Name: ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: חקור את מבנה פקטור VIII המאורגן על ננו-צינורות ליפידים באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים. שיטה זו משלבת ארגון הליקלי עם אלגוריתמי שחזור תלת-ממדי כדי להבהיר את המבנה הקשור לממברנה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק לאומי למדען לפיתוח מאיגוד הלב האמריקאי: 10SDG3500034 וUTMB-NCB להתחיל את הכספים לSSM. המחברים מודים מתקני Cryo-EM ומדעי מחשוב במרכז Sealy לביולוגיה מבנית בUTMB <a href="http://www.scsb.utmb.edu">(www.scsb.utmb.edu),</a> כמו גם בני הזוג. סטיב Ludtke ואד Egelman לעזרה עם אלגוריתמי שיקום סליל 2D and 3D.

<ol><li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).</li>
<li>Fujiyoshi, Y., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+of+proteins+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography of proteins in membranes.</a> Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).</li>
<li>Toole, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+a+cDNA+encoding+human+antihaemophilic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor.</a> Nature. 312, 342-347 (1984).</li>
<li>Fay, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+VIII+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+hematology%22%5BJournal%5D)">Factor VIII structure and function.</a> International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).</li>
<li>Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+membrane-bound+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Domain organization of membrane-bound factor VIII.</a> Biopolymers. , (2013).</li>
<li>Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophilia%3A+new+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+%2F+the+Education+Program+of+the+American+Society+of+Hematology.+American+Society+of+Hematology.+Education+Program%22%5BJournal%5D)">Hemophilia: new protein therapeutics.</a> Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).</li>
<li>Gatti, L., Mannucci, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+porcine+factor+VIII+in+the+management+of+seventeen+patients+with+factor+VIII+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies.</a> Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).</li>
<li>Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+coagulation+Factor+VIII+bound+to+lipid+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes.</a> Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).</li>
<li>Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+recombinant+human+coagulation+factor+VIII+to+lipid+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes.</a> FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).</li>
<li>Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+urease+activates+blood+platelets+through+a+lipoxygenase-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway.</a> Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).</li>
<li>Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+crystallization+of+soluble+and+membrane+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins.</a> Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+helical+filaments+and+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of helical filaments and tubes.</a> Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).</li>
<li>Lusher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+introduction+of+recombinant+factor+VIII--a+clinician%27s+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia+%3A+the+official+journal+of+the+World+Federation+of+Hemophilia%22%5BJournal%5D)">Development and introduction of recombinant factor VIII--a clinician's experience.</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).</li>
<li>Thim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+new+recombinant+factor+VIII+%28N8%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia+%3A+the+official+journal+of+the+World+Federation+of+Hemophilia%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8).</a> Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).</li>
<li>Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+expression+of+recombinant+porcine+coagulation+factor+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+algorithm+for+the+reconstruction+of+helical+filaments+using+single-particle+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods.</a> Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).</li>
<li>Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Dimensional+structure+of+membrane-bound+coagulation+factor+VIII%3A+modeling+of+the+factor+VIII+heterodimer+within+a+3-dimensional+density+map+derived+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography.</a> Blood. 99, 1215-1223 (2002).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה, והם יכולים להיות קשר ישיר לגבי כל הנהלים שפורסמו בכתב היד הזה.

בעבודה זו המתודולוגיה מוצגת להבחין בין שני ארגוני קרום הנכנס של חלבונים הומולוגיים מאוד: FVIII האנושי והחזירי בצינורות שומנים בדם בתנאים נתקלו בגוף האדם התאספו עצמי. בהליך המתואר, אנושי וחזירי FVIII מאורגן בהצלחה helically על צינורות שומנים בדם, המהווים את השלב הקריטי ביותר. השלב הקריטי הבא הוא לשמר את הדגימה בקרח אמורפי דק על ידי הבזק הקפאה בנוז...

