Name: בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: למדו לבודד RNA מקושר לריבוזומים מרקמות מערכת העצבים המרכזית בעכברים באמצעות שיטת היפוך חלוקת פוליריבוזומים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תרגום mRNA בתנאי in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF), הביולוגיה מערכות איתות בסרטן (הלמהולץ ברית במערכות ביולוגיה) והמרכז לחקר הסרטן הגרמני (DKFZ).

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות של DKFZ. זהירות: כדי למנוע זיהום RNase של דגימות, לנקוט באמצעי זהירות בסיסית למניעת הזיהום RNase ולהכין את כל המאגרים במי DEPC שטופל. 1. הכנת עירובי סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 ופתרונות סוכרוז 50% (ראה טבלה 1). התחל בהכנה על ידי הוספה הדרגתיים לאט 2 מיליליטר של 50% תמיסת סוכרוז לחלק התחתון של צינור ultracentrifuge polyallomer. להקפיא את השכבה על ידי הנחת צינורות עבור 20 דקות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את השכבות הבאות בהפחתת אחוזי סוכרוז בצעדי הקפאה שביניהם, שהסתיימה עד סוכרוז 17.5%. שמור הדרגתיים על קרח במהלך תוספת של פתרונות סוכרוז כדי למנוע הפשרה של שכבות שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הדרגתיים סוכרוז טרי יום אחד לפני השימוש ולשמור על 4 ° C. Alternatively, להכין הדרגתיים מראש, חנות ב -80 מעלות צלזיוס והפשרה על 4 מעלות צלזיוס בלילה שלפני הניסוי. </li></ol> 2. הכנת רקמה (כבל ו / או מוח השדרה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר על ידי מנת יתר של Xylazin וKetamin בNaCl וtranscardially תנקב עם 20 מיליליטר של התמיסה של האנק מאוזן מלחים (HBSS) המכילה 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר שמשתק את הריבוזומים בתמלילים קשורים. לאשר הרדמה נכונה על ידי אי - היענות לצובט הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ רקמות במהירות. פתח את dorsally הגולגולת ולחלץ את המוח. בצע laminectomy של כל בית החזה ועמוד השדרה המותני ולחלץ את חוט השדרה. השתמש במוח כולו (~ מ&quot;ג 400) או חתיכת חוט השדרה (~ מ&quot;ג 90) 4 סנטימטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמה לתוך מאגר המגון קר כקרח (ראה טבלה 1) (בחוט השדרה: 1 מיליליטר; מוח: 4 מיליליטר) וקוביות לחתיכות קטנות עם אזמל נקי כדי לאפשר ספיגה מוגברת של cycloheximide. Perfo<html> rm כל צעדים נוספים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות וhomogenize רקמה באופן מכאני באמצעות homogenizer Dounce. המגון מבוקר בקפידה יש ​​צורך להבטיח שגרעינים יישארו ללא שינוי. לטפל בכל הדגימות בדיוק באותו אופן, כדי להבטיח השוואתיים. הערה: לרקמת מוח: לשבש את רקמה על ידי 5 משיכות עם העלי בחוזקה הולם. לרקמה בחוט השדרה: לשבש ידי 5 משיכות עם העלי רפוי, ואחרי 5 משיכות נוספות עם העלי בחוזקה הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquots (400 μl למוח ו200 μl לחוט השדרה), הקפאת הבזק ולאחסן ב -80 ° C לסך בידוד RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגרעינים ותא בלא הפרעה ושברי רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 500 10 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה במהירות נמוכה מונעת אובדן של הריבוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברי Lyse קרום בsupernatant בחינם הגרעינים ל30 דקות על ידי הוספת NP-40 וחומרי ניקוי deoxycholate נתרן (כל אחד לריכוז סופי של 1%). </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 3. הנפקה המיאלין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה מסיר רכיבי שומן מן המדגם שאחרת יהיה להסוות את האות בפרופיל polyribosome. ראשית, דליים מראש צינת ultracentrifuge והרוטור על 4 מעלות צלזיוס ולהכין 2 M, 1.1 M ופתרונות סוכרוז 0.9 M (ראו טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים lysate עם 1.22 כרכים של 2 תמיסת סוכרוז M ולהעביר לתוך צינור ultracentrifuge פוליאתילן. למלא את כל