הוכחת סמים רבים עמידים חפת Mycobacterium Microarray ההגברה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא גנוטיפ מיקרובקטריום שחפת עמיד לתרופות מרובות, באמצעות מיקרו-מערך הגברה. זה מושג על ידי ביצוע PCR אסימטרי מרובה על גבי מיקרו-מערך בתוך תא תגובה מיקרופלואידית יחיד. שם הדגימה מוגברת בו זמנית, נבחרת גודל מסומן, הופכת לחד-גדילית והכלאה למיקרו-מערך.

לאחר מכן, לאחר שטיפת המיקרו-מערך, הקורא מראה אם קיים מיקרובקטריום טוברקולוזיס, ואם הוא מכיל מוטציית DNA הידועה כמעניקה עמידות לריפמפין איזו, ניאזי אתאמבוטול או סטרפטומיצין. היתרון של שיטה זו על פני שיטות קיימות של בדיקת קו מיקרו-מערך או הכלאה של חומצות גרעין הוא שמיקרו-מערך הגברה מפשט משמעותית את אינטראקציית המשתמש עם הבדיקה. ובכל זאת, תוך מתן הרגישות האנליטית של PCR ויכולת הריבוב של מיקרו-מערך להליך זה, יש לנגב סביבת עבודה נקייה בתמיסה מטהרת ויש חומצות גרעין טהורות מספיק עבור Multiplex PCR.

לאחר הפשרה וערבוב של כל פתרונות המלאי, הרכיבו את תערובת המאסטר PCR. בעת הכנת תערובת זו, הכינו לפחות נפח אחד נוסף של תערובת לבדיקת השחפת המוצגת כאן. כמו כן, הוסף עוד T פולימראז לתערובת המאסטר.

בנוסף לכמות ההדבקה המסופקת עם תערובת הריאגנטים במלאי, מיניקוטס מיקרוליטר אחד של דגימת DNA ל-49 מיקרוליטר של תערובת מאסטר. הוסף בזהירות 48 מיקרוליטר מכל תערובת תגובה למרכז המיקרו-מערך המתאים. אל תיגע במיקרו-מערך עצמו.

לאחר מכן יש לכסות ולאטום בזהירות את המיקרו-מערך בצורה לא נכונה. מריחת תלוש הכיסוי עלולה להכניס בועות שעלולות להוביל לחפצים, אידוי, הגברה לקויה או הכלאה לא אחידה. כל אחד מהמצבים הללו יכול להוביל לתוצאה שגויה.

לאחר מכן, טען את קצב המיקרו לתוך המחזור התרמי. כשהמצעים כנגד גוש החום, אפשרות המכסה המחומם חייבת להיות כבויה. עבור מעבדות העוקבות אחר אמצעי זהירות PCR אוניברסליים, יעיל יותר לכלול מספר מיקרו-מערכי הגברה לכל שקופית ולעבד מספר בדיקות בו זמנית.

כעת, הפעל את תוכנית הרכיבה התרמית המתאימה. לתוכנית זו יש 50 מחזורי הגברה, שאולי נראים גבוהים אך נחוצים בגלל אוכלוסיית האמפליקונים החד-גדיליים שנוצרה על ידי התגובה. לאחר השלמת התגובה, הסר את המיקרו-מערכים וכבה את המחזור התרמי.

פתח בזהירות את תא המיקרו-מערך עם שטוח ומלקחיים. הסר את ההחלקה, הכיסוי והאטם. המיקרו-מערך עלול להינזק בשלב זה, לכן היזהר בצורה לא נכונה.

הסרת מכלול האטם עלולה להוביל לנזק פיזי של המיקרו-מערך. היזהר לא לכופף או לכופף את החלקת הכיסוי והקפיד מאוד להימנע משריטות פני המיקרו-מערך עם המלקחיים, כעת העבר את מצעי המיקרו-מערך למחזיק שקופיות היסטולוגי. רחצו את המצעים במאגר הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה, עקבו אחר אמבט תמיסת הכביסה עם שתיים או שלוש כביסות נוספות, הכל במים נטולי יונים.

יבש את המיקרו-מערכים לפני שתמשיך להדמיה. ניתן להשתמש בזרם עדין של אוויר דחוס למטרה זו בהדגמה זו, הפרמטרים הם ספציפיים לבדיקת MDR TB ומצלמת שדה ניידת Econ DX 2100. נורה כחולה על המצלמת מציינת שהיא מוכנה.

הפעל את המחשב. פתח את תוכנת המערכת שסופקה על ידי conni והמתן עד שהתוכנה תודיע שהיא יצרה חיבור עם המצלמה. לאחר מכן, הכנס את המיקרו-מערך המיובש לתוך ההדמיה.

עם המיקרו-מערך לכיוון העדשה והרחק מהמשתמש. התוכנה תספק כעת תמונת תצוגה מקדימה מהתפריט הנפתח. בחר את קובץ ה- Script לניתוח MDR TB.

הזן זמן חשיפה בין 100 ל-500 אלפיות השנייה. פיקסלים עם חשיפת יתר ייקראו. כוונן את החשיפה כדי למזער אותן.

כאשר הרוויה מוגדרת למזער חשיפת יתר, התחל את הניתוח. התוכנה מציבה רשת MDRT TB על ציוני התמונה, הדגימות ועוצמות הרקע, ולאחר מכן מדווחת על עמידות לתרופות ותוצאות גנוטיפ. לאחר השלמת הניתוח ושמירתו, הסר את השבב מההדמיה והתחל סשן ניתוח חדש כדי לנתח את המערך הבא.

המשך בניתוח עבור כל אחד מהמיקרו-מערכים המעובדים. שמירת הנתונים בכל פעם. ניתוח תמונה איכותי יכול לספק תובנה לגבי מקורות של רעש ניסיוני או שונות שמאתגר לזהות בטבלאות נתונים שנוצרו על ידי תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית.

ניתן לראות כאן מערך איכותי וחסר חפצים. מספר חפצים יכולים להוביל להכנסת בועות היוצרות הילות. למרות חפצי המערך, התוכנה עדיין תאחזר ערכים מסריקה.

אלגוריתם דיווח אבחון, למרות קבלת ערכים, יזהה מערך זה כלא חוקי. נעשה שימוש בסדרת דילול של DNA גנומי מסוג H 37 RA בתבנית PCR מיקרו-מערך ב-6.25 פיקוגרמים, שווה ערך ל-1,250 תאים. כל הבדיקות זוהו.

ערך SNR מעל שלוש הוא תוצאה חיובית, והערכים הרשומים היו גבוהים בהרבה. לאחר מכן, מבודדי הייחוס של ארגון הבריאות העולמי עברו גנוטיפ. פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים הקיימים במערך זוהו כמוטציה המקבילה בגנום השחפת MDR.

כמו כן ניכרו מספר דוגמאות לאיתור מוטציות של שכנים קרובים. דיון מסופק בפרוטוקול הטקסט. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש וחצי עד שש וחצי שעות, תלוי בריכוז ה- DNA, הבדיקה הספציפית, היעילות והאחידות של המחזור התרמי והרגישות והספציפיות האנליטית או הקלינית הרצויה.

כמו כן, ניתן לקצר או להאריך בקלות את מספר מחזורי ההגברה וזמני ההכלאה לאחר ההגברה כדי לקבל את מאפייני הביצועים הרצויים.