Name: מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: למדו ליצור רובוטים ביו-תגובתיים מ-DNA אוריגמי באמצעות הרכבה עצמית של מולקולות DNA. הפרוטוקול כולל טיהור והדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים שידור לחקר ננו-רובוטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ס דאגלס לדיונים בעלי ערך רבים ועצות, וכל החברים של המעבדה באשל לדיונים מועילים ועבודה. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהפקולטה למדעי חיים והמכון לננוטכנולוגיה והחומרים מתקדמים באוניברסיטת בר-אילן.

1. הכנת תערובת סטייפלס בריכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכות להזמין lyophilized DNA nanorobot על 96-גם צלחות כמפורט בטבלה 1 (ראה חומרים) ולנרמל עד 10 ננומול. לתיאור מפורט של העיצוב והאדריכלות של nanorobot DNA לראות אל בן-ישי ואח &#39;. 14 ודאגלס et. 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש כל מצרך היטב עם DNase / ultrapure RNase ללא בריכוז של 100 מיקרומטר. לסיכות מנורמלות 10 ננומול, מחדש עם המים ultrapure 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה יחד 20 μl של כל מצרך באמצעות pipettor רב ערוצי ואגן פתרון סטרילי 55 מיליליטר. הערה: מאחר שצורת nanorobot מורכבת של 254 גדילי מצרך (כולל Core, קצוות, ידיות ורצפי מדריכים, טבלת 1), הריכוז של כל אחד מהסיכות בבריכת הסיכות הוא 394 ננומטר. הסרת סיכות מבריכת מצרך, או להוסיף כמה בכרך שונהumes, עשויים להפחית את התשואה משמעותית, או בדרך אחרת לגרום לאגרגטים פרש. </li></ol> 2. הכנת תערובת תגובת ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתערובת תגובה סטנדרטית להשתמש 40 μl של ה- DNA הנגיפי M13mp18 הגנום מעגלי אחת גדיל, מתאים ל4 pmol של DNA פיגום (פתרון 100 מניות ננומטר, ראה חומרים). ריכוז סופי של פיגום בתערובת הייצור הוא 20 ננומטר, נפח סופי 200 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כמות ה- DNA פיגום בהתאם לצרכים ספציפיים; עם זאת, לשמור על הריכוז הסופי של ה- DNA פיגום בתערובת התגובה ב20 ננומטר קבועים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סיכות להגיע פיגום ליחס סיכות של 1 עד 10, בהתאמה. לריכוז ה- DNA 20 הפיגום ננומטר, כל אחד מהריכוז הסופי של הסיכות 254 הוא 200 ננומטר. לμl 200 סופי נפח תגובה להוסיף 102 μl של תערובת בריכת סיכות (סעיף 1.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף רצפי שער ספציפיים בנפרד התערובת תגובה מתקפלת דואר בשלב זה. oligos אלה הורה בנפרד ודורשת טיהור HPLC. ודא שoligos השער נמצא ב01:10 פיגום לשער יחס רצף, כלומר 200 ננומטר של כל אוליגו לריכוז של 20 ננומטר פיגום. לμl 200 מתקפל נפח תגובה, להוסיף 0.4 μl לכל אחת מהארבעה אוליגו השער בריכוז מניית 100 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10x חיץ מניית טה להגיע לריכוז סופי של 1X טה (40 מ&quot;מ טריס-אצטט, 1 mM EDTA). לμl 200 מתקפל נפח תגובה, להוסיף 20 μl של 10x טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 M MgCl 2 לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. לμl 200 מתקפל נפח תגובה, להוסיף 2 μl של 1 M MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 36 μl מים ultrapure החופשי DNase / RNase ליגיע נפח סופי של 200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס וaliquot 100 μl דגימות לתוך צלוחיות PCR. הערה: התייעץ עם מפרט Cycler תרמית לגבי כמויות תגובה המרביות לשימוש.הקטנת הנפח לעמוד במגבלות אלה לא תפחית את התשואות שהשיגו. כרכי תגובה מעל המרבי שצוינו יסכן את התשואות. </li></ol> רמפה חישול 3. טמפרטורה של תגובת ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cycler תרמית תכנית אחריו כמו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה 85 מעלות צלזיוס עד 60 מעלות צלזיוס בשיעור של 5 דקות / מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמפה 60 ° C ל- C ° 4 בשיעור של 75 דק &#39;/ מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק ב 4 ° C ללא הגבלת זמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייצור הסתיים דגימות חנות ב -20 ° C. </li></ol> 4. ההסרה של סטייפלס העודף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף לתערובת תגובה מתקפלת 100 μl למסנן צנטריפוגלי 0.5 מיליליטר עם MWCO של 100 kDa. להציל את מדגם 10 μl של nanorobots מראש טיהור לניתוח מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,600 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl של חיץ מתקפל (1x טה, 10 מ&quot;מ MgCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.2 ו -4.3 פעמיים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צנטריפוגה במשך 5 דקות ב9,600 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את התרכיז על ידי הצבת המסנן הפוכה בצינור microcentrifuge נקי וספין 1 דקות ב9,600 x גרם. כרכים סופיים עשויים להשתנות בהתאם לכמות הראשונית של תערובת תגובת ייצור שהוכנסה למסנן. בדרך כלל נפח סופי 25-60 μl של מדגם nanorobot המרוכז מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז של ה- DNA בדגימות באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר. השתמש במשקל מולקולרי של 5.3 מיקרוגרם / pmol בעת חישוב ריכוזים טוחנות של דגימות nanorobot. הערה: מקדם טוחנת ההכחדה לdsDNA, 50 מיקרוגרם / OD 260, מספיק עבור רוב היישומים. 