קרישת דם פקטור VIII (FVIII) הוא גליקופרוטאין גדול של 2,332 חומצות אמינו מאורגן בשישה תחומים: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. על טרומבין הפעלת FVIII פועל כcofactor לפקטור IXA במתחם Tenase הקרום הנכנס. עקידת FVIII הופעל (FVIIIa) לFIXa באופן תלויי קרום משפרת את יעילות פרוטאוליטי FIXa יותר מ -10 5 פעמים, שהוא קריטי לקרישת דם יעילה 4. למרות התפקיד החשוב FVIII משחק בקרישה וההיווצרות המורכבת Tenase, מבנה FVIII קרום הנכנס הפונקציונלי הוא עדיין לא נפתר. לכתובת זו, צינורות בודדים bilayer שומנים (LNT) עשירים בphosphatidylserine (PS), מסוגלים מחייב FVIII עם זיקה גבוהה 8, 9 ומזכיר את משטח טסיות הדם מופעל פותחו 10. ארגון סליל רצוף של FVIII חייב LNT הוכח להיות effectiיש לקביעת מבנה של מדינת קרום הנכנס FVIII ידי Cryo-EM 5. פונקציונליות LNT הן מערכת אידיאלית ללמוד חלבונים וחלבונים אינטראקציות קרום של חלבוני קרום הקשורים מאורגנים helically ידי 11 Cryo-EM, 12. יש Cryo-EM היתרון על פני שיטות מבניות מסורתיות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ותמ&quot;ג, כפי שהדגימה נשמרה בקרוב ביותר לסביבה הפיזיולוגית (חיץ, קרום, pH), ללא תוספים ואיזוטופים. במקרה של FVIII, לומד את מבנה הקרום הנכנס עם טכניקה זו היא אפילו יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו LNT דומה בגודל, צורה והקומפוזיציה pseudopodia של טסיות הדם מופעל בו מתחמי Tenase להרכיב in vivo. פגמים וחסרים של סיבת FVIII המופיליה, הפרעת דימום חמורה המשפיעה על 1 ב 5,000 זכרים של האוכלוסייה האנושית 4, 6. רוב הדוארטיפול ffective להמופיליה הוא מנהל לכל חיים של FVIII רקומביננטי אדם (hFVIII). סיבוך משמעותי של טיפול FVIII המופיליה רקומביננטי הוא הפיתוח של נוגדנים מעכבים לצורה האנושית המשפיעה על כ 30% מחולי המופיליה 13. במקרה זה, משמש להתרכז FVIII חזירי (pFVIII), כפי שמציג FVIII חזירי תגובתיות צולבת נמוכה עם נוגדנים מעכבים כנגד FVIII וצורות מתחמים פונקציונליים עם FIXa אדם 7 בני אדם. הקמת ארגון הקרום הנכנס של שניהם חזיריים וצורות FVIII אדם חשובה להבין את הבסיס המבני של פונקצית cofactor FVIII והשלכות לעצירת דימום דם. במחקר זה, אנו מתארים שילוב של ננוטכנולוגיה שומנים בדם, Cryo-EM, וניתוח מבנה שנועד לפתור את ארגון הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד. הנתונים שהוצגו Cryo-EM ומבני 3D עבור porci המאורגן helicallyFVIII ne והאנושי על LNT הטעונה שלילי להראות את הפוטנציאל של ננוטכנולוגיה הוצעה כבסיס לקביעת מבנה של FVIII וגורמי קרישת קרום הנכנס ומתחמים בסביבת קרום פיזיולוגית.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 עם LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>פעל ב-200 קילו וולט</td></tr><tr><td>עם תוכנת TEMCON</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 מחזיק קריו</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>מקורר ל-175 ו-deg; C</td></tr><tr><td>עם יחידת בקרת טמפרטורה</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת Gatan 4K x 4K CCD</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4,096 x 4,096 פיקסלים ב-15 &mu; m / פיקסל רזולוציה פיזית</td></tr><tr><td>סולארוס דגם 950 מנקה פלזמה</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פחמן מצופה פחמן 300 רשת רשת נחושת 3 מ"מ</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>פלזמה מנוקה למשך 10 שניות בעוצמה גבוהה</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300 רשת</td><td>אלקטרונים Microscopy Sciences</td><td>Q225-CR2</td><td>מצופה פחמן 300 רשת רשת Cu רשתות עם חורים בקוטר 2 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>אורניל אצטט דיהידרט</td><td>טד פלה</td><td>19481</td><td>תמיסה 1%, מסוננת</td></tr><tr><td>גלקטוזיל סרמיד</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>תוכנת EM Digital Micrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM תוכנה EMAN</td><td>להורדה</td><td></td> בחינם<td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; תוכנת </a></td></tr><tr><td>EM עכביש</td><td>להורדה</td><td></td> בחינם<td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EM תוכנה IHRSR</td><td>להורדה</td><td></td> בחינם <td>תוכניות זמינות מ- אדוארד ה. אגלמן</td></tr> <tr><td>http://people.virginia.edu/~ehe2n/ תוכנת EM (IMOD)</td><td>להורדה בחינם</td><td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM תוכנה (SerialEM)</td><td>הורדה</td><td></td> בחינם<td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>להורדה</td><td></td> בחינם<td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

