)">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li>
<li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li>
<li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li>
<li>Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li>
<li>White Pages, V. eridex , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF">http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF</a> (2008).</li>
<li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li>
<li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li>
<li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response%2C+progression-free+survival%2C+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li>
<li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Epithelial-mesenchymal+transition%3A+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li>
<li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer%3A+the+importance+of+being+mesenchymal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li>
<li>Königsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li>
<li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li>
<li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer%3A+The+effect+of+neoadjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li>
<li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li>
<li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li>
</ol>

המחבר (ALA) זכה למימון שהועמד על ידי Janssen אונקולוגיה, אשר חברה האם של חברת Johnson &amp; Johnson גם בעלי Janssen אבחון LLC, אשר מייצר ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

למרות ההתפתחות של טכנולוגיות רבות CTC חדשים מאז כניסתה של CSS ב2004, טכניקה זו היא עדיין הטכנולוגיה שאושרה קליני רק על השוק היום, ולכן זה נחשב תקן הזהב הנוכחי לאיתור CTC ופקידה. כתב היד הזה הוכיח שלמרות שיש לו את CSS תקני בקרת איכות קפדניים זה יכול להיות כפוף להטית פרשנות וכי זיהוי CTC בדגימות מטופל הוא שונה בהרבה מזיהוי בדגימות ממוסמר. שש קטגוריות של פריטים נפוצים סותרים זוהו שיכול לגרום misclassifications CTC להתרחש. פריטים סותרים אלה מדגישים את הצורך במספר בודקים בכל דגימת מטופ...