48 מיקרוגרם / OD 260 לוקח בחשבון את תימין פולי ssDNA משתרע בסיכות קצוות. </li></ol> 5. Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה ניתוח של nanorobots המקופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת TBE 0.5x (45 מ&quot;מ טריס-Borate, 1 mM EDTA), 2% agarose ג&#39;ל בתוספת 10 מ&quot;מ MgCl 2 </sub&gt; (מותאם מאל ארנסטו קסטרו et 21.): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר TBE 0.5x על ידי דילול 6.25 מיליליטר של חיץ מניות 10x TBE ב118.75 מיליליטר של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 2.5 גרם של agarose ב125 מיליליטר של חיץ TBE 0.5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים במיקרוגל עד agarose הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.25 מיליליטר של 1 M MgCl 2 לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר ethidium ברומיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לפתרון למעט קריר ולמלא את מגש ג&#39;ל לפני מתמצק agarose ג&#39;ל. התקן מסרק הרצוי באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 TBE 0.5x הפעלת מאגר על ידי הוספת 50 מיליליטר של חיץ מניות 10x TBE ו -10 מיליליטר של 1 M MgCl 2-940 מיליליטר של DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ג&#39;ל הוא תוספת מוצקה הפעלת מאגר למכשיר אלקטרופורזה ומכשיר לשים באמבט קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה- DNA 1 מיקרוגרם העומס הכולל של טרום טיהור nanorobots (שלב 3.2), ולאחר טיהור (שלב 4.7), לצד פיגוםדגימת DNA וסמן ה- DNA 1 KB, על ג&#39;ל. דוגמא ניתנת באיור 2. כרכים בפועל של דגימות תלויות בריכוזים המתקבלים לאחר טיהור. כל דגימות טעונה עם חיץ טעינה של 1: יחס נפח סופי 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר מקור כוח 80 V ולהפעיל ג&#39;ל למשך 3 שעות. הפעל את הג&#39;ל באמבט מלא בקרח ומים. Nanorobots יתפתח ויופיע ככתם אם agarose ג&#39;ל מתחמם במהלך אלקטרופורזה. במהלך אלקטרופורזה להוסיף קרח נוסף כדי לשמור על מכשיר מהחימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בג&#39;ל על שולחן UV (איור 2). </li></ol> 6. כתמים שליליים של Nanorobot עם Uranyl-formate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של 2% מניות פתרון uranyl-formate (מותאמת מאל קסטרו et 23.): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל של אבקת uranyl-formate 100 מ&quot;ג לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים ultrapure החופשי הרתיחה DNase / RNase 3 דקות לדה-חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של מים חמים deoxygenated (~ 60 מעלות צלזיוס)לתוך הצינור המכיל 15 מיליליטר אבקת uranyl-formate (מהשלב קודם). מהדקת את המכסה, לעטוף בנייר אלומיניום ומערבולת בקפדנות במשך 10 דקות (צינור להדק מערבולת). פתרון צריך להופיע עכור עם צבע צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון סינון באמצעות ניטור ארוך טווח אלחוטי מזרק 0.2 מיקרומטר. פתרון צריך להיות ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 200 μl של הפתרון לתוך צינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות מקסימלית של 5 דקות בצנטריפוגה בראש הטבלה לדגימות בריכה בחלק התחתון של הצינור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינה של מדגם לרשת ומכתים שלילי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot 200 μl של 2% פתרון uranyl-formate (מוכן בסעיף 6.1). הוסף 10 μl של 0.5 פתרון M NaOH ומערבולת בקפדנות במשך 3 דקות. צנטריפוגה במהירות מקסימלית במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות בראש הטבלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, רשת זוהר פריקה באמצעות אוויר חדר בmbar 0.2 ו -25 mA למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של 2 מדגם nanorobot ננומטר לאחר טיהור (sectiעל 4.7) על גבי רשת של למעלה (שנערך עם מלקחיים) ולתת לספוג דקות 1. השתמש בנייר אקולוגי ארוך טווח אלחוטי לניקוז הנוזל העודף על ידי הצבת הרשת על גבי נייר הסינון. אל תיגע במשטח הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2% uranyl-formate (משלב 6.2.1) על גבי רשת של למעלה (שנערך עם מלקחיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להשתמש בנייר אקולוגי ארוך טווח אלחוטי לניקוז הנוזל העודף על ידי הצבת הרשת על גבי נייר הסינון. אל תיגע במשטח הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6.2.4 ו6.2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 2% uranyl-formate (משלב 6.2.1) על גבי רשת של למעלה (שנערך עם מלקחיים). בואו פתרון מכתים לספוג למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר אקולוגי ארוך טווח אלחוטי לניקוז הנוזל העודף על ידי הצבת הרשת על גבי נייר הסינון. אל תיגע במשטח הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הרשת להתייבש לחלוטין לפחות 30 דקות, עם פנים כלפי מעלה על נייר סינון, לפני הזרקה לתוך TEM. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetical+implications+of+the+structure+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 171, 964-967 (1953).</li>