ארגון סליל של דם קרישת פקטור viii ביפידים צינוריות

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM) 1 היא גישה רבת עוצמה כדי לחקור את המבנה התפקודי של חלבונים ומתחמים בסביבת מדינה וקרום התייבשות 2. קרישת פקטור VIII (FVIII) 3 הוא גליקופרוטאין פלזמה דם מרובה תחומים. פגם או חסר של FVIII הוא הגורם לסוג המופיליה - הפרעת דימום חמורה. עם הפעלת מפרקי חלבונים, FVIII נקשר לפרוטאז סרין פקטור IXA על הממברנה של טסיות הדם הטעונה השלילי, שהוא קריטי לקרישת דם נורמלית 4. למרות התפקיד המרכזי FVIII משחק בקרישה, מידע מבני למצב הקרום הנכנס שלה הוא 5 לא שלמים. תרכיז FVIII רקומביננטי הוא התרופה היעילה ביותר נגד סוג המופיליה וFVIII זמין מסחרי יכול לבוא לידי ביטוי כאנושי או חזירי, שני מתחמים פונקציונליים להרכיב עם אדם פקטור IXA 6,7. &quot;&gt; במחקר זה אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים (Cryo-EM), ניתוח ננוטכנולוגיה שומנים בדם והמבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד:. אנושי וחזירי המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) מתואר. תוצאות הנציג להוכיח כי הגישה שלנו היא רגישה מספיק כדי להגדיר את ההבדלים בארגון הסליל בין שני מאוד הומולוגי ברצף (זהות רצף 86% חלבונים). פרוטוקולים מפורטים לארגון הסליל, Cryo-EM וטומוגרפיה אלקטרון (רכישת נתונים) ET מקבלים. דו ממדי (2D) וניתוח מבנה התל ממדים (3D) מיושם כדי להשיג שחזורי 3D של אדם וחזירי FVIII-LNT נדונה. מבני FVIII-LNT הציגו אנושיים וחזיריים להראות את הפוטנציאל של המתודולוגיה המוצעת לcalculatדואר הארגון הפונקציונלי, הקרום הנכנס של פקטור VIII קרישת דם ברזולוציה גבוהה.

אנושי רקומביננטי וFVIII חזירי אורגנו בהצלחה על helically טעון שלילי LNT bilayer יחידה, שמזכירים את משטח טסיות הדם מופעל. ארגון הסליל של האדם והחזירי FVIII-LNT היה עקבי דרך micrographs הדיגיטלי שנאסף (איור 2). LNT השליטה והאנושית וצינורות סליל FVIII-LNT חזיריות נבחרו ומפולח עם GUI e2helixboxer.py וערכות נתונים ראשוניים שנוצרו עם GUI e2workflow.py, אפשרות חלקיקים בודדת (טבלת 1). <p class="jove_content" style=";text-align:right;d...

אנו מציגים שילוב של מיקרוסקופיה קריו אלקטרונים, ננוטכנולוגיה שומנים בדם, וניתוח מבנה מיושם כדי לפתור את מבנה הקרום הנכנס של שתי צורות FVIII הומולוגיות מאוד: אדם וחזירי. המתודולוגיה שפותחה במעבדה שלנו כדי לארגן helically שתי צורות FVIII רקומביננטי פונקציונליות על צינורות טעונים שלילי שומנים (LNT) הוא תאר.