בשנת 2013 הערכה הוא כי 580,350 אנשים ימותו מסרטן וש1,660,290 מקרים החדשים של מחלה זו יאובחנו בארצות הברית לבדה 1. רוב מקרי המוות הללו מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית 2. חוסר הנוכחי של טיפולים יעילים בטיפול בגרורות ובהבנה מוגבלת של המפל גרורתי הופך שלב זה של מחלה קטלני ביותר. נוכחותם של תאים סרטניים במחזור (CTCs) בתוך זרם הדם הוכח לתאם עם מחלה גרורתית 3. תאים אלה הם נדירים ביותר וזיהוי שלהם מעיד על הישרדות כוללת בשד גרורתי 4, 5 ערמונית, וסרטן מעי גס 6. בחולים אלה, הנוכחות של ≥ 5 (שד וערמונית) או ≥ CTCs 3 (מעי גס) ב7.5 מיליליטר של דם מעיד על פרוגנוזה גרועה יותר בהשוואה לאותם חולים עם פחות או ללא CTCs לזיהוי בסאםדם דואר בנפח. בנוסף, השינוי במספר CTC במהלך או לאחר התערבות טיפולית הוכח להיות שימושי כמנבא של תגובה לטיפול, לעתים קרובות מוקדם יותר מאשר טכניקות מנוצלים כיום 7-10. הערכה הוא כי בחולי סרטן גרורתי, CTCs מתרחש בתדירות של כ 1 CTC לכל 10 5 -10 7 תאי mononuclear דם ובחולים עם מחלה מקומית, תדר זה ​​יכול להיות אפילו נמוך יותר (~ 1 ב10 8). הטבע הנדיר של תאים אלה יכול לעשות את זה קשה לזהות באופן מדויק ואמין ולנתח 11 CTCs. מספר שיטות (נבדק בעבר 12-14) כבר נוצל כדי להעשיר ולזהות תאים אלה על ידי ניצול מאפיינים שמבדילים אותם מסביב מרכיבי דם. באופן כללי, ספירת CTC היא תהליך בן שני חלקים שדורש הן צעד העשרה ושלב זיהוי. באופן מסורתי, את הפעולות העשרה מסתמכות על הבדלים בחינוך גופנימאפייני iCal של CTCs (גודל תא, צפיפות, deformability) או על ביטוי סמן חלבון (כלומר מולקולת הידבקות תא אפיתל [EpCAM], cytokeratin [CK]). בעקבות העשרה, זיהוי CTC יכול להתבצע במספר הדרכים שונות, הנפוץ ביותר מהם מבחני המבוססים על חומצות גרעין ו / או גישות cytometric. כל אחת מאסטרטגיות אלה הם ייחודיים, שיש יתרונות וחסרונות ברורים, עם זאת כל שחסר להם סטנדרטיזציה; הכרח עבור כניסה להגדרה הקלינית. מערכת CellSearch (CSS) לפיכך פותחה כדי לספק שיטה סטנדרטית לזיהוי והספירה של CTCs הנדיר בדם אדם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וטכניקות המבוסס על נוגדן 4-6. פלטפורמה זו נחשבת כיום לסטנדרט בספירת CTC הזהב והיא הטכניקה היחידה שאושרה על ידי ארה&quot;ב מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לשימוש במרפאת 15. CSS הוא שתי consistin פלטפורמת רכיבגרם של, (1) מערכת CellTracks AutoPrep (להלן ככלי ההכנה), שממכנת את הכנת דגימות דם של בני אדם, ו (2) CellTracks מנתח השני (להלן ככלי ניתוח), אשר סורק את אלה דוגמאות הבאות הכנה. כדי להבחין CTCs את זיהום לויקוציטים מכשיר ההכנה מעסיק נוגדן בתיווך, גישת הפרדה מגנטית מבוסס ferrofluid ומכתים הקרינה ההפרש. בתחילה, מערכת תוויות CTCs באמצעות נוגדנים אנטי EpCAM מצומדת לחלקיקי ברזל. המדגם הוא מודגרות אז בשדה מגנטי, וכל התאים ללא תווית הם aspirated. תאים סרטניים שנבחרו resuspended, וטופחו בכתם הקרינה ההפרש, בהיקף של נוגדני fluorescently שכותרתו ומגיב מכתים גרעיני. לבסוף, המדגם מועבר למחסנית מגנטית, הנקרא MagNest (להלן כמכשיר המגנטי), וscanned באמצעות כלי הניתוח. מכשיר הניתוח משמש לסריקת דגימות מוכנות באמצעות מסנני הקרינה שונים, זה מותאם לחלקיקי הניאון המתאימים, באמצעות עדשה אובייקטיבית 10X. CTCs מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי EpCAM, אנטי הפאן CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18, ו19), ואת הכתם הגרעיני 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). לעומת זאת, לויקוציטים לזהם מזוהים כתאים המאוגדים על ידי אנטי CD45-allophycocyanin (APC) וDAPI. בעקבות סריקה, תאים