<li>Kosuri, S., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+de+novo.+DNA+synthesis%3A+technologies+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications.</a> Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).</li>
<li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).</li>
<li>Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+junctions+and+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid junctions and lattices.</a> J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).</li>
<li>Chen, J. H., Seeman, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+from+DNA+of+a+molecule+with+the+connectivity+of+a+cube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube.</a> Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).</li>
<li>Wei, B., Dai, M., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+shapes+self-assembled+from+single-stranded+DNA+tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles.</a> Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+DNA+into+symmetric+supramolecular+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra.</a> Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).</li>
<li>Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+DNA+tube+circumferences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programming DNA tube circumferences.</a> Science. 321 (5890), 824-826 (2008).</li>
<li>Rothemund, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li>
<li>Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+into+twisted+and+curved+nanoscale+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes.</a> Science. 325 (5941), 725-730 (2009).</li>
<li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+DNA+into+nanoscale+three-dimensional+shapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes.</a> Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+DNA+nanotechnology%3A+state+of+the+art+and+future+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective.</a> J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).</li>
<li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li>
<li>Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+bio-responsive+robot+from+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Designing a bio-responsive robot from DNA origami.</a> J Vis Exp. (77), e50268(2013).</li>
<li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li>
<li>Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+from+cell-based+selection+for+bioanalytical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications.</a> Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).</li>
<li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamer-Guided+Cancer+Therapeutics+and+Diagnostics%3A+The+Next+Generation+of+Cancer+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine.</a> Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).</li>
<li>Zhang, D. Y., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+nanotechnology+using+strand-displacement+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions.</a> Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).</li>
<li>Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+aptamers+for+recognition+of+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Generating aptamers for recognition of virus-infected cells.</a> Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).</li>
<li>Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+DNA+aptamers+using+Cell-SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Prot%22%5BJournal%5D)">Development of DNA aptamers using Cell-SELEX.</a> Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).</li>
<li>McKeague, M., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+for+Small+Molecule+Aptamer+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development.</a> J Nucleic Acids. 2012, (2012).</li>
<li>Amir, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+computing+by+DNA+origami+robots+in+a+living+animal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Universal computing by DNA origami robots in a living animal.</a> Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).</li>
<li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+scaffolded+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).</li>
<li>Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+folding+of+DNA+into+nanoscale+shapes+at+constant+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature.</a> Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).</li>
<li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li>
<li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li>
<li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