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להראות כיצד להגדיר את המבנה של הלי פקטור VIII המאורגן על ננו-צינורות ליפידים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים קריו. זה מושג על ידי ארגון ראשון של גורם VIII מטוהר סליל על ננו-צינורות ליפידים ואיסוף נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים בטמפרטורת חנקן נוזלי ובמינוני אלקטרונים נמוכים. לאחר מכן, המבנה הקשור לממברנה של פקטור VIII מחושב על ידי שילוב של חלקיקים בודדים ואלגוריתמים לשחזור תלת מימד סלילי.לאחר מכן נאספים נתוני טומוגרפיה אלקטרונית ונוצר שחזור תלת מימד. בסופו של דבר, מבני ננו צינורות השומנים המחושבים של גורם VIII מאומתים על ידי פילוח נפחי התלת מימד והשוואתם לשחזורי הטומוגרפיה. השיטה המודגמת יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית וקרישת הדם, כגון מהו הארגון הקשור לממברנה של פקטור VIII וכיצד הוא קשור לתפקודו בקרישה.מעבדת GM 2100 מצוידת במערכת הפעלה TE con המורכבת ממחשב המחובר למיקרוסקופ אלקטרונים. מסך עם חלונות הקוראים את מערכת הוואקום, מערכת התאורה, זרמי עדשת HT ושני לוחות הממוקמים משמאל וימין הממוקמים משני צידי העמוד, היסט האלומה, כפתורי XY וכפתורי המקל הרב-תכליתיים או החירשים נמצאים בשני הפאנלים. בלוח השמאלי נמצא כפתור התאורה או הבהירות.הפאנל הימני מכיל את כפתורי ההגדלה והמיקוד ושלושת הכפתורים להדמיית מג אחד, מג שתיים ומאג נמוך, ואחד למצב עקיפה. עבור פרוטוקול זה, רכוש נתונים במג אחד באלפא שתיים באמצעות הגדרות גנריות. הגדר את תנאי התאורה במינון המינימלי או MDS הנדרשים לרכישת נתוני cryo EM עם לחצני F1 עד F שש הממוקמים בשורה העליונה של הפאנל הימני.השתמש ב-F1 כדי להעלות או להוריד את המסך, F שתיים למצב חיפוש ו-F שלוש למיקוד. בחר F ארבע למצב צילום F חמש כדי לכבות ולהדליק את MDS, ו-F שש עבור קרן ריקה, המשמשת להגנה על הדגימה מפני נזקי קרינה על ידי הסטת האלומה. לאחר הכנת דגימות קריו EM, על פי פרוטוקול הטקסט, הכנס את מחזיק הקריו לתוך תחנת הקריו ועם חנקן נוזלי, מלא את העושה של המחזיק ואת עמדת הקריו.כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-192 מעלות צלזיוס, פתח את התריס בקצה המחזיק, הנח את רשת ה-cryo EM שהוקפאה בעבר במקום המיועד והשתמש בטבעת clamp כדי לאבטח אותה. לאחר מכן, הכנס את מחזיק הקריו למיקרוסקופ האלקטרונים והשתמש בחנקן נוזלי כדי למלא מחדש את העושה של מחזיק הקריו ואת תא האנטי אטור. לאחר שהמחזיק התייצב במשך 30 עד 60 דקות, הפעל את הנימה.כאשר החוט רווי, לחץ על F 6 כבוי ופתח את התריס על המחזיק. כדי להציג את הרשת, לחץ על low mag alpha one ואתר אזורים ברשת עם קרח דק. לאחר מכן עבור למג אלפא שניים כדי להגדיר מינון מינימלי או מצב MDS ולרכוש נתוני קריו EM במינוני אלקטרונים נמוכים כדי לא לפגוע בדגימה.בחר F two כדי להגדיר את מצב החיפוש והגדר את ההגדלה ל-40, 000 x. השתמש בכפתור הבהירות כדי להגדיל את הקרן למינון האלקטרונים המינימלי של כ-0.04 אלקטרונים לאנגסטרום בריבוע כפול שניות. לאחר מכן לחץ על diff כדי לעבור למצב עקיפה עם כפתור אורך מצלמת המאג.הגדר את אורך המצלמה ל-120 סנטימטרים. לאחר מכן אתר אזורים ברשת שיש בהם ננו-צינורות ליפידים בחורים של סרט הפחמן בתוך האזורים שנבחרו מראש. לאחר מכן, לחץ על F ארבע כדי להגדיר את מצב הצילום בהגדלה של 40, 000 x והשתמש בכפתור הבהירות כדי להגדיר את התאורה במינונים של 16 עד 25 אלקטרונים לאנגסטרום רבוע כפול שניות.