סרטניים פוטנציאליים המוגדר על מחשב מוצגים למשתמש. מתמונות אלה, המשתמש חייב להעסיק ניתוח איכותי באמצעות הפרמטרים המוגדרים ומכתים ההפרש שנדונו לעיל, כדי לקבוע שאירועים הם CTCs. בנוסף לאספקת שיטה סטנדרטית לספירת CTC, CSS מאפשר לאפיון מולקולרי של CTCs המבוסס על סמני חלבון של עניין. זה ג החקירהלהתבצע ברמת התא הבודד, באמצעות isothiocyanate והעמסת (FITC) ערוץ הקרינה אינו נדרש לצורך זיהוי CTC 16. למרות שפלטפורמה זו מספקת את היכולת לאפיון מולקולרי, התהליך מפורט של פיתוח פרוטוקול ואופטימיזציה אינו מוגדר היטב. שלושה סמנים זמינים מסחרי פותחו על ידי היצרן לשימוש עם CSS, ובכלל זה צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן (EGFR), גורם קולטן אנושי צמיחת אפידרמיס 2 (HER2), וגורם גדילה דמוי אינסולין קולטן 1 (IGF-1R). ניתוח HER2, בשילוב עם CSS, נוצל על ידי מספר קבוצות כדי להמחיש את הפוטנציאל לאפיון CTC להודיע ​​קבלת החלטות קלינית ואפשרות לשנות את הנחיות טיפול קיימות. לדוגמא, Fehm et al. 17 הראו כי כשליש מחולי סרטן השד עם גידולים מסוג HER2 העיקרי היה HER2 + CTCs. בנוסף, ליו et al.18 דיווחו לאחרונה כי עד 50% מהחולים עם סרטן השד גרורתי + שלה לא היו HER2 + CTCs. הרצפטין, הקולטן HER2 מפריע נוגדן חד שבטי הפגין להועיל לחולים אשר גידולים להביע רמות מספיקות של HER2, הוא טיפול מנוצל בדרך כלל לחולים עם גידולים ראשוניים + HER2 19-21 במידה רבה. עם זאת, מחקרים אלה מראים כי הרצפטין ניתן להיות תת אופטימלי מנוצל וכי אפיון CTC עשוי לסייע בניבוי תגובה לטיפול. סופו של דבר, אפיון CTC יכול להיות הפוטנציאל לשפר את טיפול אישי. מחקר CTC הוא ייחודי בכך שהיא במידה רבה מנוצל גישת מיטה להמעבדתיים. בשיטה זו, בניגוד למחקר מעבדתי למיטה, אשר לעתים קרובות יכול לקחת שנים כדי להשפיע על טיפול בחולה, אפשרה כניסה מהירה CTCs להגדרה הקלינית. עם זאת, רופאים מהססים להשתמש בתוצאות מניתוח CTC בהחלטות Mak טיפול בחולהing בשל חוסר הבנה של הביולוגיה הבסיסית שלהם. לכן מודלים עכבר פרה מתאימים של טכניקות גרורות וניתוח CTC משלים חייבים להיות מנוצלים על מנת לחקור השאלות קשות האלה. באופן כללי, ישנם שני סוגים של מודלים פרה לשמש כדי לחקור את המפל גרורתי, (1) מודלים גרורות ספונטניות, המאפשרים הלימוד של כל השלבים במפל גרורתי, ו (2) מודלים גרורות ניסיוניים, המאפשרים רק ל המחקר של צעדים מאוחר יותר בתהליך גרורתי כמו extravasation והיווצרות גידולים משניים 22. מודלים גרורות ספונטניים, כרוכים בזריקות של תאי גידול למיקומים מתאימים orthotopic (למשל הזרקה של תאי סרטן ערמונית לבלוטת הערמונית לחקר סרטן הערמונית). לאחר מכן ניתנו תאי זמן כדי ליצור גידולים ראשוניים וספונטאניות לשלוח גרורות לאתרים משניים כגון עצמות, ריאות, ובלוטות לימפה. בתוךלעומת זאת, מודלים גרורות ניסוייות כרוכים בהזרקה ישירה של תאים סרטניים למחזור הדם (לדוגמא דרך וריד זנב או הזרקת intracardiac למקד תאים למקומות ספציפיים) ולכן לדלג על השלבים הראשוניים של intravasation והפצה לאיברים משניים 22. עד כה רוב ניתוח CTC בin vivo מערכות מודל שבוצע באמצעות או 23 או מותאם טכניקות מבוססות cytometry מבוסס אנושי CTC (למשל AdnaTest) 24. אמנם שימושי, אף אחת מטכניקות אלה משקף באופן נאות ספירת CTC באמצעות CSS תקן זהב. בהתבסס על האישור הקליני, הטבע סטנדרטי, ושימוש נרחב של CSS, הפיתוח של טכניקת CTC לכידה וזיהוי לin vivo דוגמנות שמנצלת הכנת מדגם מקבילה, עיבוד, וקריטריוני זיהוי יהיה יתרון כתוצאות תהיה דומות לאלה מתקבל דגימות מטופל. עם זאת, בשל הנפח requirements של מכשיר ההכנה לא ניתן לעבד כמויות קטנות של דם באמצעות פלטפורמה אוטומטית זה. . בנוסף, העבודה קודמת של אליאן