הערכה של סובלנות hyperalgesia ומשככי כאבים הנגרם מורפיום בעכברים באמצעות שיטות nociceptive תרמיים ומכאניות
29 ביולי 2014
אנו מתארים פרוטוקול לבחון את התפתחותם של hyperalgesia מושרה אופיואידים וסובלנות בעכברים. המבוסס על המדידה של תגובות nociceptive תרמיים ומכאניות של בעלי חיים תמימים וטופל במורפיום, היא מאפשרת לכמת את העלייה ברגישות לכאב (hyperalgesia) ולהפחית בכאבים (סובלנות) הקשורים לממשל אופיום כרוני.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את התפתחותן של היפראלגזיה מושרית-אופיואידים וסבילות לאנלגזיה בעכברים. דבר זה מושג על ידי מדידת התגובות הנוציצפטיביות התרמיות והמכניות של עכברים נאיביים לאחר מתן מורפין לאורך סדרת זמנים ביום אפס כשלב שני. סף הנוציצפציה נמדד מדי יום לפני מתן המורפין ביום השביעי.
ההשפעה המשככת של מורפין נמדדת שוב לאורך זמן כדי לחשוף את התפתחות הסבילות למשככי כאבים. התוצאות המתקבלות מראות עלייה ברגישות לכאב וכן התפתחות של סבילות למשככי כאבים בעקבות מתן חוזר של מורפין.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התפתחות רגישות יתר לכאב וסבילות למשככי כאבים בעכברים, ניתן להחילה אותה לאחר טיפול אופיאטי כרוני גם על אופיאטים אחרים או על עכברים שעברו שינוי גנטי. את הפרוצדורה תדגים סטודנטית לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי למזער אנלגזיה המושרית על ידי סטרס, העכברים מטופלים במשך חמש דקות בכל יום ומורגלים עד שהם נכנסים באופן חופשי למכשיר הריסון.
לאחר ההרגלה, התחילו את מבחן טבילת הזנב על ידי כיוון התרמוסטט ל-48 °C. הכניסו את העכבר בעדינות למכשיר הריסון. ברגע שהעכבר מרסן כראוי, טבלו את שני השלישים החיצוניים של הזנב הבולט לאמבט המים והפעילו את הכרונומטר.
ההבחנה בין גירוי נוציצפטי לבין תגובה נוציצפטית היא מרכיב מרכזי בהליך זה. בוררות נכונה ותרגול הם קריטיים להצלחה. עקבו אחר תנועת בעל החיים ועצרו את הכרונומטר.
ברגע שהעכבר מושך את זנבו מהמים החמים, רשמו את זמן השיהוי עד לנסיגה (withdrawal latency). החזירו את העכבר לכלובו ובחנו את החיה הבאה עד לסיום הסדרה תוך שמירה על אותו סדר. חזרו על מדידות התגובה הנוציצפטיבית פעמיים נוספות.
זמן התגובה הנוציצפטיבי בשניות עבור כל עכבר נקבע כערך הממוצע של שלוש מדידות רצופות. עבור מבחן הלחץ על הזנב, ראשית הכנס בעדינות את העכבר למכשיר הריסון ומקם את זנבו תחת הקצה הקוני של ה-anal JMeter. ברגע שהזנב במקומו, לחץ על מתג הרגל כדי להפעיל לחץ העולה באופן אחיד על החלק הפרוקסימלי של הזנב.
עם הסימן הראשון לתגובה נוציצפטיבית, יש להסיר את הקצה. תגובות נוציצפטיביות עשויות לכלול התנגדות, ציוץ או משיכה של הזנב. רשמו את הכוח הנוכחי בגרמים המעורר את התגובה הנוציצפטיבית.
חזור על מדידה זו בחלקים המרכזיים והמרוחקים של זנב אותה עכבר במרווחים של 32 שניות, החזר את בעל החיים לכלובו וחזור על שלבים אלו עד לבדיקת כל העכברים. ראשית, הגדר שתי קבוצות של בעלי חיים עם ערכי nociceptive ממוצעים דומים. לאחר מכן, מדוד ורשום את משקל הגוף של כל בעל חיים.
לאחר קביעת קבוצות הסליין והמורפין, הכין תמיסת מורפין בסליין פיזיולוגי להזרקה תת-עורית. מדוד את זמני התגובה (latencies) לנוציספציה הן במבחן טבילת הזנב והן במבחן לחץ הזנב, ורשום נתונים אלו כזמן 0.0 עבור כל קבוצה. לאחר מכן, הזרק מורפין או סליין לכל חיה בהתאם לקבוצתו.
לאחר 30 דקות, התחילו ברישום התגובות הנוציצפטיות בכל בעל חיים. שימו לב היטב לערכי ה-cutoff, שכן עכברים אינם צפויים להגיב לגירויים הנוקסיים בנקודת זמן מוקדמת זו. בהיעדר תגובה נוציצפטיות, ייעשה שימוש ב-cutoff של 25 שניות כדי למנוע נזק לרקמות, תוך שמירה על אותו סדר בדיקה.