לאחר מכן לחץ על לחצן המיקוד הרגיל כדי להגדיר את תנאי המיקוד, התאם את גובה ה-Z של הדגימה עם לחצני Z למעלה למטה הגדר את המיקוד בין שלילי 1.5 ל-2.5 מיקרומטר שלילי. יישר את מצב החיפוש והצילום על ידי ציור ריבוע במצב חיפוש בשידור חי view חלון בצג המצלמה הדיגיטלית המתאים לאזור שיש לצלם במצב צילום, לחץ F שלוש כדי להגדיר את מצב המיקוד בהגדלה של 100, 000 x. לאחר מכן מקד את התאורה כדי לכסות את שבב ה-CCD ואת ציר ה-Off כדי לא להקרין את האזור שיש לצלם.במצב צילום, כוונן את המיקוד בין שלילי 1.5 לשלילי 2.5 מיקרומטר נכון לאסטיגמציה של התמונה במידת הצורך. במצב חיפוש, בחר את ה-F שמונה L ו-T לתמונה על ידי השגת תמונות חיות בחלון התצוגה החיה במרכז צג המצלמה הדיגיטלית, ב-F שמונה L ו-T בריבוע המצויר בחלון התצוגה החיה. עבור למצב צילום ולחץ על כפתור הרכישה בצג מצלמת המיקרוגרף הדיגיטלי.כדי להקליט תמונה דיגיטלית במצלמת CCD, לחץ על CTRL F כדי לקבל טרנספורמציה מהירה של פורייה כדי לבדוק את האיכות והמיקוד של התמונה הנרכשת. לאחר שימוש בתוכנות עיבוד הדמיה מדעיות בחינם Eman two ו- I-H-R-S-R לביצוע ניתוח תמונה דו-ממדית ושחזור סלילי על פי פרוטוקול הטקסט. כדי להמחיש ולפלח את אמצעי האחסון F שמונה, L ו-T, פתח את השחזורים התלת-ממדיים הסופיים בכלי הבחירה של UCSF, מפת מקטעים של נתוני אמצעי אחסון, ובכרטיסייה מפת מפת מקטעים, בחר אמצעי אחסון ולחץ על מקטע כדי לפלח את נתוני אמצעי האחסון.לאחר מכן לחץ על משמרת בקרה ולחץ על קבוצה כדי לקבץ מקטעים המתאימים לתא יחידה אחד. כדי להדגיש את התכונות המבניות, בחר צבע פעולות כדי לצבוע את המקטעים לפי תא יחידה וסליל. כדי לאסוף את נתוני טומוגרפיית האלקטרונים, רשת מיקרוסקופ האלקטרונים המוכתמת שלילית מועברת למחזיק הטיה יחיד לפני העברת המחזיק להטיה של מיקרוסקופ האלקטרונים.סדרות של פקטור חזירי מאורגן בעל ברית VIII על ננו-צינורות ליפידים נאספו באמצעות תוכנת EM הסדרתית. על פי פרוטוקול הטקסט, התום שוחזר ב-IM והוצג במוד תלת מימד כדי להקטין את גודל השימוש ב-imad bin Val tobin אותו בארבע, ואז השתמש בפקודה IM mod rotate vol כדי לבחור את הזווית המתאימה לסובב את צינור הננו השומני לאורך ציר Y ולסובב את הטומו המלא עם חיתוך הפקודה לשינוי גודל קליפ IM mod, צינור הננו השומני שנבחר לאורך ציר ה-Y משתמש במוד תלת מימד כדי לפתוח את תת-טומו החתוך. לבסוף, לחץ על טומו גרהם כדי לדמיין את הסידור של מולקולות פקטור VII לאורך הפרוסות בציר Z ולאורך ציר Y בנפח תת-טומו.כפי שמוצג כאן, שמיניות F רקומביננטיות אנושיות וחזיריות אורגנו בהצלחה על ליטרים דו-שכבתיים חד-שכבתיים בעלי מטען שלילי הדומים למשטח הטסיות המופעל. איור זה מראה כי הסדר הסלילי, של שמונה F אנושי וחזירי הקשור לממברנה ושכבת השומנים בממוצעי הבקרה הטובה ביותר LNT ו-F 8 LNT 2D מוגדרים היטב וחושף את הווריאציות בארגון הסליל בין שני החלבונים. לוחות אלה מייצגים את השחזורים התלת-ממדיים הראשוניים עבור האדם והחזיר F שמונה L ו-T שבוצעו עם 1000 חלקיקים מייצגים ממערכי הנתונים הסופיים של האדם והחזיר F שמונה L ו-T כאן, עלילות המתאם של קונכיית הפור עבור אדם וחזיר F שמונה LNT מצביעות על רזולוציה של 20.5 אנגסטרומים במתאם קונכיית פורייה השווה ל-0.5 באיור זה.הכרכים האחרונים מציגים שמונה מולקולות F 8 ו-10 חזיריות F, שמונה מולקולות קשורות לממברנה המאורגנות סביב הציר הסלילי. כל מולקולת F שמונה אנושית מתורגמת ל-41.2 אנגסטרומים ומסתובבת ב-42.0 מעלות מהקודמת, וכל מולקולת F שמונה חזירית מתורגמת ל-35.9 אנגסטרומים ומסובבת ב-35.2 מעלות מהמולקולה הקודמת המתאימה לפרמטרים הסליליים של השחזורים התלת-ממדיים הסופיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים קריו של חלבון חום ממברנה המאורגן על ננו-צינורות שומנים, ולחשב מבנה תלת מימדי קרוב למצב פיזיולוגי.הסרטון הזה, זהו צעד ראשון לקראת מבנה ברזולוציה גבוהה של חלבון קרישה, שניתן ליישם על חלבונים אחרים המתפקדים בסביבת שומנים.

