מודל גידול מאוס של מתח כירורגי כדי לחקור את המנגנונים של דיכוי מערכת חיסוני לאחר ניתוח והערכת immunotherapies Perioperative רומן

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעה של טיפול חיסוני הניתן בתקופה הפרי-ניתוחית על הפחתת גרורות ומודל עכברי של גידול ולחץ כירורגי. זה מושג על ידי הזרקה ראשונה של ארבעה תאי גידול T אחד בכרית השומן של זיכרון העכבר על מנת ליצור גידול ראשוני. ביום ה-13 או יום אחד לפני ניתוח סרטן, ניתן טיפול חיסוני, אשר משערים כי הוא מחליש מחלה גרורתית לאחר הניתוח ביום ה-14, לאחר השתלת תאי הגידול.

הגידול הראשוני נכרת, ואחריו מתח כירורגי נוסף בצורה של כריתת כליה בטנית ותת-קבוצה של עכברים. השלב האחרון הוא להקריב ולכמת את מספר גושי גידול הריאה הגרורתיים בכל העכברים. בסופו של דבר, מודל עכבר זה של גרורות ספונטניות ומתח כירורגי משמש כדי להראות את ההשפעה המיטיבה של טיפול חיסוני סביב הניתוח.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האונקולוגיה הכירורגית, כגון כיצד ניתוח גדול משפיע על מערכת החיסון וכתוצאה מכך על היווצרות מחלה גרורתית בתקופה שלאחר הניתוח, וכיצד ניתן להשתמש בטיפולים חיסוניים כדי להחליש השפעה זו. מדגים הליך זה כריסטיאנו 10 דוסה, טכנאי מחקר ומעבדתו של ד"ר רבקה להקמת תרבית תאי הגידול. התחל בהנחת 41 תאי גידול ללא שינוי ב-DMEM מלא בלוחות תרבית רקמה של 10 סנטימטר ודגירה שלהם ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 בחממת תרבית רקמה.

פצלו את התרביות פעמיים-שלוש בשבוע לפי הצורך כך שהתאים לא יעלו על 80% מפגש. תוך חודש מהגדרת תרבית התאים, התחל לקצור את תאי הגידול על ידי שאיבת מדיום התרבית מצלחת תרבית הרקמה. הוסף 10 מיליליטר של PBS סטרילי X אחד המכיל שני מיליליטר של EDTA ודגירה על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך חמש עד שבע דקות.

לאחר מכן, לאחר הוצאת תמיסת ה- PBS מהצלחת, יש לשטוף את הצלחת פעמיים-שלוש עם PBS ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בצנטריפוגה ספסל ב-500 Gs וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר השאיבה, הסופרנטנטים השעו מחדש את כדור התא ואת ה-DEM ללא סרום.

לאחר מכן, השתמש במונה תאים כדי לקבוע את ריכוז התאים ולדלל את התאים במדיום חופשי בסרום ל-10 פעמים 10 לששת התאים ל-500 מיקרוליטר ולהניח את התאים על קרח שעה לפני הניתוח. הזריק לעכבר תת עורי 0.05 מיליגרם לק"ג בופרנורפין לטיפול בכאב. לאחר הרדמת העכבר עם 2.5% ISO פלואור, צבט את כרית כף הרגל כדי להבטיח רמת הרדמה נאותה.

לאחר מכן טען מזרק עדין במיוחד בגודל 30 אינץ' עם 50 מיקרוליטר בדיוק של תרחיף תאי הגידול. הקש על צד המזרק כדי לעקור בועות אוויר. המשך הרדמת ISO פלואור, הנח את הצד הגחוני של העכבר כלפי מעלה על שולחן הניתוחים.

כעת הכניסו את המחט אופקית וישירות לתוך כרית השומן הרביעית של הזיכרון והוציאו לאט את נפח המזרק. זה אמור לקחת כדקה אחת כדי לסיים את ההזרקה. השתמש בצמר גפן כדי לנקות כל נזילה לאחר ההזרקה.

אפשר לעכבר להתאושש מההרדמה לפני החזרתו לכלוב שלו. המשך בניהול הכאב על ידי מתן 0.05 מיליגרם לק"ג בופרנורפין תת עורי כל שמונה שעות למשך יומיים לאחר הזרקת תאי פוסטום 13 יום. השתמש בקליפר חיצוני כדי למדוד את גודל הגידול הראשוני.