חזור על מדידות הנוציצפציה (תגובת הכאב) מדי 30 דקות עד 3.5 שעות לאחר ההזרקה עבור טיפול במורפין כרוני. השג את ערכי היום הראשון על ידי מדידת התגובה הנוציצפטיבית של בעלי החיים ב-TIT וב-TPT כפי שהודגם קודם לכן. הכן תמיסת מורפין טרייה.
הזריקו מורפין או תמיסת מלח בהתאם להקצאה לקבוצות ואפשרו לבעלי החיים לנוח עד למחרת. למחרת, מדדו תגובות נוציצפטיביות ב-TIT וב-TPT לפני מתן סבב שני של הזרקות. חזרו על שלבים אלה מדי יום במשך שישה ימים.
ביום השביעי, העריכו את האנלגזיה המושרה על ידי מורפין. בהתאם למודל מהלך הזמן שהודגם קודם לכן במבחן טבילת הזנב, האפקט האנלגזי המקסימלי של מורפין הושג לאחר 30 דקות. עם זאת, במבחן לחץ הזנב, האפקט המקסימלי הושג לאחר 60 דקות בהשוואה לקבוצות ביקורת שהוזרק להן סלין.
תוצאות אלו מראות כי הזרקות יומיות של מורפין לאורך תקופת טיפול של שבעה ימים הובילו לירידה משמעותית ופרוגרסיבית בערכי הסף הנוציצפטיים הבזאליים התרמיים והמכניים. לאחר טיפול כרוני, ערך הסף הנוציצפטי הבזאלי בעכברים שטופלו במורפין היה נמוך באופן משמעותי מזה של עכברי ביקורת שהוזרק להם סליין. בעקבות מתן מורפין אקוטי, התגובה הנוציצפטית של הקבוצה שטופלה במורפין כרוני עלתה באופן משמעותי, אך עלתה רק במעט על ערך הסף הנוציצפטי הבזאלי של ביקורת הסליין.
עכברים שנמדדו לאחר 30 דקות ב-TIT וב-TPT ולאחר 60 דקות ב-TIT; כאן מוצגים בגרף ערכי סף nociceptive שנמדדו 30 דקות לאחר הזרקת סליין או מורפין עבור היום האפס והיום השביעי להתפתחות. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר הכאב לבחון את ההשפעה של התערבות פרמקולוגית או גנטית בהתפתחות של רגישות יתר לכאב וסבילות לאנלגזיה המושרה על ידי מתן מורפין כרוני.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לבחינת היפראלגזיה מושרית-אופיואידים וסבילות לאנלגזיה בעכברים. באמצעות מדידת תגובות נוציצפטיביות תרמיות ומכניות, הפרוטוקול מכמת שינויים ברגישות לכאב ובאנלגזיה בעקבות מתן מורפין כרוני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- פרמקולוגיה
- מדעי ההתנהגות
רקע
- היפראלגזיה מושרית אופיואידים היא תופעה שבה חולים חווים רגישות מוגברת לכאב בעקבות טיפול באופיואידים.
- סבילות לאנלגזיה מתרחשת כאשר יעילותם של האופיואידים פוחתת עם הזמן.
- הבנת מנגנונים אלו חיונית לשיפור אסטרטגיות לניהול כאב.
- מחקר זה משתמש במודל עכברים כדי לבחון השפעות אלו בסביבה מבוקרת.
מטרת המחקר
- לצפייה בהתפתחות של היפראלגזיה מושרית-אופיואידים בעכברים.
- למדידת הסבילות האנאלגזית הנובעת ממתן מורפין כרוני.
- לספק תובנות לגבי מנגנוני רגישות-יתר לכאב.
שיטות שהשתמשו בהן
- עכברים טופלו במורפין ותגובות הנוציצפציה שלהם נמדדו באמצעות מבחני טבילת זנב ולחץ זנב.
- מדידות נלקחו מדי יום לאורך תקופה של שבעה ימים כדי להעריך שינויים ברגישות לכאב.
- ספי התגובה התרמיים והמכניים הוערכו כדי לכמת היפראלגזיה וסבילות.
- התוצאות הושוו בין הקבוצה שטופלה במורפין לבין קבוצת ביקורת שקיבלה סליין.
תוצאות עיקריות
- טיפול כרוני במורפין הוביל לעלייה משמעותית ברגישות לכאב.
- נצפתה סבילות לאלגזיקה (משככי כאבים), עם ירידה ביעילות המורפין לאורך זמן.
- המדידות הצביעו על ירידה הדרגתית בספי הנוציצפטיביים בעכברים שטופלו במורפין.
- הממצאים תומכים בהשערה ששימוש כרוני באופיואידים מוביל להיפראלגזיה ולסבילות.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה מהימנה להערכת היפראלגזיה וסבילות המושרה על ידי אופיואידים בעכברים.