הצינורות לנפח שווה של 10 מיליליטר עם 1.1 M תמיסת סוכרוז, לאחר מכן כיסויו בזהירות עם 0.9 M תמיסת סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות ultracentrifuge לסלים ultracentrifuge טרום צוננים. צנטריפוגה במשך 3 שעות ב 100,000 XG ב 4 ° C. במהלך תהליך זה הריבוזומים להיות מופקד בגלולה ואילו רכיבי שומן יצופו למעלה ויישארו בsupernatant. </li></ol> 4. סוכרוז Gradient היפוך חלוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו לפזר גלולה במאגר הומוגניזציה ב &#39;(ראה טבלת מס&#39; 1 </strong&gt;). מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר עבור כל דגימה באמצעות Nanodrop או מכשירים שווי ערך ולנרמל את הכמויות כדי לטעון לפי הערך ספיגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הדרגתיים סוכרוז (הכנה מתוארת בסעיף קודם) לתוך דליי ultracentrifuge טרום צוננים. דגימות שכבה בזהירות על גבי השיפוע. הוספת שיפוע סוכרוז ריק אחד כמו שליטה טכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המשקל של כל אחד מהסלים עם חיץ הומוגניזציה. צנטריפוגה דגימות ל1.5 שעות ב285,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בהכנות דקות ISCO fractionator 30 לפני סוף צנטריפוגה. אם דגם אחר של fractionator משמש, בצע את הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הרגישות המתאימה (0.2 AUFS למוח או 0.05 AUFS לחוט השדרה) למנורת UV ולעבור אותו לחימום. להרכיב את מדקר הצינור, לחבר אותו באמצעות המשאבה מתגלגלת 60% תמיסת סוכרוז דרך מדקר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתקנה על ידי שאיבת סוכרוז (זרימת עכברושדואר: 1 מיליליטר / דקה), ובמיוחד לוודא שאין דליפות בtubings אשר להכניס בועות לתוך השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליטת רקע ריקה על ידי שאיבה ידנית חיץ שיפוע לתוך גלאי UV ותיקון קו הבסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את דליי ultracentrifuge המכילים סוכרוז הדרגתיים עם דגימות משקעים מהרוטור ומניח אותם על קרח. הימנע מכל הקפצת של הדרגתיים על מנת למנוע אובדן של רזולוציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדרגות לרוץ על fractionator. הפעל הדרגות ריקות ראשון להעריך ספיגת רקע ולהבטיח התקנה טכנית מתאימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שיפוע לגלאי UV ולנקב את החלק התחתון של הצינור עם מדקר הצינור. התחל את השאיבה של סוכרוז 60%, שתחליף את השיפוע עם דגימות משקעים כלפי מעלה דרך גלאי UV ולתוך מתקן הטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספיגה ב 260 ננומטר מתועד על מנת ליצור את פרופיל הקליטה לדוגמה, עם פסגות מציינות sedimentation של mRNAs הקשורים ליחידות משנת ריבוזומלי, monosomes, ולאחר מכן מספר גדל והולך של הריבוזומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות ל20 שברים באמצעות מתקן הטיפה (600 μl כל אחד, ב2 צינורות מיליליטר). </li></ol> 5. בידוד RNA מן הברים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת SDS 10% לריכוז סופי של 1% לשברים פרט ומערבבים היטב על מנת להתפתח חלבונים ולנתק הריבוזומים. בשלב זה ניתן להקפיא דגימות ב -80 ° C. בהתאם לשאלה יש לטפל, ניתן ונקווה שברים בהתאם לפרופיל הספיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA עם מיצוי פנול / כלורופורם חומצי, אשר גם מסיר עקבות זיהום של ה-DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח אחד של פנול / כלורופורם חומצי (prewarmed לRT) לכל דגימה, חום 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס ולחץ שחרורו מתחת למכסת מנוע קטר לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות עבור 20 דקות ב 17,000 XG ב RT. בזהירות העברת שלב מימית ל1.5 מיליליטר חדשצינור. להיות מודע להיפוך שלב בשברי סוכרוז צפופים, שבו השלב המימית עשוי להיות בתחתית לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח אחד של isopropanol, 1/9 אצטט נפח נתרן (pH 5.2) וGlycoblue μl 1 לכל דגימה על מנת לזרז RNA. שמור דגימות שעה לפחות 1 ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 17,000 XG ו4 ° C. Glycoblue מספק הדמיה של גלולה. הסר supernatant, לשטוף גלולה פעם אחת עם קרח קר אתנול 80% וגלולים אוויר יבש. ממיסים גלולה במי RNase ללא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת כמות הרנ&quot;א על ​​ידי Nanodrop ולנתח שלמות RNA על ידי שבב Bioanalyzer. RNA אשר מתקבל על ידי הפרוטוקול שהוצג מתאים לכל המצב של מבחני תפוקה גבוהה אמנות כולל microarray ורצף עמוק. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li>