מדוד את הקוטר או האורך האורכי הגדול ביותר ואת הקוטר או הרוחב הרוחבי הגדול ביותר בעזרת קליפר. הנוסחה האליפסואידית ששונתה משמשת לחישוב נפח הגידול כמחצית מהאורך כפול הרוחב בריבוע. בשלב זה, בהנחה שהגידול הראשוני נמדד כסנטימטר מעוקב אחד, הוכן מגיב הטיפול הפרי-ניתוחי הנבחר, שבמקרה זה הוא נגיף אונקוליטי ב-x אחד, PBS סטרילי.

טען מזרק אינסולין בגודל 27 אינץ' עם 100 מיקרוליטר בדיוק של הטיפול בנגיף האונקוליטי. הסר את כל בועות האוויר מהמזרק. לאחר מכן הנח עכבר לתוך מסנן, והשאיר את הזנב נגיש.

בעזרת מי ברז חמים מחממים בעדינות את הזנב. כדי לדמיין את ורידי הזנב הצדדיים, בחר את וריד הזנב הצדדי והזריק לו את הנגיף האונקוליטי. אם המחט מוחדרת כראוי לווריד לרוחב, אין להרגיש התנגדות בעת לחיצה על המזרק.

בסיום, החזר את העכבר לכלוב שלו למשך הלילה לאחר 14 יום הזרקת תאי פוסטום. טפל בעכבר תת עורי עם 0.05 מיליגרם לק"ג בופרנורפין שעה לפני הניתוח לטיפול בכאב, השראת ושמירה על הרדמה באמצעות 2.5% ISO פלואור. לאחר ביצוע חתך עור של סנטימטר עד שניים, הסר בעדינות את כל ארבעת הגידולים הראשוניים T אחד מכרית השומן של החלב, הגידול וכל הפסולת המחוברת צריכים לצאת בחתיכה אחת.

שמור את הגידול בפורמין לניתוח אימונוהיסטוכימי מאוחר יותר. לאחר כריתת הגידול, סגור את החתך עם שניים עד שלושה סיכות תשעה מילימטרים. השלב הבא הוא ביצוע ניתוח גדול בתת-קבוצה של העכברים.

יש להתחיל בחתך בקו האמצע הגחוני דרך העור והשכבה התת עורית. לאחר מכן בצע חתך של שלושה עד ארבעה סנטימטרים במרפק הליניארי כדי לגשת לצפק. כעת, הזיזו את המעיים העליונים לצד אחד כדי לחשוף את הצד הפנימי השמאלי של הבטן.

שמור על המעיים לחים בעזרת גזה סטרילית ספוגה במי מלח. לאחר מכן, בעזרת זוג מלקחיים כירורגיים קהים, אחוז בעדינות בכליה השמאלית. לאחר מכן השתמש בתפר משי קלוע מצופה שעווה 3.0 הקשור ללולאה כדי לקשור את ההילום של הכליה השמאלית.

אבטח את התפר בשלושה קשרים כירורגיים. כעת הסר את הכליה השמאלית בעזרת מספריים כירורגיים. בדוק היטב את עניבת התפרים כדי לוודא שמושגת המוסטזיס מתאים.

לאחר מכן, סגור את השכבה התת עורית עם תפר לולאה רציף באמצעות חמישה תפרים נספגים קלועים. לאחר מכן מהדקים את שכבת העור באמצעות סיכות תשעה מילימטרים. כריתת הכליה אמורה להימשך 10 דקות לכל בעל חיים.

לאחר ההחלמה, החזירו את החיה לכלוב שלה והמשיכו בטיפול בכאב במשך יומיים על ידי מתן 0.05 מיליגרם לק"ג בופרנורפין תת עורי כל שמונה שעות ב-28 ימים לאחר זריקת הגידול 4 T one, המתת חסד של העכבר וריססו אותו באתנול 70%. התחל את הסרת הריאות באמצעות מספריים כדי לבצע חתך ראשוני ממש מתחת לכלוב הצלעות. חותכים את העור ואת השכבה התת עורית לאורך קו האמצע הגחוני של חלל החזה כדי לחשוף את בית החזה.

לאחר מכן בצע חתכים רוחביים דרך העור והרקמות מכל צד עד הצוואר. כעת, אחוז בעדינות בריאות תוך כדי חיתוך רקמת החיבור עד שהריאות חופשיות. חותכים את קנה הנשימה מעל ההסתעפות, שיחזיק את האונות השמאלית והימנית יחד.