ואח&#39; 25 הוכיחה כי זיהום של דגימות עם תאי האפיתל בעכבר (שגם עומדות בהגדרה CTC הסטנדרטי [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) יכול להוביל לסיווג מוטעה של תאי אפיתל קשקש עכבר כמו CTCs. כדי לטפל בבעיות אלה בטכניקה מותאמת המאפשרת הניצול של חומרים כימיים ערכת CSS CTC בשילוב עם הליך בידוד ידני פותח. התוספת של אנטיגן לויקוציטים אנושיים FITC נוגדן הנקרא (HLA) לassay מאפשרת לתאים סרטניים אנושיים כדי להבחין בין תאי אפיתל קשקש עכבר. כתב יד זה מתאר סטנדרטי, שפותח באופן מסחרי ופרוטוקול CSS מותאם לעיבוד דגימות חולים דם ומלכודות נפוצות שעשויות להיות נתקלים, כולל discrepanפריטים לא שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC. בנוסף, ההתאמה האישית של assay ב-CSS כדי לבחון מאפייני חלבון בהגדרת משתמש של CTCs נתפס וטכניקת CSS מותאמת דומה המאפשרת להעשרה וזיהוי של CTCs מכמויות קטנות של דם בעכברי מודל פרה של גרורות מתוארות.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD44-FITC</td><td>BD Pharmigen</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD44-PE</td><td>BD Pharmigen</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי HLA-Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>311415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Bond נוגדן ראשוני מדלל</td><td>Leica</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave שפופרות משמרות</td><td>Veridex</td><td>952820 (20 חבילות) 79100005 (100 חבילות)</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בקרת CTC CellSearch</td> ערכת בקרת <td>CTC Veridex</td><td>7900003</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch</td><td></td> ערכת <td>בקרת Veridex</td> 7900001 <td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC ערכת בקרת</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>ערכת CXC CellSearch</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מכשירים</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck Cell Preservant (aka CytoChex)</td> <td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td> 10 מ"ל פיפטה <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>סרולוגית</td></tr><tr><td>1,000 ומיקרו; l פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 ומיקרו; l קצות</td><td></td><td></td><td></td>פיפטות</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>12 מ"מ x 75 מ"מ צינורות זרימה</td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l טיפים</td><td></td><td></td><td></td>לטעינת ג'ל</tr><tr><td>200 ומיקרו; l פיפטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 גרם מחט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 בצינור פסטר חד פעמי</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה</td><td></td><td></td><td></td>סרולוגית</tr><tr><td>פיפטור</td><td></td><td></td><td></td>אוטומטי</tr> צינור <tr><td>איסוף דם נימי (EDTA)</td> <td>BD Microtainer</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch Analyzer II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>כולל מגנסטים ועגלות אימות</td></tr><tr><td>מערכת CellSearch AutoPrep</td><td>Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect Magnet&nbsp;</td><td>מו"פ D Systems</td><td>MAG997</td><td></td></tr><tr><td>נורת לטקס קטנה</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (ctc) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