<li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li>
<li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li>
<li>Brittis, P. a, Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li>
<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a, Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. -J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li>
<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li>
<li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Schlaeger, T. 1, (2011).</li>
<li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes%3A+postnatal+development+and+experimental+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T., et al. Isolation of myelin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3, (2007).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li>
<li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

למרות polyribosome חלוקה היא לא טכניקה חדשנית, הוא נשאר אחד מאתגר במיוחד. בהתבסס על חומר ההזנה, אופטימיזציה משמעותית יכולה להיות נחוצה. הדבר נכון במיוחד במקרה של in vivo דגימות של מערכת העצבים המרכזית, שבו כמות החומר היא לעתים קרובות הגבלה ושומן מרכיבי רקמה לעכב בידוד של mRNAs תרגום. פרוטוקולים שפורסמו חלוקה ביותר להתמודד עם שמרים או שורות תאי יונקים, ויש פרוטוקולים שהוקמו למוח 12,13,14. לעומת זאת, בקושי יש פרסומים המתארים חלוקה של מיתרי השדרה, ופרוטוקולים קודמים דורשים חוט השדרה ממספר רב של בעלי חיים שאספו 15. מסיבות אלה, כמה שינויים מהותיים שנעשו על מנת להתאים את פרוטוקול חלוקה לרקמות מערכת העצבים המרכזית, כוללים חוט השדרה עכבר אחת. חוסר תנועת הריבוזום עם cycloheximide מבוצעת במהלך זלוף בעלי החיים, כדי למנוע ניתוק של הריבוזומים דוריןg התהליך הארוך של מיצוי רקמה. בהמשך לכך, RNAs polysomal המחולצים באופן ספציפי על מנת למקסם את תשואת polyribosome. ראשית, בשליטת המגון של הרקמה על ידי douncing, שומר על הגרעין שלם ומונע זיהום ה-DNA. הגרעין לאחר מכן הוסר באופן מהימן על ידי צנטריפוגה. השילוב של חומרי הניקוי NP-40 וdeoxycholate נתרן מבטיח תמוגה של reticulum ושחרורו של הריבוזומים הקרום הקשורים אליו endoplasmic. בנוסף, רכיבים סופג UV בתוך המיאלין העשיר השומנים לטשטש את פרופילי polyribosome. הנפקת המיאלין לכן יש צורך, שבו תרכובות צפופות כגון polyribosomes הם pelleted ותרכובות קלות כמו לצוף המיאלין ויוסרו 16. אז Polyribosomes הם משקעים על שיפוע סוכרוז 17.5% 50%. במקום ידני שכבות והקפאה כל שכבת סוכרוז, יכול גם להיות מוכן הדרגתיים בעזרת מערבל שיפוע. מיצוי של RNA משברים באמצעות פנול / כלורופורם חומציים מאפשר DNA שיש להסירו עם אובדן RNA מינימאלי. עם זאת, היפוך שלב עלול להתרחש בברים צפופים סוכרוז (מעל שבריר 16). פרוטוקול זה מספק יתרונות על פני שיטות קונבנציונליות אחרות המטפלים ברמת התרגום. לדוגמא, שתי המדידה של S6 פוספורילציה (סמן תרגום בולט), כמו גם התיוג של רשתות המתהוות עם רדיואיזוטופים לתת מידע על רמות התרגום העולמיים אבל מגלה מעט על מה שדווקא הוא להיות מתורגם. Polyribosome חלוקה, ומצד שני, מאפשרת לא רק הערכה של תרגום העולמי, אלא גם בזהות של mRNAs תרגום והחלבונים רגולטוריים בנושא. יכול להתבצע בזמן אמת PCR כמו בRNAs המבודד לקריאה מהירה מmRNAs שנבחר, וmicroarrays ורצף RNA דור הבא ניתן לבצע ללימודים רחבים הגנום. אופטימיזציות