לאחר מכן, טבלו את הריאות שחולצו ב-PBS קר כדי להסיר את שאריות הדם והניחו אותן בגימור פורמין 10% על ידי צילום הריאות להערכת גרורות גידול ושקילתן לכימות עומס הגידול. 14 יום לאחר כריתת הגידול בארבע T one, הריאות נאספו והודגמו לגרורות המוצגות כאן כריאה מעכבר שלא עבר כריתת כליה בבטן. כמה גידולים גרורתיים נראים לעין.

לעומת זאת, כריתת כליה כירורגית מיד לאחר כריתת הגידול הביאה לעלייה ניכרת במספר הגרורות הריאתיות. תמונה זו מציגה ריאות של עכבר שטופל בנגיף אונקוליטי לאחר כריתת גידול וכריתת כליה המוצגות כאן הן ריאות של עכבר שטופל בחיסון נגד שפעת לאחר כריתת גידול וכריתת כליה ספירת גושי גידול הריאה בכל אחת מהקטגוריות הללו מראה עלייה ברורה במספר הגרורות הריאתיות והעכברים שעברו ניתוח כריתת כליה בהשוואה לאלו ללא ניתוח, או כאלה עם התערבות טיפולית טרום ניתוחית. הריאות של העכברים שעברו ניתוח כריתת כליה, אך ללא טיפול טרום ניתוחי שוקלות משמעותית יותר מקטגוריות הבדיקה האחרות.

לפיכך, מתן טרום ניתוחי של וירוס אונקוליטי משוכפל וחיסון שפעת מומת הציל באופן משמעותי את ההשפעות הפרו-גרורתיות של ניתוח גדול לאחר כריתת הגידול. גרפים אלה מראים את מספר גידולי הריאה בעכברים עם מספר תקין או שלם של תאי NK ובעכברים שתאי ה-NK שלהם התרוקנו מבחינה פרמקולוגית באמצעות anasi ALO GM one. לעכברים מדוללי NK הייתה השפעה טיפולית מופחתת של וירוס אונקוליטי סביב הניתוח או אימונותרפיה של חיסון נגד שפעת.

זה מצביע על כך שתאי ה-NK ממלאים תפקיד מתווך במניעת גרורות לאחר טיפול החיסון. כדי לאפיין עוד יותר את תפקוד תאי NK, הרג תאי NK ex vivo הוערך בטיהור DX חמישה תאים חיוביים מבקרות בלחץ כירורגי ולא מטופלים בתרבית עם תאי מטרה יאק אחד. הקו המוצק השחור מציין את יכולת ההרג של תאי NK מעכברים לא מטופלים והקו המקווקו השחור מדגים את יכולת הריגת תאי NK מעכברים בלחץ כירורגי.

הירידה באחוז הציטוטוקסיות המוצגת על ידי המעבר כלפי מטה מהקו המוצק השחור לקו המקווקו השחור מדגימה פגם בתפקוד הציטוטוקסי של תאי NK ובעכברים לאחר הניתוח. הקווים האפורים מצביעים על הרג תאי NK מעכברים שקיבלו טיפול חיסוני, או וירוס אונקוליטי או חיסון נגד שפעת, אך ללא ניתוח. הקווים האפורים המקווקוים מצביעים על יכולת הרג תאי NK מעכברים שקיבלו גם טיפול חיסוני סביב הניתוח וגם ניתוח.

הירידה באחוז הציטוטוקסיות המוצגת על ידי המעבר כלפי מטה מהקו המוצק האפור לקו המקווקו האפור, מדגימה פגם בתפקוד הציטוטוקסי של תאי NK ובעכברים לאחר הניתוח למרות קבלת טיפול חיסוני סביב הניתוח. והכי חשוב, הקווים המקווקוים האפורים עדיין גבוהים בהרבה מהקווים המקווקוים השחורים. זה מצביע על כך שייתכן שניתן יהיה להציל תפקוד ציטוטוקסי של תאי NK המושרה על ידי ניתוח באמצעות טיפול חיסוני סביב הניתוח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מודל חייתי של גרורות ספונטניות ומתח כירורגי על ידי קביעת הגידולים הטובים ביותר. כריתת הגידולים הראשוניים הגורמת ללחץ כירורגי נוסף על ידי כריתת כליה והערכת גושי גידול גרורתיים בריאה בנקודת הסיום. בנוסף, עליכם להבין כיצד ניתן להשתמש במודל זה כדי לחקור את ההשפעות המדכאות של ניתוח על מערכת החיסון המולדת ואת היכולת של אימונותרפיה להפוך את ההשפעה הזו.