רוב מקרי מוות הקשורים לסרטן מתרחשים לאחר התפתחות המחלה גרורתית. שלב מחלה הקטלני ביותר זה קשור לנוכחות של תאים סרטניים במחזור (CTCs). תאים נדירים אלה כבר הוכיחו להיות בעל משמעות קלינית בשד גרורתי, סרטן ערמונית, סרטן מעי גס. תקן הזהב הנוכחי בזיהוי CTC קליני וספירה הוא במערכת ה-FDA פינה CellSearch (CSS). כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הסטנדרטי מנוצל על ידי פלטפורמה זו, כמו גם בשני פרוטוקולים נוספים מותאמים המתארים את התהליך מפורט של סמן אופטימיזציה של משתמש מוגדר לאפיון חלבונים של CTCs מטופל ופרוטוקול דומה ללכידת CTC בכמויות נמוכות מאוד של דם, באמצעות תקן ריאגנטים CSS, ללימוד בעכברי מודל פרה vivo של גרורות. בנוסף, הבדלים באיכות CTC בין דם תורם בריא זינקו עם תאים מתרבית רקמה לעומת SAMP דם חולהles מודגשים. לבסוף, כמה פריטים בדרך כלל סותרים שיכול להוביל לטעויות סיווג מוטעות CTC מפורטים. יחדיו, פרוטוקולים אלה יספקו משאב שימושי עבור משתמשים בפלטפורמה זו מתעניינת במחקר פרה קליני הנוגע לגרורות וCTCs.