שהוצגו כאן מאפשרות את הטכניקה לשימוש עם כמויות מינימליות של רקמות במערכת העצבים המרכזית, ולכן תקטנהing את מספר בעלי החיים הדרושים ושיפור איכות ניסיונית הכוללת על ידי הקטנת זמן עיבוד רקמה. מצד השני, טכניקה זו לא יכולה להבדיל בין הריבוזומים נתקע מאלו תרגום. תעתיקי ביצוע הריבוזומים נתקע יהיו משקעים שבברים הכבדים, ואת זה צריך לזכור כאשר לפרש את הנתונים. קיימות טכניקות האחרונות שדווחו, כלומר RiboTaq ומלכודת, שבו הריבוזומים מסומנים עם תגי epitope או כתבי בהתאמה באופן ספציפי לסוג תא וקשור mRNAs מבודד על ידי immunoprecipitation 17,18. טכניקה זו יכולה להיות יחד כדי polyribosome חלוקה להציע ברזולוציה גבוהה הקריאו לאוכלוסיות תאים ספציפיות. רגל הדפסת ריבוזום היא טכניקה נוספת שרומן כרוך עיכול nuclease ליצור שברים קטנים, או &quot;עקבות&quot;, של mRNAs שמוגנים על ידי הריבוזומים. לאחר מכן ספריות נוצרות מהעקבות הללו ורצף. prov שיטה זואידו ניתוח הגנום כולו קודון הספציפי על תרגום, והוא מסוגל לזהות הריבוזומים נתקע, לא באוגוסט להתחיל קודונים ומסגרות קטנות במעלה הזרם פתוחות קריאה, שלא יכולים להיות מושגת על ידי חלוקה polyribosome 19. עם זאת, polyribosome חלוקה יכולה להיות מצמידים את פרופיל הריבוזום לבידוד של שברים מתעכלים המכילים ריבוזומים בודדים, ובכך מעשירה למינים המולקולריים הנחוצים להכנת ספרייה שבה הוא נדרש לעתים קרובות טוהר גבוה מדגם. יחדיו, חלוקה polyribosome היא שיטה גמישה עם משמעות ארוכת טווח ויכולה להיות מצמידים את יישומים במורד הזרם שונים, כולל מבחני רחבים הגנום כמו הדור הבא של רצף.

ביטוי גנים נקבע על ידי הפעולה המשולבת של שעתוק, תרגום ויציבות של mRNA וחלבונים, עם תרגום הנושא את ההשפעה הדומיננטית ביותר 1. עכשיו זה ברור שכל אחד מהשלבים הבאים הוא פיקוח הדוק. מיקרו-RNAs, היווצרות של גרגרי RNA, אלטרנטיבי וpolyadenylation cytoplasmic כמה דוגמאות לרגולציה שלאחר תעתיק של ביטוי גני 2,3. כל אחד ממנגנונים אלה uncouples תעתיק מתרגום ומשפיע proteome במערכת הביולוגית של עניין. לכן, באופן לא מפתיע, רמות ה-mRNA לבד readout מושלם של רמות חלבון 4. פרוטאומיקה כמותיים מספקת הערכה הישירה ביותר של ביטוי גנים, עם זאת, למרות ההתקדמות, עדיין יש מגבלות רבות על רגישות ורזולוציה רצף חלבון. לכן פונה translatome, הרפרטואר של mRNAs תרגום, מציע פשרה מצוינת בין לומדtranscriptome וproteome. זה יותר מדויק מאשר transcriptomics בהערכת ביטוי גנים סופי, ומספק גם כיסוי גבוה יותר ורזולוציה רצף מ פרוטאומיקה. במערכות של יונקים, הרוב המכריע של אירועי תרגום יתחיל באמצעות ייזום כובע תלוי. קבוצה של גורמי חניכה אוקריוטים יחד עם מקטע ריבוזומלי הקטן 40S להרכיב בכובע &#39;5 של ה-mRNA. המורכב ואז סורק את ה-mRNA ועם הגיע לתחילת קודון לאוגוסט, מגייס למקטע ריבוזומלי 60S הגדול כדי ליצור 80S מלא הריבוזום. תמורת שלב התארכות עם הריבוזום נע לאורך ה-mRNA, עם גורמי התארכות סיוע לשילוב של חומצות אמינו מtRNAs הטעון לשרשרת פפטיד המתהווה. הריבוזומים מרובים יכולים להמשיך לאורך mRNA אחד בו זמנית ובמספר הריבוזומים הקשורים הוכח לתאם עם השיעור של סינתזת חלבון 5,6. זה עושה את טעינת ריבוזומלי אינדיקציה אמינה לטראןslation ומאפשר הפרדה פעילה תרגום mRNAs המבוסס על קצב שקיעה. בנוסף לכימות של תרגום mRNAs, ניתן לקבל מידע רצף לזהות מוטיבים מעורבים בויסות תרגום. גם RNA מחייבים חלבונים ויכולים להיות מבודדים משברים שונים גורמי תרגום אחרים, להקל על המחקר וגילוי של חלבונים רגולטוריים בנושא. במערכת העצבים, בקרת translational נקשרה לתהליכים כגון אחסון ה-mRNA, תחבורה וסינתזת חלבון מקומית. קונוסים צמיחה הוכחו נמל בריכה מקומית ספציפית של mRNAs שונה משאר האקסון 7. בנוסף, האקסונים להחזיק את היכולת לסנתז באופן מקומי חלבוני 8,9. כתוצאה מכך, שליטה מקומית של תרגום הפכה לנושא חיוני של מחקר בנוירוביולוגיה. הפוטנציאל של חלוקה polyribosome כדי לטפל בזה כבר הודגם במספר מחקרים, שבו הטכניקה שימשהלחקור האקסון הדרכה בפיתוח חוט השדרה, והפגין את תרגום הפעילות תלויה של BDNF ב10,11 המוח.