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מחקר זה מתאר assay microplate רומן שמודד את פעילות קרישת FV במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית שלא דווח בעבר. השיטה משתמשת בקורא microplate הקינטית ברציפות כדי למדוד את השינוי בספיגה ב405nm במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית.

מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

אנו מדווחים על יישום חכם של ננו-צינורות פחמן לייצוב קינטי של חלקיקי שומנים המכילים ננו-מבנים בהרכבה עצמית בליבותיהם. הכנת חלקיקי שומנים דורשת ריכוזים נמוכים למדי של ננו-צינורות פחמן המאפשרים את השימוש בהם ביישומים ביו-רפואיים כגון מתן תרופות.

הכנה קלילה של פנימית עצמית התאספו חלקיקים ליפידים מיוצב על ידי פחמן

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

מאמר זה מתאר מודל ניסיוני של המוסטאסיס המודד פונקציה וקרישה טסיות זמנית. טסיות קרינת הפיברין נמדדות בזמן אמת, וקצב הידבקות טסיות דם, קרישת שיעור, והתחלה של קרישה נחושה. המודל משמש כדי לקבוע מאפיינים טסיות procoagulant תחת זרם מתרכז עבור עירוי.

מודל לשכת תזרים Microfluidic עבור עירוי טסיות המוסטאסיס מודד הפקדת טסיות והיווצרות הפיברין בזמן אמת

בנייר זה, אנו מתארים שיטה להערכת Willebrand פון אנדותל מקדם שחרור, טסית דם עוקבות של לכידת תחת גזירה נוזלים בתגובה לגירויים דלקתיות באמצעות מערכת קאמרית זרימה במבחנה .

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

מחקר זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים באמצעות המסת קרישי דם, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית.

גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים

בדיקות טרומבוליזה חוץ-גופית נאבקו לעתים קרובות לשכפל תנאי in-vivo בין אם בפקקת המודל המעוכלת או בסביבה שבה מתרחשת פקקת. במאמר זה, אנו חוקרים כיצד צימוד לולאת צ'נדלר ובדיקת פיברינוליזה פלואורומטרית זורמת בזמן אמת (RT-FluFF) משמש לניטור ליזה של קרישי דם באיכות גבוהה, ex-vivo.

מעקב אחר פיברינוליזה של קרישי דם שלמים שנוצרו בלולאה של צ'נדלר תחת זרימת גזירה במודל פקקת חוץ גופית

עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.

מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

חקור את מבנה פקטור VIII המאורגן על ננו-צינורות ליפידים באמצעות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים. שיטה זו משלבת ארגון הליקלי עם אלגוריתמי שחזור תלת-ממדי כדי להבהיר את המבנה הקשור לממברנה.

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

גלה סרטונים נוספים