תקן CTC ספירת Assay הרגישות והסגוליות של CSS תועדה היטב בספרות. עם זאת, כדי לאמת את התאוששות CTC שווה ערך, זינק (תאי סרטן ערמונית אנושית 1,000 LNCaP) ודגימות דם של בני אדם unspiked מתורמים מתנדבים בריאים עובדו על CSS באמצעות פרוטוקול CSSCTC הסטנדרטי. כצפוי, דגימות unspiked היו חופשיות של CTCs, 0.00 ± 0.00%, והתאוששות CTC הודגמה להיות 86.9 ± 4.71% עבור דגימות ממוסמר (איור 1 א). תמונות בגלריה CSS מתקב...

תאי גידול במחזור (CTCs) הם פרוגנוסטיים במספר סוגי הסרטן גרורתי. כתב יד זה מתאר את מערכת הזהב סטנדרטית CellSearch (CSS) פלטפורמת ספירת CTC ומדגיש שגיאות סיווג מוטעות נפוצות. בנוסף, שני פרוטוקולים מותאמים מתוארים לאפיון סמן מוגדר על ידי משתמש של ספירת CTCs וCTC בעכברי מודל פרה של גרורות שימוש בטכנולוגיה זו.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

ניסוי זה נועד לגילוי רגיש, ספירה ואפיון של תאי גידול מסתובבים (CTCs) מדגימות דם של בני אדם ומדגימות Xenograft של עכברים. ראשית, אסוף את דגימות הדם מבני אדם ו/או ממודלים של סרטן בעכברים, והעשר את ה-CTCs על רקע של לוקוציטים מזוהמים באמצעות סלקציה חיובית לתאים חיוביים ל-epca. לאחר מכן, באמצעות צביעה דיפרנציאלית של CTCs ולוקוציטים, זהה וספור את ה-CTCs.בצעו את האפיון המולקולרי הרצוי של תאי גידול נדירים אלו במעבדה כדי לסייע בבחירת טיפולים ממוקדים עבור חולי סרטן בקליניקה. תוצאות שהושגו באמצעות מערכת cell search מדגימות שניתן לבצע ניתוח CTC ביעילות הן בדגימות דם אנושיות והן בדגימות דם של xenograft בעכברים. פיתוח של פרוטוקולי אפיון CTC נוספים המוגדרים על ידי המשתמש במערכת cell search עשוי לסייע בסופו של דבר בבחירת טיפולים ממוקדים עבור מטופלים.בנוסף, בדיקות CTC דומות שהותאמו לשימוש במודלי קסנוגרפט בעכברים ישפרו את הבנתנו לגבי הביולוגיה הבסיסית של תאים אלו. אסוף 7.5 milliliters של דגימת דם משפחור שימור CTC והעבר אותה באיטיות למסורת עיבוד. הוסף 6.5 milliliters של בופר דילול לכל דגימת דם.הפוך את המבחנה חמש פעמים כדי לערבב וסבב בצנטריפוגה ב-800 ×g למשך 10 דקות. כאשר פונקציית הבלימה (break) במצב כבוי עבור הכנת הביקורת, ערבב בעדינות את המבחנה בוורטקס למשך חמש שניות והפוך אותה חמש פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, הסר את מכסה המבחנה באמצעות מבחנת עיבוד הפוכה, ובתנועה מהירה אחת, העבר את הדגימה.הקש בעדינות על דפנות מבחנת הביקורת כדי להבטיח העברה מקסימלית של הדגימה. הוצא בזהירות את מבחנת הביקורת ההפוכה תוך כדי וידוא שלא אבד נוזל. אסוף את התוכן הנותר מהמבחנה ומהמכסה והוסף אותו בעדינות למבחנת העיבוד.פעלו לפי ההוראות המופיעות על מסך מכשיר ההכנה כדי להטעין את כל דגימות הביקורת והמטופל למערכת לצורך עיבוד. פעלו לפי ההוראות המופיעות על מסך מכשיר ההכנה כדי לפרוק את כל הדגימות מהמערכת. כעת סגרו ברפיות את הפקק של כל מחסנית התקן המגנטי והקישו עליה כדי לשחרר בועות מהדפנות.לאחר מכן, סגרו את המחסנית בחוזקה, הניחו את המכשיר המגנטי בצורה שטוחה והדגירו בחושך למשך 20 דקות לפחות. הפעילו את מכשיר הניתוח ובצעו אתחול למנורה. טענו את מחסנית אימות המערכת אל מכשיר הניתוח.בחר את לשונית בדיקת ה-QC ופעל לפי ההוראות שעל המסך כדי לבצע את מדדי בקרת האיכות הדרושים. לאחר מכן, טען דגימה למכשיר האנליזה ובחר את לשונית בדיקת המטופל. לחץ על start כדי להתחיל את סריקת הדגימה.כווננו את כל הקצוות לפי הצורך באמצעות מקשי הכיוון. לאחר מכן בחרו ב-accept. להכנת סמנים המוגדרים על ידי המשתמש, מהלו את הנוגדן הרלוונטי באמצעות bond primary antibody diluent. הניחו את כוס ריאגנט הסמן בעמדה מספר אחת במחסנית הריאגנטים והעמיסו את המחסנית על מערכת ה-cell search כדי לאפשר הוספת סמנים מותאמים אישית.בחר בבדיקה המוגדרת על ידי המשתמש (user-defined assay) כאשר מכשיר ההכנה יבקש זאת. הזן את שם הסמן ובחר בשמירה. לאחר השלמת עיבוד הדגימה, העמס דגימה למכשיר הניתוח ובחר בלשונית ההגדרות (setup).כדי לאתחל את ערוץ ה-ZI, בחר ב-cell search CTC כמספר הערכה (kit ID) תחת סעיף פרוטוקול הבדיקה. מתפריט זה, בחר ב-CTC research. לחץ על כפתור העריכה (edit) והגדר את זמן החשיפה לפי הרצוי.אספו לפחות 50 µL של דם עכבר לשפופרת מיקרו-סנטריפוגה עם EDTA בנפח של 1 mL וערבבו על ידי הפיכה למניעת קרישה. להעשרה של CTC, העבירו כמות השקולה ל-50 µL של דם מלא לשפופרת ציטומטריה זרימה. הוסיפו 500 µL של בופר דילול לכל דגימה.