תארנו את הייצור, טיהור, ויזואליזציה של nanorobot DNA. בעקבות ייצור של מארז המשושה של המכשיר, הפונקציה של nanorobot מתוכנת עם ההקדמה הפשוטה של מטען ספציפי וגדילי חישה לרובוט שבקלות למצוא את המיקום המיועד שלהם עקב השלמת מימן מליטה עם אתרי עגינה אחת הגדיל זמין 14 , 15,22. פרוטוקול הייצור המתואר משתמש רמפת חישול איטית, המשמשת בדרך כלל במעבדה שלנו לקפל מגוון רחב של צורות אוריגמי. אם זמן ייצור הופך מפתח פרוט...

השימושים לננוטכנולוגיה חומצות גרעין הם מדהימים. נְהִילוּת של זיווג הבסיס ווטסון-קריק, כמו גם את הקלות והבעלות נמוכה היחסית של סינתזה בקנה מידה גדולה של oligos מחוייט 2 ניב פרץ של יישומים 3 ומחקר בתחום הננו-טכנולוגיה ה- DNA. המבנית DNA ננוטכנולוגיה, המבוססת על 4,5 צומת Seeman הנייחת כאבן בניין בסיסית עושה שימוש בדנ&quot;א כיחידה יסודי הרכבה עצמית לבניית צורות שרירותיות 6-8. הפיתוח האחרון של טכניקת אוריגמי 9 DNA הפיגומים מאפשר לבניית ננו-ארכיטקטורות 2D / 3D המורכבות 10-12 עם דיוק תת-ננומטר והוא מסלול יעיל לבניית אובייקטים פונקציונליים חדשים עם מורכבות גוברים וגיוון מדהים. תהליך הבנייה מבוסס על ה- DNA חד גדילי פיגום ארוך, בדרך כלל נגזר מgenom נגיפידואר, אשר יכול להיות מקופל באמצעות ההכלאה של מאות oligos DNA הגדיל הבודד הקצר כינה סיכות. הרזולוציה הגבוהה המבנית מתקבלת על ידי טכניקה זו היא התוצאה הישירה של הממדים הטבעיים של סליל הדנ&quot;א הכפול, תוך שחזור של ייצור הוא התוצאה של התאמת רצפי מצרך יחיד גדיל הקצר כדי להקל על השלמת מימן מליטה המרבית השגה. עם השימוש של חישול בטמפרטורה איטי רמפה הנמוכה ביותר באנרגיה המיועדת, thermodynamically ננו-המבנה העדיף הוא הגיע בתשואות ונאמנות גבוהות. היישום קל של כללי עיצוב צומת בקוד מחשב אפשר הפיתוח של כלים CAD, כגון 13 caDNAno, שמאוד לפשט את המשימה של תכנון מבנים גדולים, מורכבים המכילים מאות צמתים מחוברות. בעבר תאר את העיצוב של nanorobot DNA בעזרת כלי 14,15 caDNAno. כאן אנו מציגים את הייצור והדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), של nanorobot, nanodevice משושה החלול 3D, עם ממדים של 35 x 35 x 50 3 ננומטר, שנועדו לעבור שינוי קונפורמציה גדול בתגובה לגירויים שנקבעו מראש ומטען ספציפי נוכחי, כגון חלבונים או oligos חומצות גרעין, מוחרם בפנים. בעוד 12 תחנות טעינה זמינות בתוך המארז החלול, המספר האמיתי של מטען קשור שונה עם גודל מטען. מולקולות מטען נעות בין מולקולות DNA קטנות לאנזימים, נוגדנים ו5-10 חלקיקי זהב ננומטר. Cargocan או להיות אחיד או הטרוגנית, כך שכל nanorobot מכיל תערובת של מולקולות שונות. חישה מושגת באמצעות שני עיצוב שערי נעילת סליל כפול לחוש חלבונים, חומצות גרעין או כימיקלים אחרים, המבוססת גם על aptasensor עקירת 16,17 או גדיל DNA 18 טכנולוגיות. ההתפתחויות אחרונות בפרוטוקולי בחירת aptamer 19-21 לאפשר העיצוב של nanorobots להגיבלמגוון הולך וגדל של מולקולות ותאים מסוגים. העבודה קודמת הראתה nanorobot נושא נוגדנים ספציפיים, אשר על הכריכה לאנטיגן שלה יכולה להעביר גם אות פורה לחלק הפנימי של סוגי תאים מסוימים באוכלוסיית תאים מעורבת 15 מעכבת או. תכונה מרגשת של ננו-התקנים אלה היא היכולת שלהם לבצע אפילו יותר משימות מורכבות ושליטה היגיון עם ההקדמה של תת nanorobot שונה באוכלוסייה אחת. לאחרונה הפגינו תת-סוגים ספציפיים של nanorobots ביצוע כמו גם רגולטורים חיוביים או שליליים, השליטה אוכלוסיית מפעיל המכילה מולקולת מטען פעילה 22. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את הייצור, טיהור והדמיה של nanorobot מגודר עם רצפי חיישן aptamer המחייבים באופן סלקטיבי לPDGF כדי להקל על פתיחת nanorobot 15,22. תהליך הייצור המתואר דומה לnתהליך ייצור anorobot תחילה מתואר על ידי דאגלס et al. 15 עם שינויים שמטרתה צמצום משך תהליך כולל, תוך הגדלת שיעורי התשואה וטיהור.