<table><tbody><tr><td>האנק' s תמיסת מלחים מאוזנת</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>צינור, קיר דק, פוליאלומר, 14 מ"ל, 14 x 95 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>דיאתילפירוקרבונט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>D5758</td><td>זהירות</td></tr><tr><td>ציקלוהקסמיד</td><td>סיגמא</td><td>C7698</td><td>סכנה</td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>סיגמא</td><td>43815</td><td>אזהרה</td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז מלא</td><td>רוש</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פלואוריד פנילמתאן סולפוניל</td><td>סיגמא</td><td>93482</td><td>סכנה</td></tr><tr><td>RNasin Plus מעכב RNase</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>סכנה</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>אזהרה</td></tr><tr><td>חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)</td> <td>אמביון</td><td>AM9722</td><td>סכנה</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להדהיב רקמות מטחנה, 1 מ"ל/7 מ"ל</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor, דלי מתנדנד, טיטניום, 6 x 14 מ"ל, 40,000 סל"ד, 285,000 x&nbsp; g</td><td>בקמן קולטר</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>מפקח שיפוע צפיפות</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בחקירתו vivo של translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי polyribosome היפוך חלוק

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

תהליכים רבים מעורבים בביטוי גנים, כולל שעתוק, תרגום ויציבות של mRNAs וחלבונים. כל אחד מהצעדים הללו בחוזקה מוסדרת, המשפיע על הדינמיקה הסופית של שפע חלבון. מנגנוני פיקוח שונים קיימים בשלב התרגום, עיבוד רמות ה-mRNA לבד אינדיקטור אמין של ביטוי גנים. בנוסף, רגולציה מקומית של תרגום mRNA הייתה מעורבת בעיקר בפונקציות עצביות, הסטה &#39;translatomics&#39; למוקד תשומת הלב בנוירוביולוגיה. השיטה שהוצגה יכולה לשמש כדי transcriptomics הגשר ופרוטאומיקה. כאן אנו מתארים שינויים חיוניים לטכניקה של חלוקה polyribosome, שחוקרת את translatome המבוסס על הקשר של mRNAs תורגם באופן פעיל לריבוזומים רבים וההשקעה שלהם בהפרש הדרגתיים סוכרוז. באופן מסורתי, עבודה עם in vivo דוגמאות, במיוחד של CENTRAמערכת העצבים l (CNS), הוכיחה מאתגרת בשל הכמויות מוגבלות של חומר ואת נוכחותם של מרכיבי רקמת שומן. על מנת לטפל בזה, הפרוטוקול המתואר הוא מותאם במיוחד לשימוש עם כמות מינימאלית של חומר במערכת העצבים המרכזית, כפי שהודגמו על ידי השימוש בכבל יחיד עכבר השדרה ובמוח. בקצרה, רקמות מערכת העצבים המרכזית המחולצים והריבוזומים תרגום הם משותקים על mRNAs עם cycloheximide. הנפקת המיאלין מתבצעת לאחר מכן להסיר רכיבים עשירים שומנים בדם. חלוקה מתבצעת על שיפוע סוכרוז בי mRNAs מופרדים על פי טעינת ריבוזומלי שלהם. שברים מבודדים מתאימים למגוון רחב של מבחני במורד הזרם, כוללים טכנולוגיות assay הגנום רחב חדשות.