לאחר שטיפת הדם מדפנות המבחנה, ערבבו בעדינות במערבל Vortex את ה-anti chem thorough fluid והוסיפו 25 µL לכל דגימה. כמו כן, הוסיפו 25 µL של capture enhancement reagent. ערבבו את הדגימות בעדינות במערבל Vortex והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.בשלב הבא, הניחו את מבחנות הדגימה במגנט למשך 10 דקות. שאבו בזהירות את הנוזל שנותר מבלי לגעת בדופן המבחנה הסמוכה למגנט והשליכו אותו, הוציאו את מבחנות הדגימה מהמגנט והוסיפו 50 µL של צבע לחומצות גרעיניות, 50 µL של ריאגנט צביעה, 1.5 µL של anti-US CD 45 A PC, 5.0 µL של anti-human HLA LOR 4 88 ו-100 µL של ריאגנט חדירות (permeable reagent). ערבבו בעדינות במערבל Vortex והדגרו בחושך למשך 20 דקות.בטמפרטורת החדר. כעת יש להוסיף 500 µL של בופר דילול ולערבב במערבל וורטקס. יש להניח בעדינות את מבחנות הדגימה במגנט למשך 10 דקות.שאבו בזהירות את הנוזל שנותר והשליכו אותו. לאחר מכן, השביו את המשקעים ב-350 microliters של תמיפת דילול וערבבו בעדינות באמצעות וורטקס. שאבו את הדגימה לטיפ להעמסה על ג'ל והעבירו אותה למכשיר המגנטי על ידי התחלה בתחתית המחסנית ונסיגה איטית של הטיפ תוך כדי שפיקת הדגימה.לאחר הסרת בועות אוויר, בעזרת מחט סטרילית בכיול 22 gauge, סגרו את המחסנית בחוזקה, הניחו את המכשיר המגנטי בצורה שטוחה והדגירו בחושך למשך 10 דקות לפחות. טענו את הדגימה למכשיר האנליזה ובחרו בלשונית ההגדרות (setup). כדי למחוק נתונים קיימים, לחצו על כפתור עיצוב הדגימה (format sample).בחר ב-cell search CTC כמזהה הערכה וב-CTC research כפרוטוקול הבדיקה. בתפריט זה, ודא שנבחר זמן החשיפה המתאים. בחר בלשונית בדיקת המטופל (patient test) ובחר בעריכה.להזנת פרטי הדגימה, הזן את שאר המידע הדרוש כפי שצוין. לאחר מכן שמור את פרטי הדגימה ולחץ על start כדי לאמת. התאוששות של תאי גידול במחזור הדם, תאי סרטן ערמונית אנושיים שהוזרקו ודגימות דם אנושיות ללא הזרקה מתורמים בריאים, עובדו במערכת cell search באמצעות פרוטוקול ה-CTC הסטנדרטי של cell search.כצפוי, דגימות שלא הוספו להן תאים היו נקיות מתאי גידול במחזור הדם. שיעור השחזור של CTC עבור דגימות שהוספו להן תאים היה 86.9%. תמונות אלו מגלריית החיפוש התאים שהתקבלו מדגימות שהוספו להן תאים הן באיכות אופטימלית, וניתן להבחין בקלות בין ה-CTCs לתאים שאינם CTCs. זיהוי ה-CTCs מאתגר מעט יותר אצל חולי סרטן, כאשר תאים רבים נראים קטנים יותר וקשה יותר להבחין ביניהם לבין תאים שאינם CTCs.בנוסף, בעת סקירת דגימות מטופלים, שש קטגוריות של אירועים הציגו פריטים שנויים במחלוקת באופן נפוץ בין הסוקרים. אלו הם אירועים קטנים, אירועים חיוביים ל-ZI, צביעת cytokeratin עמומה או כתמית, תמונות מפסלות, דילוף (bleed through) של cytokeratin, ו-dpi גדול או שאינו חופף. יש לשקול את בחירת ערכת ה-CTC בעת פיתוח סמנים המוגדרים על ידי המשתמש באמצעות שורת תאים הידועה ככזו המראה 98 4% חיוביות לסמני תאי הגזע הסרטניים CD 44.ערכת ה-CTC המבוססת על FCI סיווגה רק 69.3% מה-CTCs כחיוביים ל-CD 44. עם זאת, בשימוש בערכת CX C המבוססת על PE, 98.8% מה-CTCs סווגו כחיוביים ל-CD 44. אופטימיזציה נאותה של כל סמן המוגדר על ידי המשתמש מחייבת תיקוף באמצעות שורות תאים בעלות צפיפות אנטיגנים גבוהה, צפיפות אנטיגנים נמוכה, ושורות תאים שליליות לסמן הרלוונטי, וזאת כדי להבטיח את הרגישות והספציפיות של הבדיקה. ניסוי זה מעריך את הרגישות והספציפיות של פרוטוקול חיפוש תאי העכבר המותאם.כצפוי, דגימות שאינן מועשרות היו נקיות מ-CTCs בשני הבדיקות ובבדיקת השחזור של ה-CTCs. השימוש בערכה המותאמת לעכברים ובמערכת האוטומטית הסטנדרטית הניב תוצאות דומות; התמונות שהתקבלו באמצעות הפרוטוקול הידני המותאם לעכברים לא נבדלו מאלו שנצפו בשימוש בטכניקה האוטומטית הסטנדרטית.הוספת HLA fits E לבדיקה זו מבטיחה שניתן יהיה להבחין בקלות בין תאי גידול אנושיים לבין תאי אפיתל קשקיים של עכבר, ביצוע דילול סדרתי של דגימות דם של עכבר שהועשרו בתאים, ובחינת המתאם בין מספר התאים הצפוי למספר התאים שהופקו. יש לאשר ששיטה זו רגישה באותה מידה כפרוטוקול ה-CSS הסטנדרטי לבידוד מספר נמוך של CTCs. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע העשרה אוטומטית וידנית של CTCs מדגימות דם אנושיות ומדגימות דם של קסנוגרפט של עכבר.בנוסף, עליך להגיע להבנה מעמיקה יותר של השלבים הדרושים לתכנון ואופטימיזציה של פרוטוקולים לאפיון CTC לשימוש בשילוב עם מערכת חיפוש התאים.