- התוצאות מדגישות את הצורך בניהול זהיר של טיפולים באופיואידים כדי למנוע עלייה ברגישות לכאב.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה למחקרים נוספים על אופיואידים אחרים או על מודיפיקציות גנטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
היפראלגזיה מושרית-אופיואידים וסבילות לאנלגזיה מהוות אתגרים קריטיים בפיתוח תרופות משככות כאבים, שכן הן פוגעות ביעילות ארוכת הטווח של טיפולים באופיואידים. פרוטוקול זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות שינויים נוציספטיביים תרמיים ומכניים in vivo, ובכך תומך בתיקוף מטרות ובביטחון חיזוי עבור מועמדים לתרופות אנלגזיות. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת משנים גנטיים ופרמקולוגיים של התגובה לאופיואידים, ובכך מסייעת במיון פורטפוליו ובזיהוי מועמדים מובילים (leads) במחקר כאב.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי מדידת שינויים דו-כיווניים בנוציצפציה תרמית ומכנית בעקבות חשיפה כרונית למורפין.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות כימות של פנוטיפים של היפראלגזיה וסבילות בעכברים מסוג בר (wild-type) ובעכברים שעברו מודיפיקציה גנטית.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון הניבוי על ידי ביסוס קשרים תלויי-מינון ותלויי-זמן בין חשיפה לאופיואידים לבין שינויים בסף הנוציצפטיבי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקה המשכית, באמצעות ביסוס פרופילים של תגובה נוציספטיבית בבסיס ובמצב של שינוי על ידי תרופה.
- תוצרים כמותיים: יצירת קריאות רציפות הניתנות לשחזור (זמן השהייה עד לנסיגה בשניות, כוח בגרמים), המאפשרות הערכה סטנדרטית של תרכובות בין מחקרים שונים.
- יכולת הרחבה (Scalability): תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה לבדיקת מועמדים לאנלגזיה, התערבויות גנטיות או טיפולים משולבים, במסגרת עקבית של מדידה נוציספטיבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה היפראלגזיה וסבילות המושרה על ידי אופיאטים, מגבלות מרכזיות בטיפול קליני באופיאטים, ומספקת התאמה של ביומרקרים תרגומיים לרגישות יתר לכאב.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשרת על שלב הגילוי באמצעות מעקב נוציצפטי אורך, המאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים על בסיס עמידות האנלגזיה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבודדת משתנים התורמים לסבילות אנלגזית לעומת היפראלגזיה, ובכך מסייעת בבחירת מטרה ובגישה לביומרקרים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי של תרופות משככות כאבים, החל מתיקוף מוקדם של מטרה, דרך אופטימיזציה של תרכובת מובילה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת הערכה איטרטיבית של פוטנציאל סיכון למשככי כאבים ושל המדד הטיפולי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי ויסות מסלולים נוציצפטיים והפחתת סיכונים ביולוגיים של מטרות אופיואידיות באמצעות פרופיל רגישות אורכי.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקה באמצעות מדידות נוציצפטיות תרמיות ומכניות כמותיות וסטנדרטיות, המתאימות להערכת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתוני מהלך זמן והשוואות בין קבוצות (מורפין לעומת סליין, חריף לעומת כרוני) המאפשרים הערכה סטטיסטית של התפתחות סבילות לאנלגזיה.
- מחקר תרגומי: מקשר לתוקף פרה-קליני על ידי מידול של פנוטיפים של היפראלגזיה וסבילות מושראים על ידי אופיואידים בעכברים, הרלוונטיים לקליניקה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לפנוטיפינג נוציצפטי לשימוש חוזר, הישימה על פני מחלקות של אופיואידים, מודלים גנטיים ומחקרי התערבות טיפולית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בהיפראלגזיה וסבילות המושרות על ידי אופיואידים, באמצעות מדידה נוציספטיבית ישירה ואורכית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות הרגלה, מדידה עיוורת וממוצע של זמני תגובה (latency) בשלוש חזרות על פני מודליות תרמיות ומכניות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי זיהוי מוקדם של סיכון אנאלגזי, ובכך מפחית כישלונות בשלבים מאוחרים עקב היפראלגזיה או סבילות בלתי צפויות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים לאנאלגזיה מותאם סיכונים, בהתבסס על עמידות האפקט וההפרדה מחתימות היפראלגזיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול במכרסמים, בבדיקות נוציצפטיביות (תחושת כאב) ובבידול בין תגובות כאב רפלקסיביות לתגובות רגשיות (affective) כדי להבטיח את מהימנות הנתונים.
- תלוי בכיול של מכשור תרמי (אמבט מים ב-48°C) ומכני (מעורר לחץ מדורג) עם יכולות מדידה מדויקות של זמן תגובה (latency) וכוח.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי הרגלה, נהלי הזרקה ותזמון המדידות כדי למזער שונות בין מבצעים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הניסוי למודלים של חולדות או למינים שאינם ממשפחת העכברים, עקב הבדלים במורפולוגיית הזנב וברגישות הנוציצפטיבית.
- מגבלות מעשיות כוללות אפשרות לאנלגזיה מושרית-סטרס במקרה של הרגלה לא מספקת, ואפקטי תקרה (ceiling effects) במדידות נוציצפטיביות במינוני תרופה קיצוניים.