איור 2 מראה פרופילי polyribosome נציג לאחר חלוקה. הפרופילים של מוח וחוט השדרה להראות עקומות קליטה אופייניות כפי שתוארו קודמים לשורות תאים. mRNAs חייב יחידות משנה קטנות ריבוזומלי משקעים בשברים קלים יותר (40S) ומופיע לראשונה כשיא על הפרופיל, ואחריו למקטע הגדול ריבוזומלי (60S) וmonosome (80S) mRNAs כבולות. mRNAs חייב הריבוזומים מרובים משקעים שבברים כבדים יותר, עם הפסגות בהמשך מצביעים על מספר גדל והולך של הריבוזומים מאוגדים. תרגום עולמי ניתן להעריך מהפרופיל. כדוגמא, יש רקמת מוח polyribosome גבוהה יותר לmonosome יחס מאשר רקמה בחוט השדרה, מה שמעיד תרגום פעיל יותר. RNA חילוץ משברים בודדים נבדקו על ידי Bioanalyzer, מראה הפצה של 18S ו28S rRNA. 18S rRNA מופיע מוקדם יותר בפרופיל, בהתאם ליחידות המשנה הקטנה ריבוזומלי סדימנטציה בsucr הקל<html> שברים OSE. תשואות אופייניות של רנ&quot;א הכל הן 10-20 מיקרוגרם למוח ו2-4 מיקרוגרם לחוט השדרה. תשואות RNA משברים בודדים הן עד 4 מיקרוגרם ו0.8 מיקרוגרם למוח וחוט השדרה, בהתאמה, בהתאם לחלק הקטן. שיפוע סוכרוז ריק כבר מראה כמה קליטת רקע ב 260 ננומטר, בשל נוכחותם של DTT. על רקע זה יכול להיות מופחת במהלך ניתוח הנתונים על מנת לנרמל את ערכי מדגם. טיפול EDTA קרס פסגות polyribosome, הוכחת פרופיל שקיעה נובע מתרגום. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. זרימת עבודה ויישומים אפשריים של in vivo חלוקה polyribosome.&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> פרופילי איור 2. () פרופילים אופייניים polyribosome של מוח וחוט השדרה, עם הערכה של RNA שחולץ על ידי Bioanalyzer. הפצה של GAPDH mRNA על שברים ידי qRT-PCR (ב &#39;). (C) Polyribosome של שיפוע ריק ומוח עם ובלי טיפול EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> חיץ שיפוע 2x </td><td> 30 מ&quot;מ טריס-HCl pH7.4, 30 מ&quot;מ MgCl 2, 600 mM NaCl, 200 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide (CHX), 2 המ&quot;מ dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 17.5% </td><td> 8.67 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 25.6% </td><td> 12.8 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 33.8% </td><td> 16.9 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 41.9% </td><td> 20.95 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 50% </td><td> 25 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> המגוןחיץ </td><td> 0.25 M סוכרוז, 50 מ&quot;מ טריס / HCl, pH7.4), 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ&quot;מ (PMSF), 100 U / ml RNasin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 2M </td><td> סוכרוז 68.4%, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 100 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, PMSF 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 1.1M </td><td> סוכרוז 38.5%, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 100 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, PMSF 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 0.9M </td><td> סוכרוז 30.8%, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 100 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, PMSF 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> שעותomogenization חיץ B </td><td> 0.25 M סוכרוז, 50 מ&quot;מ טריס / HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25mm KCl, 1% NP-40, deoxycholate נתרן 1% </td><td> 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1mm DTT, 1 מ&quot;מ PMSF, 100 U / ml RNasin </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רשימה של מאגרים ופתרונות.