<table><tbody><tr><td>מים מזוקקים ללא DNase/RNase</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 ssDNA פיגום</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Gibco</td><td>15558-042</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 מ"ל מסנן צנטריפוגלי 100K MWCO</td><td>Amicon</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>TBE buffer</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד 10&nbsp; תמיסת מ"ג / מ"ל</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>1 kb סמן DNA</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>טוען צבע</td><td>NEB</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>אורניל פורמט</td><td>polysciences</td><td>24762</td><td></td></tr><tr><td>רשתות TEM מצופות פחמן&nbsp;</td><td>שירותי מדע</td><td>EFCF400-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler c1000 Touch</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow Discharge K100X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV table Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI-G12</td><td>Tecnai</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- dna אוריגמי

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nanorobot DNA הוא מכשיר חלול משושה ננומטריים, שנועד לפתוח בתגובה לגירויים ספציפיים ובהווה מטען מוחרם בפנים. ניתן להתאים גירויים ומטען שני בהתאם לצרכים ספציפיים. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ייצור nanorobot DNA, עם השימוש בטכניקת אוריגמי DNA. ההליך יוזם על ידי ערבוב סיכות DNA חד-גדיל קצרים לתערובת מניות אשר לאחר מכן הוסיפה לפיגום ארוך, עגול, אחד גדיל DNA בנוכחותו של חיץ מתקפל. Cycler תרמו סטנדרטי מתוכנת להוריד את טמפרטורת תגובת ערבוב בהדרגה כדי להקל על חישול סיכות ל- פיגום, שהוא הכוח המנחה מאחורי הקיפול של nanorobot. ברגע שהתגובה מתקפל 60 שעות שלמה, סיכות עודפות מבוטלים באמצעות מסנן צנטריפוגלי, ואחריו להדמיה באמצעות אלקטרופורזה agarose-ג&#39;ל (גיל). לבסוף, ייצור מוצלח של nanorobot מאומת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM),עם השימוש בuranyl-formate ככתם שלילי.

נציגי תוצאות מוצגות באיור 2 א. כל הנתיבים מכילים 1 מיקרוגרם של ה- DNA הכולל, נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר (OD 260). בהשוואה לפיגום DNA חד-גדיל העגול (ליין 2), nanorobots הם הפריעו בג&#39;ל בשל המשקל המולקולרי גבוה יותר שלהם, התוצאה של הכלאת סיכות ל- DNA הפיגום (ליין 3. חץ אדום). להקת המשקל המולקולרית הנמוכה בליין 3 מייצגת סיכות עודפות שלא להיקשר ל- DNA הפיגום (חץ ירוק). לאחר טיהור באמצעות סינון צנטריפוגלי ביותר של הסיכות העודפות יוסרו (Lanes 4-6) וnanorob...