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בתאי הגידול במחזור מבודדים מהדם של חולי סרטן ללא גרימת נזק לתאים. בידוד של תאים סרטניים נעשה באמצעות משטח bimolecular של selectin-E בנוסף נוגדנים כנגד סמנים אפיתל. ציפוי Nanotube במיוחד מקדם תאים סרטניים וכתוצאה מכך הידבקות purities ללכוד גבוהה.

בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

סרטון זה מתאר את בדיקת Immunofluorescence Vaccinefluorescence של תאי הגידול במחזור הדם (CTC), טכניקה לאפיון הסמנים הביולוגיים על תאי גידול במחזור הדם בדגימות של חולי סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים. בדיקה זו יכולה לשמש למעקב אחר שינויים דינמיים של הגידול ותגובה חיסונית, אשר עשויים לשקף את התגובה לכימותרפיה, הקרנות וטיפולים אימונותרפיים אפשריים.

CTC Immunofluorescence Assay : טכניקה לאפיון תאי גידול במחזור הדם

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

פרוטוקול לנצל פולי (N -iso-propylacrylamide) (PIPAAm) מצופה Microfilter עבור יעיל ללכוד ולשחרר thermoresponsive של תאים סרטניים קיימא במחזור (CTC) מוצג. שיטה זו מאפשרת ללכוד של CTC מ 'דם בחולים ושחרורו של CTC קיימא עבור במורד הזרם מחוץ שבב תרבות, מנתח ואפיון.

לכידת שחרור בתאי גידול במחזור קיימא מן הדם

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למדו זיהוי וספירה של תאי גידול מחוללים (CTC) מדגימות דם אנושיות ומודלים של עכברים באמצעות מערכת CellSearch. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולרי לבחירת טיפולים ממוקדים בסרטן.

עיבוד של semiautomated מחזור תא גידול מבחני (CTC) ליישומים קליניים ומחקר הקליני

גלה סרטונים נוספים