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ&quot;א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות mRNA במצב תרגום ברקמת מערכת עצבים מרכזית (CNS) ראשונית. הפרוטוקול מתחיל בהוצאת הרקמות הרלוונטיות מעכבר בסיקלוהקסימיד. לאחר מכן מתבצעים הומוגנזציה מכנית וליזיס בדטרגנט.בשלב הבא מבוצע ציפה של מיאלין, התהליך מסיר את רכיבי השומן מהרקמות אשר עלולים להסוות את פרופילי הפוליריבוזומים. המשקע, המכיל ריבוזומים ו-mRNAs קשורים, שוקע על מדרג סוכרוז כדי להפריד את ה-mRNA הקשור לריבוזומים. לאחר מכן המדרג מחולק לפרקציות כדי לספק פרופיל פוליריבוזומים, כאשר כל שיא מייצג mRNAs הקשורים למספר מסוים של ריבוזומים או תתי-יחידות ריבוזומליות.שברים המכילים פולי-ריבוזומים מטוהרים לאחר מכן כדי להפיק RNA ליישומים המשכיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מאפשרת עבודה עם כמויות קטנות של רקמת CNS והיא ורסטילית ביישומיה המשכיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בחקר התרגום במערכת העצבים, כגון שינויים ברמות התרגום בתנאים שונים, ותפקידם של התרגום, גורמים רגולטוריים ומוטיבים של רצפים.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו ייתקלו בקשיים מכיוון שחומרים ממערכת העצבים המרכזית (CNS) in vivo הם בדרך כלל מוגבלים, ורכיבים אטיים הנוכחים ברקמה עלולים להסוות את פרופילי הפוליריבוסום. עבור עכבר שעבר פרפוזיה טרנס-קורדיאלית עם HBSS הכולל cycloheximide, יש להתחיל מיד בחילוץ הרקמה. פתחו את הגולגולת בצורה גבית והוציאו את המוח. העבירו את המוח לבאפר A קר מאוד וקצצו באופן מיידי את רקמת המוח.בשלב הבא, בצעו למינקטומיה של עמוד השדרה החזי והמותני. הסירו ארבעה סנטימטרים של חוט השדרה והעבירו אותם לתוך buffer A קר מאוד על קרח. קצצו את הרקמות הנפרדות כדי להגביר את ספיגת ה-cyclo heide, ולאחר מכן גרעו על קרח למשך 15 דקות.בשלב הבא, יש להומגנ את הרקמות באמצעות הומגנייזר כדי להבטיח שהגרעינים יישארו שלמים. רקמת מוח דורשת חמישה תנועות דחיסה בעזרת פסטל צמוד, לאחר מכן העבירו את הרקמה מהרשת למבחנות. רקמת חוט השדרה דורשת חמישה תנועות דחיסה בעזרת פסטל רפוי, ולאחר מכן חמישה תנועות נוספות בעזרת פסטל צמוד.כעת אספו מנות עבור בידוד RNA כולל, 200 µL של חוט השדרה ו-400 µL של רקמת מוח קפואה. הקפיאו אותן ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- °C. כדי להסיר את הגרעינים, תאי-חומרים וחלקי רקמה שלא התפרקו, סבבו את הרקמות בצנטריפוגה במהירות של 500 Gs למשך 10 דקות.אספו את תסמיכי העל המכילים את הרשת האנדופלזמית עם הריבוזומים הקשורים אליה, והשליכו את המשקע המכיל את הגרעינים. לאחר מכן, פרקו את מקטעי ממברנת הרשת האנדופלזמית כדי לשחרר את הריבוזומים על ידי הוספת דטרגנטים NP 40 ו-sodium deoxy coate, כל אחד עד לריכוז סופי של 1%. הניחו לדגימות להדגיר במשך 30 דקות על קרח. אחד האתגרים בעבודה עם רקמות של מערכת העצבים הוא שמיאלין ומרכיבים עשירים אחרים בליפידים מופיעים בפרופילי Master Polysome.כדי להתמודד עם בעיה זו, יש להטמיע את תהליך מידול הצפיפות (flotation) להסרת רכיבים אלו לפני התחלת העבודה. קררו מראש את דליי האולטרסנטריפוגה ואת הרוטור לטמפרטורה של 4 °C. כעת, ערבבו את הליזאטים שנאספו עם 1.22 נפחים של סוכרוז בריכוז 2 M.העבירו כל תערובת לפ vibrancy של פרוקסילן לאולטרacentrifuge ומלאו את המבחנות עד לנפח של 10 milliliters באמצעות sucrose בריכוז 1.1 molar. לאחר מכן, הניחו בזהירות שכבה עליונה של sucrose בריכוז 0.9 molar. כעת העבירו את המבחנות לדליים המקוררים ואזנו אותם באמצעות buffer B. טענו את הדליים המאוזנים לתוך הרוטור המקורר והפעילו את הצנטריפוגה במהירות של 100, 000 Gs. במשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius, הריבוזומים וה-RNAs ישקעו למשקע מתחת לשומנים התלויים.לאחר סבב הצפת המיאלין, הסיר את העל-נוזל (supra natin) והמס את המשקעים המכילים ריבוזומים בבופר B. לאחר מכן, מדוד את הבליעה של תמיסות הריבוזומים באורכי גל של 260 nanometers באמצעות מכשיר NanoDrop. העरक את ריכוזי ה-RNA הכוללים על סמך ערכים אלה. כעת העבר את הדגימות למעלי sucrose prepared.Gradients שהוכנו.