אוריגמי DNA היא שיטה רבת עוצמה לייצור אובייקטים ננומטריים מדויקים על ידי תכנות ההרכבה העצמית של מולקולות DNA. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקיפול של רובוט מגיב ביולוגית מאוריגמי DNA, טיהורו וצביעתו השלילית להעברת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

folding-characterization-bio-responsive-robot-from-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מתארים פרטים ניסיוניים של הסינתזה של חלקיקים בדוגמת וreconfigurable משני מבשרים ממדיים (2D). מתודולוגיה זו יכולה לשמש ליצירת חלקיקים במגוון צורות, כולל פאונים ומכשירים נאחזו בסולמות אורך נעים בין מייקרו לקנה מידה של סנטימטר.

אוריגמי השראה עצמית הרכבה של חלקיקים בדוגמת וReconfigurable

אוריגמי DNA הוא שיטה רב עוצמה לבודת עצמים ננומטריים מדויקים על ידי תכנות ההרכבה העצמית של מולקולות DNA. כאן, אנו מתארים איך יכול להיות מנוצלים-DNA אוריגמי לעצב רובוט רובוטי מסוגלים לחוש סימנים ביולוגיים ולהגיב בצורת הסטה, לאחר מכן הועברה לאפקט רצוי.

עיצוב רובוט ביו תגובה מ-DNA אוריגמי

ריצוף DNA היא גישה יעילה ליצירת ננו-מבנים ניתנים לתכנות. אנו מתארים את הפרוטוקולים לבניית צורות דו-ממדיות מורכבות על ידי הרכבה עצמית של אריחי DNA חד-גדיליים.

עצמי הרכבה של צורות דו-ממדיות מורכבות מחד-גדילי דנ&quot;א אריחים

מתוארים תהליכי ניקוי הניתנים לשחזור עבור מצעים המשמשים במחקר אוריגמי DNA, כולל ניקוי RCA על ספסל ונגזרת של תחמוצת סיליקון. מומחשים פרוטוקולים להכנת פני השטח, שקיעת אוריגמי DNA, פרמטרי ייבוש ומערכים ניסיוניים פשוטים.

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח עבור מתלה reconfigurable של אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות.

עיצוב, סינתזה של ארון אקורדיון דנ א Reconfigurable

כאן מוצג פרוטוקול להגנה על ה-DNA nanostructures אוריגמי בתקשורת מדולדל מ"ג ו נוקלאז עשיר באמצעות רב-סוכר cationic טבעי משקם, ציפויים סינטטיים ליניארי polyethyleneimine (LPEI).

ריפוי גנטי בהשראת Polycation ציפוי הגנה על ה-DNA אוריגמי Nanostructures

אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור DNA מבוסס-אוריגמי הרכבה של nanorods זהב לתוך כיראלי metamolecules plasmonic עם chiroptical חזקה תגובות. הפרוטוקול אינה מוגבלת תצורות כיראלי ולא ניתן להתאים בקלות על הזיוף של ארכיטקטורות שונות plasmonic.

הרכבה של Nanorods זהב לתוך כיראלי Metamolecules Plasmonic באמצעות תבניות אוריגמי דנ א

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצור ננו מבנים אורגניים בדידים ומדויקים על מצעים באמצעות צורות DNA אוריגמי כמו תבניות המנחה. השיטה מוכחת על ידי יצירת אנטנות זהב בצורת עניבת הפלסטיק על מצע שקוף (ספיר).

DNA אוריגמי-תיווך המצע Nanopatterning של מבנים אורגניים עבור יישומים חישה

המטרה של פרוטוקול זה היא טופס הרכבים של מנועים מולקולריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים ולהתבונן ההרכב לתנועתיות באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ קרינה.

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

למדו ליצור רובוטים ביו-תגובתיים מ-DNA אוריגמי באמצעות הרכבה עצמית של מולקולות DNA. הפרוטוקול כולל טיהור והדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים שידור לחקר ננו-רובוטיקה.

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

גלה סרטונים נוספים