הקפידו לא להפריע למדרגי הריכוזים והוסיפו מדרג ריכוזים ריק כביקורת. איזנו את הדליים המקוררים עם הדגימות כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, הפעילו את הצנטריפוגה ב-285,000 Gs למשך שעה וחצי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בזמן שהצנטריפוגה מסתובבת, הכינו את הפרקציונטור. ראשית, הגדירו את רגישות נורת ה-UV. לאחר מכן, חברו את מחורר המבחנות לפרקציונטור וחברו אותו באמצעות צינור לבקבוק המכיל 60% sucrose.בעזרת משאבת גלגלת ביניים, התחילו לשאוב את הסוכרוז אל תוך הפרקציונטור בקצב של מיליליטר אחד לדקה. בדקו אם קיימות דליפות אוויר הגורמות להיווצרות בועות והדקו את האטמים הללו. לאחר מכן, שאובו ידנית בופר גרדיאנט אל גלאי ה-UV כדי לקבוע את קו הבסיס.לאחר פריקה זהירה של הדגימות מהאולטרה-צנטריפוגה ללא זעזועים, טענו דגימה אחת לתוך המפריד (fractionator), ולאחר מכן נקבו את תחתית המבחנה באמצעות המחורר. התחילו בשאיבה של 60% sucrose כדי לדחוק את הגרדיאנט מעבר לגלאי ה-UV ואל תוך מפזר הטיפות. רשמו את פרופיל הבליעה ב-260 nanometers.אספו 20 פרקציות מהמפיק (drop dispenser) למבחנות בנפח שני מיליליטר. אספו 600 µL לכל פרקציה והמשיכו בעיבוד מדרגי הדגימה לכל פרקציה ב-10% SDS עד לריכוז סופי של 1% SDS, וערבבו היטב. כעת בודדו את ה-RNA באמצעות חילוץ חומצי של פניל כלורפורם.התחילו בהוספה של נפח אחד של פניל כלורפורם חומצי בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חממו את המבחנות ל-65 °C למשך 10 דקות. פתחו בזהירות את הבקבוקונים במכסה עשן לאחר החימום כדי לשחרר את הלחץ. לאחר מכן, סנטריגו את הפראקציות ב-17,000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ואספו את הפאזה המימית, שעשויה להימצא מעל או מתחת לסוכרוז.בשלב הבא, הוסיפו נפח אחד של איזופרופנול, תשעית נפח של נתרן אצטט ומיקרוליטר אחד של glyco blue. השקיעו את ה-RNA למשך שעה אחת לפחות ב-80°-, ולאחר מכן רספו אותו על ידי סנטריפוגציה. לאחר מכן, שטפו את המשקעים פעם אחת באתנול 80% מקורר, ולאחר רסופת ה-RNA שוב, ייבשו את המשקעים באוויר, המיסו אותם מחדש במים והמשיכו בניתוחים המשכיים.לחלופין, ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80- מעלות עד למועד השימוש. גרדיאנט סוכרוז ריק מראה בליעה רקעית ב-260 ננומטר בשל נוכחות של DTT. ניתן להפחית רקע זה במהלך ניתוח הנתונים כדי לנרמל את ערכי הדגימה; פרופילי ה-RNA של המוח ושל חוט השדרה מראים עקומות בליעה אופייניות, כאשר mRNAs הקשורים לתתי-יחידות ריבוזומליות קטנות שוקעים בפרקציות קלות יותר המופיעות מוקדם בפרופיל.בעקבותיהם מגיעה תת-היחידה הריבוסומלית הגדולה, ו-mRNAs קשורי מונו; mRNAs הקשורים למספר ריבוזומים שוקעים בפרקציות מאוחרות יותר. טיפול של הדגימות ב-EDTA גרם לקריסת שיאי הפולי-ריבוזומים, מה שמוכיח שפרופיל השקיעה נבע מתרגום. ניתן לשלב בטכניקה זו שיטות נוספות, כגון Ribot attack ו-trap, על מנת לבצע מחקרים של תרגום הספציפיים לסוג תא מסוים.לאחר פיתוח זה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לבחון את תפקידה של ויסות התרגום בהתפתחות נוירונים ובמחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע הפרקציונציה של פוליסומים מכמויות קטנות של רקמת CNS וטיהור RNA ליישומים המשכיים לבחירתכם.

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

טכניקה לזהות אתרים על הפסקה של תרגום ה-mRNA מתואר. הליך זה מבוסס על בידוד של פוליפפטידים המתהווה המצטברים על הריבוזומים במהלך בתרגום חוץ גופית של mRNA המטרה, ואחריו ניתוח בגודל של רשתות המתהווה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

למדו לבודד RNA מקושר לריבוזומים מרקמות מערכת העצבים המרכזית בעכברים באמצעות שיטת היפוך חלוקת פוליריבוזומים. שיטה זו מאפשרת ניתוח תרגום mRNA בתנאי in vivo.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

גלה סרטונים נוספים